CN108715906A

CN108715906A - 五种猪肠道病毒多重rt-pcr快速检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN108715906A
Application number: CN201810563505.7A
Authority: CN
Inventors: 欧阳康; 钟莲; 黄伟坚; 王若木; 陆颖; 吴雨殊; 刘雪婷
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2018-06-04
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2018-10-30

Abstract

本发明公开了五种猪肠道病毒多重RT‑PCR快速检测引物组，包括五对PCR引物，它们分别针对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.10的碱基序列。据此，发明人还研制了对应的快速检测试剂盒。应用本发明可在同一反应管内同时检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒的单个或混合感染，具有特异性高，敏感性好，耗时短且成本低的特点。本发明为猪群混合感染的检测提供了快速简便的工具，为临床快速鉴别检测及实验室流行病学调查奠定坚实的基础，有利于养猪业及时制定治疗方案，减少猪群死亡率和经济损失。

Description

五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于猪肠道病毒核酸检测技术领域，尤其涉及五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒及其应用。

背景技术

近年来，随着养猪业向集约化、规模化方向发展，猪群发生多种病原混合感染的情况愈加普遍。猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)是哺乳仔猪病毒性肠道疾病的主要病原体，由于其病理变化在临床症状及流行病学上的相似性，难以区分这些疾病。同时，根据发明人对猪嵴病毒(PKV)的监测发现，其在PEDV阳性猪中检测率极高，并推测其不止与猪肠道疾病有关，还可能与PEDV发生协同致病作用。上述疾病在猪群的混合感染不仅会给实验室诊断和临床治疗带来巨大的挑战，也将给养猪业造成重大的经济损失。

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种猪的急性肠道传染病，临床主要表现为水样腹泻和严重脱水，对哺乳期仔猪的发病率高达80～100％，是导致仔猪早期死亡的主要疫病之一。该病在1976年首次报道于英国，2010年在中国、泰国等亚洲国家爆发了疫情，2013年在美国出现大规模的流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。

猪传染性胃肠炎(Porcine transmissible gastroenteritis，TGE)是猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)导致猪的一种急性、高度接触性胃肠道传染病。TGEV与PEDV同属冠状病毒科、冠状病毒属成员，其导致的主要临床症状与PEDV极为相似，并且都以仔猪的高发病率和死亡率为特征。因其在世界范围造成的危害严重，世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类疾病中必检的猪传染病。

猪Delta冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一种能够引起仔猪急性水样腹泻的新发冠状病毒。2012年在中国香港首次从猪粪便样品中检测并分离出PDCoV。2014年2月，俄亥俄州和印第安纳州首次发现了PDCoV，迅速传播到美国和加拿大的其他州，并在猪业中造成重大经济损失。2015年3月，中国江西省发现PEDV阴性的腹泻样本中PDCoV发病率高达58.33％。临床报道表明，PDCoV可引起仔猪严重腹泻，呕吐和脱水，与PEDV、TGEV所致的症状无明显区别。

轮状病毒(Rotavirus，RV)是呼肠孤病毒科轮状病毒属的成员，是人和各种幼龄脊椎动物病毒性腹泻的常见病原。猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PRoV)对幼龄仔猪最易感，1～4周龄仔猪发病率超过80％，死亡率达7％～20％，与PEDV、TGEV所致的临床症状无明显区别，主要表现为严重腹泻、呕吐、脱水、消瘦、生长缓慢等。

猪嵴病毒(Porcine kobuvirus，PKV)属于小RNA病毒科，引起的症状以腹泻为特征。研究学者针对来自中国24省236份病料进行PKV检测发现阳性率为42.85％，病毒分布几乎覆盖整个中国大陆。有证据表明PKV在腹泻病例的检出率较高，推断其对猪胃肠炎有协同致病作用。而根据发明人对猪嵴病毒(PKV)的监测发现，其在PEDV阳性猪中检测率极高，故推测其不止与猪肠道疾病有关，还可能与PEDV发生协同致病作用。

上述PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种病毒均为单股正链RNA病毒，基因组含PolyA结构，均能造成仔猪不同程度的肠道腹泻、脱水、呕吐、消瘦等症状。PEDV、TGEV、PDCoV均为冠状病毒，与PRoV是哺乳仔猪病毒性肠道疾病的主要病原体，其暴发给当前养猪业带来巨大的经济损失。研究表明，这些肠道病毒往往呈现混合感染的趋势，若未能明确其病因则难以对症下药，采取正确的免疫措施。

研究表明多种病毒混合感染引起猪的腹泻疫病，严重危害猪的生产工作，而且根据临床症状和流行病学较难区分，必须依靠实验室检测技术进行鉴别诊断。其中电镜观察、病毒分离、免疫组织化学和荧光抗体技术等常用诊断技术操作复杂，难度较大；ELISA病原快速检测试剂盒和常规RT-PCR方法的应用比较广泛，但血清学方法准确率较低，常用的单一PCR方法耗时长。因此，有必要建立能同时检测多种病毒的快速的早期诊断方法，以便尽快采取有效的防控措施，减少这些疾病对养猪业造成的危害。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供快速简便、准确特异的五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒及其应用，该试剂盒可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV和PKV等五种猪肠道病毒，适用于临床及科研中对五种猪肠道病毒的快速检测及流行病学调查。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测引物组，包括五对PCR引物，它们分别针对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.10的碱基序列。

五对PCR引物分别为：

PEDV-F：TGTTATACTTTGGCTTTTCGT，

PEDV-R：CATAGAAAGCCCAACCAGT；

TGEV-F：GACGGCGACCAGATAGAAGT，

TGEV-R：CGTATAGGATTGCTTGTACC；

PDCoV-F：TTGGCGACTGGCTGCGTTAC，

PDCoV-R：GCAATACCTCGGCTGATT；

PRoV-F：AAGGATGCTAGGGATAAAATTG，

PRoV-R：TTCAGATTGTCGAGCTATTCCA；

PKV-F：GCTGCTTGGTGGACTCATT，

PKV-R：GAGGGTGGCATCAAAACACT。

上述引物组在制备五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒中的应用。

五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒，主要由PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品和引物组成，引物包括五对PCR引物，它们分别针对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.10的碱基序列。

PCR标准品包括PEDV标准品、TGEV标准品、PDCoV标准品、PRoV标准品和PKV标准品；阳性对照品是含PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种病毒的阳性质粒混合物；阴性对照品是灭菌后的去离子水。

质粒混合物的浓度为7.56×10⁹copies/μL。

五对PCR引物中的所有上游引物同管包装，所有下游引物同管包装。

上述试剂盒用于五种猪肠道病毒的非诊断目的特异性检测。

针对五种猪肠道病毒存在交叉感染、混合感染且难以区分的问题，发明人运用多重RT-PCR技术，针对性地设计了相应的特异性引物，共同构成了五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测引物组，包括五对PCR引物，它们分别针对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.10的碱基序列；五对PCR引物。据此，发明人还研制了对应的快速检测试剂盒。应用本发明可在同一反应管内同时检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒的单个或混合感染，具有特异性高，敏感性好，耗时短且成本低的特点。本发明为猪群混合感染的检测提供了快速简便的工具，为临床快速鉴别检测及实验室流行病学调查奠定坚实的基础，有利于养猪业及时制定治疗方案，减少猪群死亡率和经济损失。

附图说明

图1是本发明五种猪肠道病毒对应引物的特异性检测电泳图，图中泳道从左至右依次为：M：DL2000DNA Marker；1：PEDV；2：TGEV；3：PDCoV；4：PRoV；5：PKV；6：PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV及PKV；7：PEDV、PDCoV、PRoV及PKV；8：TGEV、PDCoV、PRoV及PKV；9：阴性对照。

图2是本发明五种猪肠道病毒对应引物的特异性检测电泳图，图中泳道从左至右依次为：M：DL2000DNA Marker；1：PDCoV及PKV；2：TGEV及PRoV；3：PEDV及PDCoV；4：PEDV及PKV；5：PEDV、TGEV及PKV；6：PDCoV、PRoV及PKV；7：PEDV、PDCoV及PKV；8：非靶标模板；9：阴性对照。

图3是本发明对五种猪肠道病毒的敏感性检测电泳图，图中泳道从左至右依次为：M：DL2000 DNA Marker；1：7.56×10⁷；2：7.56×10⁶；3：7.56×10⁵；4：7.56×10⁴；5：7.56×10³；6：7.56×10²；7：7.56×10¹；8：7.56×10⁰copies/μL阳性质粒混合物；9：阴性对照。

具体实施方式

实施例1、本发明试剂盒组装和使用

为方便使用，将本发明所用试剂组装成五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒，主要由PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品、引物以及盒体组成。盒体中设有相应的容器孔，用于分别放置各试剂。

引物包括五对PCR引物(表1，由上海杰李生物技术有限公司合成引物，合成量为每管引物1OD)，它们分别针对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.10的碱基序列。五对PCR引物中的所有上游引物同管包装，所有下游引物同管包装。

表1、本发明中所设计的多重PCR引物

PCR标准品包括PEDV标准品、TGEV标准品、PDCoV标准品、PRoV标准品和PKV标准品；阳性对照品是含PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种病毒的阳性质粒混合物(浓度约为7.56×10⁹copies/μL)；阴性对照品是灭菌后的去离子水(超纯水)。

其中，五种病毒标准品的序列为序列表SEQ.ID.NO.11至SEQ.ID.NO.15的碱基序列。

试剂盒的各试剂均保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

试剂盒使用方法

每次检测根据具体情况设立阴性对照和阳性对照；阳性对照用无菌超纯水稀释为10²～10³copies/μL。

RNA病毒样品提取：根据产品使用说明书，用病毒RNA抽提试剂盒AxyPrep BodyFluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(Axygen)从细胞株、新鲜或冷冻的样品中提取病毒核酸。

反转录反应：在高压灭菌的0.2mL PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA模板8μL，5×Reversa Transcriptase M-MLV Buffer(TaKaRa)2.5μL，dNTP Mixture(TaKaRa)1μL，Oligo dT Mix(Oligo dT和PRoV-R混合物)0.5μL，Reversa Transcriptase M-MLV(TaKaRa)0.25μL，Ribolock RNase Inhibitor(Vazyme)0.25μL，总体积为12.5μL，反应条件为42℃反应1h，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA模板。

核酸的检测：取3μL已制备的cDNA模板进行多重PCR反应，其中Green Taq Mix(Vazyme)12.5μL，上游引物混合物0.5μL，下游引物混合物0.5μL，ddH₂O 8.5μL，总体积为25μL；反应程序为先94℃预变性5min，34个循环的反应条件为94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸50s，最后72℃延伸10min；PCR产物用2％的琼脂凝胶电泳进行检测，经凝胶成像仪成像后分析。

结果报告：在阴性对照与阳性对照成立的条件下，根据PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV和PKV扩增基因片段的有无，对是否有这五种猪肠道病毒进行鉴定。

实施例2、本发明检测五种病毒的特异性实验

按照多重PCR反应体系，Green Taq Mix(Vazyme)12.5μL，上游引物混合物0.5μL，下游引物混合物0.5μL，ddH₂O 8.5μL，分别加入3μL阳性样品cDNA模板1：PEDV；2：TGEV；3：PDCoV；4：PRoV；5：PKV；6：PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV及PKV；7：PEDV、PDCoV、PRoV及PKV；8：TGEV、PDCoV、PRoV及PKV；9：PDCoV及PKV；10：TGEV及PRoV；11：PEDV及PDCoV；12：PEDV及PKV；13：PEDV、TGEV及PKV；14：PDCoV、PRoV及PKV；15：PEDV、PDCoV及PKV；16：非靶向模板；17：超纯水阴性对照。反应在life ProFlex PCR扩增仪进行，反应程序为：先94℃预变性5min，34个循环的反应条件为94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸50s，最后72℃延伸10min。取10μLPCR产物，点样于2％的琼脂凝胶电泳板孔中，150V电压，电泳约20min，于凝胶成像仪紫外成像后拍照判定，结果参见图1和图2，对应PCR产物大小与表1中PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV和PKV分别为795bp、612bp、383bp、309bp和160bp完全一致，表明本发明构建的猪肠道病毒多重RT-PCR检测试剂盒特异性好。

实施例3、本发明检测五种病毒的敏感性实验

多重PCR敏感性检测反应体系：Green Taq Mix(Vazyme)12.5μL，上游引物混合物0.5μL，下游引物混合物0.5μL，ddH₂O 8.5μL，分别加入3μL 10倍系列稀释的PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV和PKV阳性质粒混合物(7.56×10⁷～7.56×10⁰copies/μL)模板。反应在lifeProFlex PCR扩增仪进行，反应程序为：先94℃预变性5min，34个循环的反应条件为94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸50s，最后72℃延伸10min。取10μL PCR产物，2％琼脂凝胶电泳检测。

常规单重PCR敏感性检测反应体系：Green Taq Mix(Vazyme)12.5μL，上游引物混合物0.5μL，下游引物混合物0.5μL，ddH₂O 8.5μL，分别加入3μL 10倍系列稀释的PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV和PKV阳性质粒标准品(10⁷～10⁰copies/μL)模板。反应在life ProFlexPCR扩增仪进行，反应程序为：先94℃预变性5min，34个循环的反应条件为94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸50s，最后72℃延伸10min。取10μL PCR产物，2％琼脂凝胶电泳检测。

实验结果表明，多重PCR反应对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV和PKV五种病毒的最低检出量为22.68copies，结果参见图3。而单重PCR反应PEDV的最低检出量为19.44copies、TGEV为1.79×10²copies、PDCoV为4.83×10²copies、PRoV为1.26×10²copies和PKV为20.7copies。可见，本发明多重RT-PCR检测五种猪肠道病毒的灵敏度高于单重RT-PCR约10～20倍。

实施例4、本发明检测五种猪肠道病毒的临床实例

将本发明所设计的五种病毒特异性引物序列(见表1)和五种病毒参考检测引物(表2，由上海杰李生物技术有限公司合成引物，合成量为每管引物1OD)进行对比试验。

表2、五种病毒试验参考检测引物

第一步：样本采集

广西南宁、贵港、崇左、百色、玉林、钦州、河池、北海地区采集样品107份，其中粪便20份，肠内容物87份；广东地区采集肠内容物5份；样品总数为112份。

第二步：总RNA小量抽提

根据产品使用说明书，用病毒RNA抽提试剂盒AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(Axygen)从新鲜或冷冻的样品中提取病毒核酸。

第三步：反转录合成cDNA

在高压灭菌的0.2mL PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA模板8μL，5×Reversa Transcriptase M-MLV Buffer(TaKaRa)2.5μL，dNTP Mixture(TaKaRa)1μL，OligodT Mix(Oligo dT和PRoV-R混合物)0.5μL，Reversa Transcriptase M-MLV(TaKaRa)0.25μL，Ribolock RNase Inhibitor(Vazyme)0.25μL，总体积为12.5μL，反应条件为42℃反应1h，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA模板。

第四步：本发明多重PCR检测和试验参考PCR检测

1、本发明多重PCR检测体系如下：取3μL已制备的cDNA模板进行多重PCR反应，其中Green Taq Mix(Vazyme)12.5μL，上游引物混合物0.5μL，下游引物混合物0.5μL，ddH₂O 8.5μL，总体积为25μL；反应程序为先94℃预变性5min，34个循环的反应条件为94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸50s，最后72℃延伸10min；PCR产物用2％的琼脂凝胶电泳进行检测，经凝胶成像仪成像后分析。

2、试验参考多重PCR检测PEDV、TGEV、PRoV体系如下：取3μL已制备的cDNA模板进行多重PCR反应，其中Green Taq Mix(Vazyme)12.5μL，上游引物PEDV-F1、TGEV-F1、PRoV-F1各0.5μL，下游引物PEDV-R1、TGEV-R1、PRoV-R1各0.5μL，ddH₂O 6.5μL，总体积为25μL；反应程序为先94℃预变性5min，34个循环的反应条件为94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸50s，最后72℃延伸10min；PCR产物用2％的琼脂凝胶电泳进行检测，经凝胶成像仪成像后分析。

3、试验参考单一PCR分别检测PDCoV、PKV体系如下：取3μL已制备的cDNA模板进行多重PCR反应，其中Green Taq Mix(Vazyme)12.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，ddH₂O8.5μL，总体积为25μL；反应程序为先94℃预变性5min，34个循环的反应条件为94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸50s，最后72℃延伸10min；PCR产物用2％的琼脂凝胶电泳进行检测，经凝胶成像仪成像后分析。

第五步：检测结果

本发明检测出PEDV 63份，试验参考PCR检出91份；本发明检出TGEV 27份，试验参考PCR检出6份；本发明检出PDCoV 9份，试验参考PCR检出0份；本发明检出PRoV 48份，试验参考PCR检出4份；本发明检出PKV 75份，试验参考PCR检出31份；其中，本发明检出PEDV、TGEV、PRoV、PKV混合感染7份，试验参考PCR检出0份；本发明检出PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV混合感染1份，试验参考PCR检出0份；本发明检出TGEV、PDCoV、PRoV、PKV混合感染1份，试验参考PCR检出0份；本发明检出PEDV、PDCoV、PRoV混合感染1份，试验参考PCR检出0份；本发明检出PEDV、PRoV、PKV混合感染24份，试验参考PCR检出0份；本发明检出PEDV、TGEV、PRoV混合感染8份，试验参考PCR检出0份；本发明检出PEDV、PKV混合感染48份，试验参考PCR检出22份等。

综上，本发明检测整体结果明显好于试验参考引物，一次性同时可以检出多种混合感染病毒，减少反转录和PCR次数，大大节约时间和试剂耗材成本，提高工作效率。其中TGEV、PDCoV、PRoV和PKV引物呈现良好的特异性和敏感性，而PEDV引物敏感性略低，但并不影响整体检测结果。因此，本发明的引物具有良好的特异性和敏感性，并且在附图中可根据条带大小进行特异性区分。

研究过程中还发现，反转录引物使用Oligo dT Mix (Oligo dT和PRoV-R混合物)检测结果的敏感性优于使用Oligo dT。

序列表

<110> 广西大学

<120> 五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒及其应用

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgttatactt tggcttttcg t 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catagaaagc ccaaccagt 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacggcgacc agatagaagt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtataggat tgcttgtacc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttggcgactg gctgcgttac 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaatacctc ggctgatt 18

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaggatgcta gggataaaat tg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcagattgt cgagctattc ca 22

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctgcttggt ggactcatt 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagggtggca tcaaaacact 20

<210> 11

<211> 795

<212> DNA

<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)

<400> 11

tgttatactt tggcttttcg tactcttttt tctgcttatt ataagcatta ctttcgtcca 60

attggttaat ctgtgtttca cttgtcaccg gttgtgtaat agcgcagttt acacacctat 120

agggcgcttg tatagagttt ataagtctta catgcgaatt gaccccctcc ccagtactgt 180

tattgacata taaacgaaat atgtctaacg gttttattcc cgttgatgag gtgattgaac 240

accttaaaaa ctggaatttc acatggaata tcatactgac gatactactt gtagtgcttc 300

agtatggcca ttacaagtac tctgtgttct tgtatggtgt caagatggct attctatgga 360

tactttggcc tcttgtgttg gcactgtcac tttttgatgc atgggctagc ttccaggtca 420

actgggtctt tttcgctttc agcatcctta tggcttgcat cactcttatg ctgtgggtaa 480

tgtattttgt caatagcatt cggttgtggc gcaggacaca ttcttggtgg tctttcaatc 540

ctgaaactga cgcgcttctc actacttctg tgatgggccg acaggtctgc attccagtgc 600

ttggagcacc aactggtgta acgctaacac tccttagtgg tacattgctt gtagagggct 660

ataaggttgc tactggcgta caggtaagtc aattgcctga tttcgtcaca gtcgccaagg 720

ccactacaac aattgtctat ggacgtgttg gtcgttcagt caatgcttca tctggcactg 780

gttgggcttt ctatg 795

<210> 12

<211> 612

<212> DNA

<213> 猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus)

<400> 12

gacggcgacc agatagaagt cacgttcaca cacaaatacc acttgccaaa ggatgatcct 60

aaaactgaac aattccttca gcagattaat gcctatgctc gcccatcaga agtggcaaaa 120

gaacagagaa aaagaaaatc tcgttctaaa tctgcagaaa ggtcagagca agaggtggta 180

cctgatgcat taatagaaaa ttacacagat gtgtttgatg acacacaggt tgagatgatt 240

gatgaggtaa cgaactaaac gagatgctcg tcctcctcca tgctgtattt attacagttt 300

taaccttact actaattggt agactccaat tattagaaag attattactt aatcactctt 360

tcaatcttaa aactgttgat gattttaata tcttatatag gagtttagca gaaaccagat 420

tactaaaagt ggtgcttcga ttaatctttc tagtcttact aggattttgc tgctatagat 480

tgttagtcat attaatgtaa ggcaacccga tgtctaaaac tggtttttcc gaggaattac 540

tggtcatcgc gctgtctact cttgtacaga atggtaagca cgtgtaatag gaggtacaag 600

caatcctata cg 612

<210> 13

<211> 383

<212> DNA

<213> 猪Delta冠状病毒(Porcine deltacoronavirus)

<400> 13

ttggcgactg gctgcgttac accagacaaa agccaggtgg cactccgatt cctccatcct 60

atgcctttta ttatactggc acaggtccca gaggaaatct taagtatggt gaactccctc 120

ctaatgatac cccagcaacc actcgtgtta cttgggttaa gggttcggga gctgacactg 180

ctattaaacc tcatgttgcc aaacgcaacc ccaacaatcc taaacatcag ctgctacctc 240

tccgattccc aaccggagat ggcccagctc aaggtttcag agttgacccc ttcaacgcta 300

gaggaagacc tcaggagcgt ggaagtggcc caagatctca atctgttaac tccagaggca 360

caggcaatca gccgaggtat tgc 383

<210> 14

<211> 309

<212> DNA

<213> 猪轮状病毒(Porcine rotavirus)

<400> 14

aaggatgcta gggataaaat tgttgaaggt acattatact caaatataag tgatttaatt 60

cagcaattta atcaaatgat agttactatg aatggaaatg attttcagac aggaggaata 120

ggaaatttgc caatcaggaa ttggaatttt gatttcggat tacttggtac tactttactt 180

aacatagatg caaattatgt tgaaaacgct agaactacca ttgaatattt cattgatttt 240

atagataatg tgtgtatgga tgaaatggct agagaatcgc aacgaaatgg aatagctcga 300

caatctgaa 309

<210> 15

<211> 160

<212> DNA

<213> 猪嵴病毒(Porcine kobuvirus)

<400> 15

gctgcttggt ggactcattg agtacatgca ggcaaatcct ggcaaacatg gtagtgctgt 60

tggttgcaac ccagacctac actggacaaa atttttcttt aaattctgtc actatcccca 120

agtttttgac ctggactaca agtgttttga tgccaccctc 160

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaaataacca gggtcgtgga 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gctcacgaac agccacatta 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gatggcgacc agatagaagt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcaatagggt tgcttgtacc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atcctccaag gaggctatgc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcgaattctg gatcgttgtt 20

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aaagatgcta gggacaaaat tc 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttcagattgt ggagctattc ca 22

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcgggactgg tttggagg 18

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cagccgcgac tctatcaa 18

Claims

1.五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测引物组，其特征在于包括五对PCR引物，它们分别针对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.10的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测引物组，其特征在于所述五对PCR引物分别为：

PEDV-F：TGTTATACTTTGGCTTTTCGT，

PEDV-R：CATAGAAAGCCCAACCAGT；

TGEV-F：GACGGCGACCAGATAGAAGT，

TGEV-R：CGTATAGGATTGCTTGTACC；

PDCoV-F：TTGGCGACTGGCTGCGTTAC，

PDCoV-R：GCAATACCTCGGCTGATT；

PRoV-F：AAGGATGCTAGGGATAAAATTG，

PRoV-R：TTCAGATTGTCGAGCTATTCCA；

PKV-F：GCTGCTTGGTGGACTCATT，

PKV-R：GAGGGTGGCATCAAAACACT。

3.权利要求1所述引物组在制备五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒中的应用。

4.五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒，主要由PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品和引物组成，其特征在于：所述引物包括五对PCR引物，它们分别针对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种猪肠道病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.10的碱基序列。

5.根据权利要求4所述的五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述PCR标准品包括PEDV标准品、TGEV标准品、PDCoV标准品、PRoV标准品和PKV标准品；所述阳性对照品是含PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PKV五种病毒的阳性质粒混合物；所述阴性对照品是灭菌后的去离子水。

6.根据权利要求4所述的五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述质粒混合物的浓度为7.56×10⁹copies/μL。

7.根据权利要求4所述的五种猪肠道病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述五对PCR引物中的所有上游引物同管包装，所有下游引物同管包装。

8.权利要求4所述试剂盒用于五种猪肠道病毒的非诊断目的特异性检测。