CN105420412A - 猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重rt-pcr检测引物及检测方法 - Google Patents

猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重rt-pcr检测引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测引物：猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：上游引物P1：5＇-GCGTTTCCTGGGCTGATT-3＇下游引物P2：5＇-ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3＇扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp。本发明多重RT-PCR对PDCoV和PEDV的最低检测量分别是4.05×101拷贝/μL和4.52×103拷贝/μL，而对猪传染性胃肠炎病毒，博卡病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪轮状病毒的扩增结果均为阴性。应用该方法和单重PCR对57份临床样品的多重PCR检测结果显示，同时感染这2种病毒的阳性率为8.77%，感染PDCoV阳性率为19.30%，感染PEDV阳性率为26.32%。

Description

猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测引物及检测方法
技术领域
本发明涉及一种病毒的检测方法，具体涉及一种猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测引物及检测方法。
背景技术
猪德尔塔冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus，PDCoV)属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的Delta冠状病毒，为有囊膜的单股正链RNA病毒。早在2012年，Woo等发表的文章中就有PDCoV的报道：他们对广东和香港等地采集的哺乳动物和禽类病料进行Delta冠状病毒检测，其中在猪粪便样品(169份)中检测到近10％的PDCoV。2014年初，美国俄亥俄州首次检测报道一种新的猪肠道冠状病毒PDCoV，截止2014年底，美国发现PDCoV感染病例达17个州。随后在加拿和韩国也报道检测到了PDCoV，其阳性检出率高达25％。猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)与PDCoV属于同一个科，但是属于Alpha冠状病毒。首次报道于英国，此后在世界多国均见有PEDV感染的报道，我国于1976年有PEDV感染的报道。自20世纪80年代后期PEDV在我国呈现大面积流行
发明内容
本发明的目的是提供一种猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测引物及检测方法。
本发明的技术方案是：猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测引物：
猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：
上游引物P1：5＇-GCGTTTCCTGGGCTGATT-3＇
下游引物P2：5＇-ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3＇
扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp；
猪流行性腹泻病毒的引物序列如下：
上游引物P3：5＇-TGGCGACTGTGACGAAAT-3＇
下游引物P4：5＇-TGTAACGCTAACACTCCTT-3＇
扩增猪流行性腹泻病毒基因部分片段101bp。
利用所述引物检测猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR的方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下多重荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测：
所述多重荧光定量RT-PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：
所述反应条件为：95℃5min，94℃1min，58℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。
本发明的有益效果是：本发明根据GenBank中登录的猪Deltacoronavirus(PDCoV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因序列，设计了2对引物分别用于扩增PDCoVN基因和PEDVM基因的目的片段。通过对PCR反应条件进行优化，建立了检测PDCoV和PEDV的多重RT-PCR诊断方法。敏感性和特异性结果显示，该多重RT-PCR对PDCoV和PEDV的最低检测量分别是4.05×101拷贝/μL和4.52×103拷贝/μL，而对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，博卡病毒(PBoV)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪轮状病毒(RV)的扩增结果均为阴性。应用该方法和单重PCR对57份临床样品的多重PCR检测结果显示，同时感染这2种病毒的阳性率为8.77％，感染PDCoV阳性率为19.30％，感染PEDV阳性率为26.32％。结果表明，建立多重PCR方法能够对PDCoV和PEDV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。
附图说明
图1多重RT-PCR电泳图，M:DL2000DNAmarks1:PDCoVandPEDV2:PDCoV3:PEDV4:阴性对照；
图2多重RT-PCR特异性试验，M:DL2000DNAmarks1:PDCoV、PEDV多重PCR产物；2～7分别是:PDCoV、PEDV、TGEV、PBoV、PRRSV、RV的PCR产物；8:阴性对照；
图3PDCoV的RT-PCR敏感性试验，M:DL2000DNAmarks1～9:4.05×108拷贝/μL～4.05×100拷贝/μL10:阴性对照；
图4PEDV的RT-PCR敏感性试验，M:DL2000DNAmarks1～9:4.52×108拷贝/μL～4.52×100拷贝/μL10:阴性对照；
图5多重RT-PCR的敏感性试验，M:DL2000DNAmarks1～8:107～100拷贝/μL9:阴性对照。
具体实施方式
本发明根据GenBank登录的PDCoV的HKU15-155株N基因序列，PEDV的JXNC1302株M基因序列，通过序列分析获得其高度保守的特异性序列，并根据该特异性保守序列设计了两对特异性引物。在此基础上建立了PDCoV和PEDV的多重RT-PCR检测方法，并对此方法进行了评价分析。对河南地区送检的病料样品进行检测分析，进一步在实践中验证方法的可靠性，从而为兽医临床的诊断和治疗提供理论依据。
猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测引物：
猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：
上游引物P1：5＇-GCGTTTCCTGGGCTGATT-3＇
下游引物P2：5＇-ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3＇
扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp；
猪流行性腹泻病毒的引物序列如下：
上游引物P3：5＇-TGGCGACTGTGACGAAAT-3＇
下游引物P4：5＇-TGTAACGCTAACACTCCTT-3＇
扩增猪流行性腹泻病毒基因部分片段101bp。
利用所述引物检测猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR的方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下多重荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测：
所述多重荧光定量RT-PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：
所述反应条件为：95℃5min，94℃1min，58℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。
本发明具体操作为：
1材料和方法
1.1病毒和细胞
猪Deltacoronavirus(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪博卡病毒(PBoV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、LLC-PK细胞、Vero细胞均由河南农业大学河南省动物性食品安全重点实验室保存。PDCoV接种ST细胞、PEDV接种Vero细胞传至8代后出现80％以上的细胞病变(CPE)时收毒。同时设正常未接毒的细胞为阴性对照。
1.2主要试剂
pMD18-T载体、QIAampViralRNAMiniKit提取试剂盒和QIAGEN反转录试剂盒购自QIAGEN公司、2×TaqPCRMix酶、DNAMarker、DNA凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司。
1.3引物的设计及合成
应用PrimerPremier5.0基因分析软件，参照Genbank中登录的PDCoVN基因、PEDVM基因设计2对引物(表1)，扩增PDCoVN基因部分片段383bp，PEDVM基因部分片段101bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用双蒸水稀释为25μmol/L，-20℃保存。
表1多重RT-PCR引物信息
1.4病毒核酸的提取
接毒细胞悬液和临床样品于-80℃反复冻融3次后用于病毒核酸的提取。参照QIAampViralRNAMiniKit提取试剂盒提取病毒总RNA，并利用反转录试剂盒制备反转录为cDNA，-80℃保存。
1.5PCR产物的鉴定
单一病毒的RT-PCR反应在25μL体系中进行，包括2×TaqDNAMasterMix15μL，上下游引物各1μL(25μmol/L)，cDNA模板4μL，ddH2O补足25μL。PCR反应扩增参数为：95℃5min，94℃1min，58℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。PCR产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒回收目的产物，将回收的目的片段与pMD18-T载体连接，转化感受态细胞，用质粒提取试剂盒提取质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.6单一RT-PCR反应条件优化
在25μL体系中进行，2×TaqDNAMasterMix12μL，上下游引物各0.5μL(25μmol/L)，质粒模板各1μL，ddH2O补足25μL。反应条件为：95℃5min，94℃1min，58℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。取5μLRT-PCR扩增产物于2％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
1.7多重RT-PCR反应
先对多重RT-PCR反应条件，包括退火温度(53～60℃)，引物终浓度(0.1～1μmol/L)，2×TaqPCRMix酶浓度，反应体积(25～50μL)进行优化，确定最佳反应条件为25μL反应体系，包括2×TaqDNAMasterMix12μL，2对引物上下游各0.5μL(25μmol/L)，质粒模板各1μL，ddH2O补足25μL。反应条件为：95℃5min，94℃1min，58℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。取5μLPCR扩增产物于2％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
1.8特异性试验
采用建立的多重RT-PCR方法对PDCoV、PEDV、TGEV、PBoV、RV、PRRSV进行扩增，并选择灭菌水做阴性对照，检验所建立方法的特异性。
1.9敏感性试验
将测序正确的阳性质粒作为DNA标准品，用分光光度仪测定浓度后将两种质粒混合后进行10倍系列稀释。根据公式计算出每微升质粒液体中含有的质粒拷贝数。用优化后的反应条件进行多重RT-PCR扩增。
1.10重复性试验
应用建立的多重RT-PCR，用优化后条件每隔一周重复检测一次，连续检测3次，以检测结果的可靠性。
1.11临床样品
收集河南地区的25份猪腹泻肠内容物样品(编号1～25)、32份粪便样品(编号26～57)，用已经建立的多重RT-PCR和单一RT-PCR反应条件同时对这57份样品进行检测。
2结果
2.1多重RT-PCR产物的电泳分析
以PDCoV、PEDV为模板做单重和多重RT-PCR，并以ddH2O做阴性对照，分别扩增出PDCoV383bp、PEDV101bp特异性条带；多重RT-PCR可同时扩增出两条相应的特异性条带，阴性对照未扩出条带(图1)。
2.2特异性试验
用建立的多重RT-PCR方法对PDCoV、PEDV的单一及混合质粒为模板，TGEV、PBoV、PRRSV、RV为模板分别使用建立的多重RT-PCR方法进行扩增，只有PDCoV、PEDV单一和混合cDNA模板扩增出与相应目的片段大小符合的条带，而其它病毒均无条带(图2)。
2.3单重RT-PCR敏感性试验
分别以PDCoV和PEDV10倍倍比稀释的质粒(108～100)作为模板，用建立好的多重RT-PCR方法进行扩增，扩增结果显示PDCoV最低检测量为4.05×101拷贝/μL(图3)，PEDV最低检测量为4.52×101拷贝/μL(图4)。
2.4多重RT-PCR敏感性试验
以PDCoV和PEDV的混合质粒10倍倍比稀释后作为模板，用建立好的多重RT-PCR方法进行扩增，扩增结果显示PDCoV最低检测量为4.05×101拷贝/μL，PEDV最低检测量为4.52×103拷贝/μL(图5)。
2.5多重RT-PCR重复性试验
以PDCoV和PEDV的混合质粒107～102拷贝/μL为模板，利用建立好的多重RT-PCR方法每隔1周扩增一次，连续扩增4周。结果表明4次扩增结果一样，表明该多重RT-PC方法具有较高的可重复性。
2.6多重RT-PCR临床样品检测结果
用建立的多重RT-PCR和单一RT-PCR对河南地区的57份样品进行检测，检测结果见表2，两种方法检测无论是PDCoV、PEDV单一感染阳性符合率还是二者混合感染阳性符合率均是100％。
表2临床样品检测结果
Tablel2DetectionResultofclinicalsamples
3讨论
2014年初，WangLeYi在PEDV阴性的腹泻致死仔猪中，PDCoV首次被辨认。2014年2月，美国俄亥俄州和印第安纳州首次检测到PDCoV，随后美国其他州以及加拿大相继检测出该病毒。目前国内对PDCoV的基因型、致病性、稳定的体外培养研究很少，对PDCoV的感染无有效的治疗方法和疫苗。2015年本发明室分离到一株PDCoV(命名HN-2015)，为PDCoV的相关研究以及预防提供了基础。
PDCoV和PEDV是导致仔猪腹泻疾病的常见病毒，发病率高，目前均无有效的药物，并且两者在临床症状、流行病学和病理变化上无明显差异。到目前为止，美国已有20多个州暴发了猪群腹泻，PDCoV可以单独感染，也可以与PEDV、TGEV混合感染。在PDCoV感染的猪场，猪的发病率和致死率非常高，给养猪业造成了巨大的经济损失。传统的检测方法，如细胞培养、免疫学和动物实验等虽能对二者鉴别诊断，但是最大的缺点是检测周期长，灵敏度低。RT-PCR技术是目前鉴别诊断二者的最敏感、特异的方法。相对于单重RT-PCR方法，多重RT-PCR能同时进行多种病原微生物的鉴别诊断，且具有灵敏度高、特异性好，方便快捷等特点，适用于大规模检测，在动物疫病的流行病与预防中，具有不可替代的作用。
本发明通过设计合成2对引物，以PEDV和PDCoV混合质粒为模板，在单一RT-PCR基础上，优化RT-PCR体系和反应条件，建立了同时检测PEDVM基因、PDCoVN基因特异性片段的多重RT-PCR方法。2013年，霍金耀建立的多重RT-PCR检测方法中对PEDV的最低检测浓度为125pg。2015年，逢凤娇在国内首次建立了PDCoV的RT-PCR检测方法，对PDCoV最低检测浓度为4.05×103拷贝/μL。而本发明建立的多重RT-PCR对PEDV和PDCoV最低检测浓度分别为4.52×103拷贝/μL和4.05×101拷贝/μL。虽然PEDV与本试验中单重RT-PCR相比，拷贝数降低了102个数量级，但仍然具有很强的敏感性。表明，建立的多重RT-PCR反应具有很好的敏感性。利用此方法对河南省地区的57份进行检测，PDCoV单一感染率是19.30％，PEDV单一感染率是26.32％，PDCoV和PEDV混合感染率是8.77％。与单重RT-PCR方法比较，两种方法的阳性检出符合率为100％，完全可以替代单重RT-PCR，节约了时间和成本。
综合分析表明，该方法具有良好的特异性、敏感性及可重复性，不但可以应用与PDCoV和PEDV的流行性病学调查，也为PDCoV和PEDV早期感染的快速诊断奠定了重要基础。

Claims (2)

1.猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测引物，其特征在于：
猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：
上游引物P1：5＇-GCGTTTCCTGGGCTGATT-3＇
下游引物P2：5＇-ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3＇
扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp；
猪流行性腹泻病毒的引物序列如下：
上游引物P3：5＇-TGGCGACTGTGACGAAAT-3＇
下游引物P4：5＇-TGTAACGCTAACACTCCTT-3＇
扩增猪流行性腹泻病毒基因部分片段101bp。
2.利用权利要求1所述引物检测猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR的方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下多重荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，其特征在于：
所述多重荧光定量RT-PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：
所述反应条件为：95℃5min，94℃1min，58℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。
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