CN103320537B - 一种pedv和tgev双重rt-pcr检测方法及寡核苷酸引物对 - Google Patents
一种pedv和tgev双重rt-pcr检测方法及寡核苷酸引物对 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的双重RT-PCR方法及寡核苷酸引物对。参照GenBank收录的PEDV CV777株（AF353511.1）核蛋白（N）基因序列和TGEV Miller M60株（DQ811786.2）纤突蛋白（S）基因序列，分别设计两对特异性引物，根据设计的引物，探索最佳反应体系和反应条件，在建立单项RT-PCR检测方法的基础上，建立双重RT-PCR方法，并进行特异性试验、敏感性试验、重复性试验。用该方法对85份猪腹泻临床样本进行检测，并对其中的36份临床样本同时进行PEDV和TGEV抗原检测卡检测。结果表明，建立的双重RT-PCR方法敏感性高、特异性强，能快速地检测PEDV和TGEV。本研究所建立的双重RT-PCR检测方法具有很好的应用性，能够用于猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测PEDV和TGEV双重RT-PCR方法及寡核苷酸引物对，属于生物检测技术领域。
背景技术
由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起的猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)和猪传染性胃肠炎（Transmissiblegastroenteritis,TGE）是当前主要的猪病毒性腹泻病。两种病存在混合感染，且临床上均以腹泻、呕吐、脱水为主要特征。从2010年春季至今，我国的很多省份，以及泰国、菲律宾、韩国等亚洲国家的猪场暴发了严重的猪流行性腹泻疫情，给养猪业造成严重的经济损失。由于PED和TGE在流行特点、临床症状和病理变化等方面极为相似，在临床和组织病理学上很难区分，所以需要通过分子生物学方法来区分两者。
多重PCR是在同一反应体系中加入多对引物对多个目的基因同时进行扩增的试验方法。该项技术具有省时、省力、降低成本、减少产物污染等优点。多重PCR能够捕获更多的信息，使应用范围更加广泛，分析的基因更加复杂。因此建立一种能够同时检测PEDV和TGEV双重RT-PCR方法有助于快速鉴别诊断两种疾病。
PEDV核蛋白（N）基因和TGEV纤突蛋白（S）基因序列高度保守，因此，针对PEDV N蛋白基因和TGEV S蛋白基因的保守区进行双重RT-PCR检测方法的建立，能够提高RT-PCR检测方法的特异性和敏感性。
发明内容
本发明的目的在于建立一种快速、敏感的鉴别诊断PEDV和TGEV双重RT-PCR检测方法。
建立一种快速、敏感的鉴别诊断PEDV和TGEV双重RT-PCR检测方法的具体实施步骤见图12。
多重RT-PCR检测方法最关键在于引物设计，本发明通过序列比对，分别选择PEDV N蛋白基因和TGEV S蛋白基因的保守区设计引物，既能保证鉴定病原的正确，又不能漏检同种不同株病原；同时利用N基因与S基因交叉小的特点，提高引物的特异性。另外，本发明的扩增片段长度适宜，既能在电泳中相互分开，又不太离散，避免多重PCR中优先扩增小片段后阻碍长片段扩增的情形，同时引物二聚体等非特异性扩增产物很少。另外，通过RT-PCR反应体系和反应条件的优化，得到特异性和灵敏性较高的PEDV和TGEV的双重RT-PCR检测方法。经最终实验证实，本发明的双重RT-PCR方法由于引物设计和实验体系的选取，不仅PEDV和TGEV的单项RT-PCR敏感性高（分别为1.21ng/uL和1.32ng/uL），PEDV和TGEV的双重RT-PCR敏感性也极其显著，最低可检测到10.14ng/uL的RNA模版量，比韩国进口的抗原检测卡敏感性高，且成本低廉，能够快速实现对PEDV和TGEV的特异性和敏感性检测。
附图说明
图1-1引物P1选择区；图1-2引物P2选择区；图1-3引物P3选择区；图1-4引物P4选择区；
图2PEDV扩增的特异性，各泳道内容，M：DNA标准DL2000；1、3：猪胃-流二联苗；2：ddH2O；4：CSFV；5：PRRSV；6：PRV；7：E.coli；
图3PEDV扩增的敏感性，各泳道内容，M：DNA标准DL2000；1：猪胃-流二联苗；2：ddH2O；3～10：10-1～10-8倍稀释；
图4PEDV扩增的重复性，各泳道内容，M：DNA标准DL2000，1～4：猪胃-流二联苗；
图5TGEV扩增的特异性，各泳道内容，M：DNA标准DL2000；1、3：猪胃-流二联苗；2：ddH2O；4：CSFV；5：PRRSV；6：PRV；7：E.coli；
图6TGEV扩增的敏感性，各泳道内容，M：DNA标准DL2000；1：猪胃-流二联苗；2：ddH2O；3～10：10-1～10-8倍稀释；
图7TGEV扩增的重复性，各泳道内容，M：DNA标准DL2000；1～4：猪胃-流二联苗；
图8PEDV和TGEV双重扩增的特异性，各泳道内容，M：DNA标准DL2000；1、3：猪胃-流二联苗；2：ddH2O；4：CSFV；5：PRRSV；6：PRV；7：E.coli；
图9PEDV和TGEV双重扩增的敏感性，各泳道内容，M：DNA标准DL2000；1：猪胃-流二联苗；2：ddH2O；3～10：10-1～10-8倍稀释；
图10PEDV和TGEV双重扩增的重复性，各泳道内容，M：DNA标准DL2000；1～4：猪胃-流二联苗；
图11部分猪腹泻临床样本双重RT-PCR检测结果，各泳道内容，M：DNA标准DL2000；1：猪胃-流二联苗；2：ddH2O；3～20：猪腹泻临床样本。
图12：建立一种快速、敏感的鉴别诊断PEDV和TGEV双重RT-PCR检测方法的具体实施步骤见。
具体实施方式
实施例：
1材料
1.1毒株和临床样本
猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗（猪胃-流二联苗）由哈尔滨维科生物技术开发公司生产（兽药生字(2005)080011046）；猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、大肠杆菌(E.coli)均由哈尔滨维科生物技术开发公司购买；2011年9月至2013年4月期间采集山东地区85份猪腹泻临床样本。
1.2主要试剂和仪器
RNAiso Plus、Reverse transcriptase XL(AMV)、Ribonuclease Inhibitor、dNTP、rTaq DNA polymerase、DNA标准(DL2000)购自TaKaRa公司；DNAzolReagent购自Invitrogen公司；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、pMD18-T载体克隆试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；DEPC购自Sigma公司；PEDV、TGEV抗原检测卡购自韩国安捷（Anigen）公司；西班牙Biowest琼脂糖购自上海夏夷实业有限公司；GoldView(GV)购自北京赛百盛基因技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯产品。
超净工作台（哈尔滨东联电子技术开发有限公司、DL-CJ-2FN）；台式高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器场、TGL-16B）；PCR扩增仪（Alpha UnitBlack Assembly PCR、PTC-200）；42℃可调恒温水浴锅（北京市长风仪器公司、HW.SY21-K）；高速离心机（长沙市湘仪离心机有限公司、H2050R-1）；微波炉（格兰仕尔）；电子天平（上海海康电子仪器厂、YB202N）；DYY-Ⅲ-7型、DYY-Ⅲ-8B核酸电泳仪（北京六一仪器厂）；紫外凝胶成像系统（美国Gene Genius UVP型）；UV2550型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；微量移液器（Finnpipette公司）。
2方法
2.1引物的设计与合成
通过DNAStar软件中的MegLign比对GenBank中登录的PEDV核蛋白（N）基因和TGEV纤突蛋白（S）基因的核酸序列，选定基因的相对保守区（参见图1-1至图1-4）。利用Primer5.0软件，根据PEDV的经典毒株CV777株（AF353511.1）和TGEV的经典毒株Miller M60株（DQ811786.2）的核酸序列，分别设计检测PEDV的特异性引物P1/P2和检测TGEV的特异性引物P3/P4（见表1）。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，用DEPC水稀释到10pmol/μL，-20℃保存备用。
表1引物序列
a序列在PEDV CV777株（AF353511.1）全基因组中的位置。
b序列在TGEV Miller M60株（DQ811786.2）全基因组中的位置。
2.2临床样本处理
肠内容物或粪便样品加适量灭菌PBS稀释后，充分反复冻融3次，5000rpm离心20min，取上清（病毒悬液），-70℃保存备用。
2.3核酸提取
2.3.1PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV的RNA提取
采用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂提取样品中总RNA。主要步骤：
（1）取1.4制备的病毒悬液250μL至1.5mL EP管中，加入RNAiso Plus750μL，颠倒混匀，室温静置5min，裂解细胞。
（2）向上述EP管中加入200μL氯仿，剧烈振荡至溶液充分乳化，室温静置10min。
（3）12000g4℃离心15min。吸取500μL上清液至另一新的1.5mL EP管中。
（4）向EP管中加入500μL异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃静置30min。
（5）12000g4℃离心10min。小心弃去上清，加入l mL75%的乙醇，颠倒混匀。
（6）12000g4℃离心5min。小心弃去乙醇，室温干燥沉淀2～5min，加入20μL DEPC水，溶解RNA沉淀，待沉淀完全溶解后，-70℃保存核酸或立即进行反转录。
2.3.2PRV的DNA提取
采用Invitrogen公司的DNAzol试剂提取PRV样品中总DNA。主要步骤：
（1）取PRV病毒液200μL，分别加入到无菌的EP管中，再加入800μLDNAzol轻轻混匀，室温静置3min。
（2）12000rpm室温离心10min，取出EP管，轻轻吸取500μL上清液移入新EP管中。
（3）加入等体积无水乙醇，颠倒混匀，室温放置5min，以沉淀核酸。
（4）12000rpm室温离心5min，取出EP管，弃上清液，加入1mL75%乙醇颠倒数次洗涤核酸。
（5）室温12000rpm离心2min，弃上清，再加入1mL75%乙醇洗涤一遍。
（6）同（5）离心弃去上清液，倒置EP管干燥核酸，然后用20μL8mMNaOH溶液溶解DNA，-20℃保存备用。
2.3.3E.coli的DNA提取
（1）将实验室保存的大肠杆菌进行过夜培养。
（2）取1mL菌液至1.5mL EP管中，8000rpm离心10min。
（3）倒掉上清，用100μL蒸馏水悬浮沉淀，沸水煮沸15min，放在-20℃冰柜反复冻融3次。
（4）反复冻融后，5000rpm离心10min，收集上清即为细菌基因组DNA。放-20℃保存备用。
2.4单项RT-PCR方法的建立
2.4.1单项RT-PCR反应条件的优化
采用20μL的体系进行PEDV和TGEV cDNA合成。在200μL的PCR反应管中按表2反转录体系加入溶液及试剂，混匀后瞬时离心，置42℃水浴l h，之后70℃10min灭活反转录酶，-20℃保存备用。采用25μL的反应体系分别进行PEDV和TGEV的PCR扩增，分别对引物浓度、退火温度、dNTP浓度、rTaq DNA聚合酶浓度进行优化，确定病毒的PCR最佳反应条件。
表2反转录反应体系（20uL）
2.4.2特异性试验
按照2.3的方法分别提取猪胃-流二联苗、CSFV、PRRSV、PRV、E.coli的总RNA和DNA。利用建立的PEDV和TGEV单项RT-PCR方法进行目的基因扩增，验证RT-PCR检测方法的特异性。
2.4.3敏感性试验
用紫外分光光度计测定提取的猪胃-流二联苗的核酸浓度，进行10-1～10-8系列稀释，分别按建立的PEDV和TGEV单项RT-PCR方法进行扩增，电泳观察结果，确定反应的敏感性。
2.4.4重复性试验
按已优化的RT-PCR反应的最佳条件分别对PEDV和TGEV进行RT-PCR扩增，重复4次，以验证结果的可靠性。
2.5双重RT-PCR方法的建立
2.5.1双重RT-PCR反应条件的优化
将含有PEDV和TGEV目的片段的cDNA，以及各种反应试剂混合在一起进行双重PCR反应条件的优化，以确定最佳的PCR反应条件。
2.5.2特异性试验
对猪胃-流二联苗、CSFV、PRRSV、PRV、E.coli分别进行PCR操作，验证该双重RT-PCR检测方法的特异性。
2.5.3敏感性试验
10倍系列稀释提取的猪胃-流二联苗核酸，用紫外分光光度计测定个稀释度的核酸浓度，分别按已优化的双重RT-PCR反应最佳条件进行PCR扩增，以确定最小检测量。
2.5.4重复性试验
对建立的双重RT-PCR检测方法，重复4次，以验证结果的可靠性。
2.6临床样本检测
利用建立的双重RT-PCR方法对85份猪腹泻临床样本进行了检测，并对其中的36份临床样本同时进行了PEDV和TGEV抗原检测卡检测。
3结果与分析
3.1PEDV单项RT-PCR方法的建立
3.1.1PEDV单项RT-PCR检测方法的最终反应条件的确定
通过反复多次对反转录及PCR反应过程中的退火温度、延伸时间、循环次数等条件的优化，确定了PEDV PCR最佳反应体系（见表3）。最佳扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸90s，共30个循环，72℃终延伸10min。通过建立的体系以猪胃-流二联苗提取的RNA作为模板，进行RT-PCR扩增，扩增出大小为489bp与预期大小相符目的基因片段。PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，结果与GenBank发表的PEDV基因序列的同源性在98.7～99.6%。
表3PEDV PCR反应体系（25uL）
3.1.2PEDV单项RT-PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验结果
采用建立的针对PEDV的单项RT-PCR扩增条件，对提取的猪胃-流二联苗、CSFV、PRRSV的RNA进行反转录（RT）和PCR扩增，对提取的PRV、E.coli的DNA进行PCR扩增。结果从猪胃-流二联苗扩增得到与试验设计相符合的489bp的特异性目的片段，未见非特异性扩增，而从CSFV、PRRSV、PRV、E.coli中均未扩增出条带（见图2）。在上述优化条件下，该单项RT-PCR方法最低能检测到经10-6稀释的猪胃-流二联苗抽提的RNA，其灵敏度为1.21ng/uL（见图3）。按已优化的RT-PCR反应的最佳条件进行PCR扩增，重复4次，结果在489bp处，均得到了清晰可见的目的条带（见图4）。
3.2TGEV单项RT-PCR方法的建立
3.2.1TGEV单项RT-PCR检测方法的最终反应条件的确定
通过反复多次对反转录及PCR反应过程中的退火温度、延伸时间、循环次数等条件的优化，确定了TGEV PCR最佳反应体系（见表4）。最佳扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环，72℃终延伸10min。通过建立的体系以猪胃-流二联苗提取的RNA作为模板，进行RT-PCR扩增，扩增出大小为625bp与预期大小相符目的基因片段。PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，结果与GenBank发表的TGEV基因序列的同源性在99.4%以上。
表4TGEV PCR反应体系（25uL）
3.2.2TGEV单项RT-PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验结果
采用建立的针对TGEV的单项RT-PCR扩增条件，对提取的猪胃-流二联苗、CSFV、PRRSV的RNA进行反转录和PCR扩增，对提取的PRV、E.coli的DNA进行PCR扩增。结果从猪胃-流二联苗扩增得到与试验设计相符合的625bp的特异性目的片段，未见非特异性扩增而从CSFV、PRRSV、PRV、E.coli中均未扩增出条带（见图5）。在上述优化条件下，该单项RT-PCR方法最低能检测到经10-6稀释的猪胃-流二联苗抽提的RNA，其灵敏度为1.32ng/uL（见图6）。按已优化的RT-PCR反应的最佳条件进行PCR扩增，重复4次，结果在625bp处，均得到了清晰可见的目的条带（见图7）。
3.3双重RT-PCR检测方法的建立
3.3.1PEDV和TGEV双重RT-PCR检测方法的最终反应条件的确定
在建立的PEDV和TGEV单项RT-PCR检测方法的基础上，通过对各项反应条件的优化，确定了PEDV和TGEV双重PCR最佳反应体系（见表5）。最佳扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸90s，共30个循环，72℃终延伸10min。通过建立的体系以猪胃-流二联苗提取的RNA作为模板，进行RT-PCR扩增，分别扩增出大小为489bp和625bp目的基因片段。并将扩增产物经胶回收纯化试剂盒纯化后送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，结果与GenBank发表的PEDV和TGEV基因序列的同源性在99.3%以上。
表5双重PCR反应体系（25μL）
3.3.2PEDV和TGEV双重RT-PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验结果
按建立的双重RT-PCR检测方法，对提取的猪胃-流二联苗、CSFV、PRRSV的RNA进行反转录和PCR扩增，对提取的PRV、E.coli的DNA进行PCR扩增。结果从猪胃-流二联苗扩增得到489bp和625bp的特异性目的片段，而从CSFV、PRRSV、PRV、E.coli中均未扩增出条带（见图8）。并将扩增产物经胶回收纯化试剂盒纯化后送北京六合华大基因科技股份有限公司测序鉴定，结果扩增的目的基因序列与PEDV和TGEV的同源性在99.2%以上。
利用建立的双重RT-PCR方法对10-1～10-8系列稀释的猪胃-流二联苗核酸进行检测，结果表明稀释度达10-5亦出现较明显的目的基因条带。根据紫外分光光度计测定的核酸浓度，双重RT-PCR方法检测出的最低核酸浓度为10.14ng/uL（见图9）。
按已优化的双重RT-PCR反应的最佳条件进行PCR扩增，重复4次，结果在489bp和625bp处，均得到了清晰可见的目的条带（见图10）。
3.4临床样本检测
利用建立的双重RT-PCR方法对85份猪腹泻临床样本进行了检测，并对其中的36份临床样本同时进行了PEDV和TGEV抗原检测卡检测（见图11）。结果表明，建立的PEDV和TGEV双重RT-PCR方法与韩国进口的商品化PEDV和TGEV抗原检测卡检测结果完全符合（见表6和表7）。且其中4份样品中同时扩增出了PEDV和TGEV，经测序与GenBank发表的基因序列同源性为99.2～99.6%，表明4份样品为两种病毒混合感染。通过双重RT-PCR方法与抗原检测卡对同一批样品的检测结果说明，在36份样品中，采用双重RT-PCR方法PEDV检出19/36较检测卡方法的17/36检出率提高了5.56%。利用双重RT-PCR方法对上述样品重复检测三次，试验结果一致。结果进一步证实建立的双重RT-PCR检测方法的特异性和敏感性较好，可用于临床PEDV和TGEV混合感染的诊断。85份猪腹泻临床样本检测结果显示，PEDV检出30份，占35.29%，TGEV检出9份，占10.60%，PEDV和TGEV混合感染检出4份，占4.71%。
表6双重RT-PCR与抗原检测卡检测结果对比分析
表7临床样品双重RT-PCR检测结果
本试验成功建立了一种PEDV和TGEV双重RT-PCR检测方法，结果表明所建立的方法能快速准确地检测PEDV和TGEV。根据上述研究结果，本研究所建立的双重RT-PCR检测方法具有很好的应用性,能够用于PED和TGE的检测。
Claims (2)
1.一种用于检测PEDV和TGEV的双重RT-PCR反应体系，其特征在于：该反应体系是通过比对GenBank中登录的PEDV N蛋白基因和TGEV S蛋白基因的核酸序列，选定基因的相对保守区，利用Primer5.0软件，根据PEDV CV777株，编号AF353511.1和TGEV Miller M60株，编号DQ811786.2的核酸序列，分别设计检测PEDV的特异性引物P1/P2和检测TGEV的特异性引物P3/P4，其序列如下：
，该反应体系由以下组分组成：
，PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸90s，共30个循环，72℃终延伸10min。
2.PCR寡核苷酸引物对在建立用于检测PEDV和TGEV的双重RT-PCR反应体系中的应用，其特征在于：该反应体系是通过比对GenBank中登录的PEDV N蛋白基因和TGEV S蛋白基因的核酸序列，选定基因的相对保守区，利用Primer5.0软件，根据PEDV CV777株，编号AF353511.1和TGEV MillerM60株，编号DQ811786.2的核酸序列，分别设计检测PEDV的特异性引物P1/P2和检测TGEV的特异性引物P3/P4，其序列如下：
，该反应体系由以下组分组成：
，PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸90s，共30个循环，72℃终延伸10min。
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