CN105695626A - 检测辣椒叶脉黄化病毒的rt-pcr引物及其方法 - Google Patents

Abstract

一种检测辣椒叶脉黄化病毒(Pepper vein yellows virus，PeVYV)的RT-PCR引物及其方法，该方法根据PeVYV核苷酸序列的高保守区所设计出如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的特异性引物，以提取的待测样品总RNA为模板，利用上述引物进行RT-PCR扩增，然后对扩增产物进行电泳检测，根据电泳结果的扩增条带是否为504bp，能准确判断待测样品是否感染了辣椒叶脉黄化病毒，检测结果更加准确，且检测时不需加辅助引物，更加方便。本发明的检测方法适用于大批量辣椒作物叶子中PeVYV的直接检测，在降低了检测成本，减少了工作量的同时，保留了快速、准确，以及灵敏度高等优势。

Description

检测辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR引物及其方法

技术领域

本发明涉及一种检测植物中辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR引物及其方法，具体而言，涉及一种特异性检测茄科植物中的辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR引物及其方法。

背景技术

辣椒叶脉黄化病毒(Pepperveinyellowsvirus，PeVYV)，是一种新型的黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)病毒。PeVYV目前主要侵染的作物是辣椒，在同属茄科植物龙葵上也有报导，经常在混合感染中发现，是一个引起脉黄病(yellowveindisease)的重要的病原体，在西非地区是一种主要的辣椒病害。PeVYV是通过棉蚜、嫁接等持续的方式传播，在辣椒上的症状主要有植物矮化、叶脉黄化、叶卷曲、叶片变形、叶褶皱和节间缩短等。自1995年在日本首次确定以来，PeVYV在欧洲(包括西班牙、荷兰和土耳其)，亚洲(中国、中国台湾、泰国、印度、印度尼西亚、菲律宾和日本)和非洲(苏丹、马里和突尼斯)等地区都有数据报导。这表明，PeVYV具有广泛的地域分布，对辣椒和其他茄科植物构成了一个全球性的威胁。

目前，尚未有专门检测PeVYV的专利报导，譬如酶联免疫吸附法以及实时荧光RT-PCR等分子生物学检测方法并未见报导。这对PeVYV的检测来说，是一个重大的缺失，必然对辣椒感染PeVYV的诊断及及时防控带来负面的影响。而辣椒上PeVYV的发生一般伴随着其他病毒(比如TMV、CMV、BBWV、PVY等)的混合感染，而且PeVYV侵染发生的某些症状和其它病毒病的感染症状类似，因此很难简单地从症状上进行区别鉴定；同时，在实验室条件下利用显微技术对病毒粒子进行形态观察并不能做到有效精准地判断。在这种形势下，建立一种快速、准确的检测辣椒中PeVYV的PCR方法是非常有必要的，而在这个方法中最关键的是找到针对PeVYV的特异性高的PCR引物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对上述现有技术的不足，提供一种检测辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR引物及其方法，利用本发明的RT-PCR引物及方法能更快速、更准确地直接检测出辣椒或龙葵中是否含有辣椒叶脉黄化病毒。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：一种检测辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR引物，其正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明同时还提供一种检测辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR方法，该方法是提取待测样品总RNA，利用上述的引物进行RT-PCR扩增，然后对扩增产物进行电泳鉴定，当所述扩增产物大小为504bp时，则判断该待测样品感染了辣椒叶脉黄化病毒。

所述待测样品为茄科植物辣椒或龙葵。进一步地，所述待测样品是辣椒叶片或龙葵叶片。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明中设计的特异引物是根据PeVYV核苷酸序列的高保守区所设计，与其它引物相比较，除了特异性好之外，还具有对不同的PeVYV分离物覆盖率最高的特点，能有效检测到不同的PeVYV分离物，检测结果更加准确，且检测时不需加辅助引物，更加方便。本发明的检测方法适用于大批量辣椒作物叶子中PeVYV的直接检测，在降低了检测成本，减少了工作量的同时，保留了快速、准确，以及灵敏度高等优势。

附图说明

图1是PeVYV正反向引物的Primer-BLAST结果。

图2为本发明正、反向引物与JX427532.1序列互补性对比图。

图中，A：正向引物；B：反向引物。

图3为本发明正、反向引物两引物之间互补性对比图。

图4为本发明引物扩增的琼脂糖凝胶电泳图。

图中，各泳道从左至右依次为TRANS2KPlusDNAMarker、携带PeVYV的辣椒叶片、健康的辣椒叶片。

图5为本发明引物扩增电泳结果图。

图中，M：TRANS2KPlusDNAMarker；1：感染了PeVYV的辣椒病株叶片；2：感染了PeVYV的辣椒病株种子；3：感染了蚕豆萎蔫病毒的辣椒病株；4：感染了小西葫芦黄花叶病毒的南瓜病株。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

1、引物设计：

本发明人利用病毒衣壳蛋白(CP)基因核苷酸序列进化的保守性，从NCBI搜索并下载辣椒叶脉黄化病毒及其相近病毒的CP基因核苷酸序列，运用MEG5.1软件对这些序列进行比对，从扩展名为mas的文件中找出不同研究者报告的辣椒叶脉黄化病毒衣壳蛋白基因核苷酸序列所共有其它病毒序列均与之不同的引物候选区，然后设计出的一对特异性引物，引物序列如下：

正向引物：5’-TAACACCCGCCGTCGTAG-3’，如SEQIDNo.1所示，

反向引物：5’-CCGTTGCCTTTGTAGAGC-3’，如SEQIDNo.2所示。

上述引物由生工(上海)有限公司合成，预期的PCR产物为504bp。

将正向引物和反向引物分别经BLAST检索，见下表1和下表2，分别列出了本发明正、反向引物序列的覆盖率和相同率均为100％的PeVYV序列，其中与正向引物覆盖率和相同率均为100％的PeVYV分离物有12个，与反向引物覆盖率和相同率均为100％的PeVYV分离物有10个。图1为本发明正、反向引物序列Primer-BLAST结果，结果显示本发明正、反向序列只与序列号为NC_015050.1的植物病毒PeVYV序列匹配。并结合图2和图3，可知与本发明的正向引物和反向引物的序列能100％覆盖且100％相同的植物病毒序列全部是PeVYV核苷酸序列。

因此，本发明的引物的特异性是非常好的，采用RT-PCR反应系统，能成功扩展出PeVYV特异性序列。

表1PeVYV正向引物的BLAST结果

表2PeVYV反向引物的BLAST结果

2、病毒的RT-PCR过程

提取叶片总RNA:将液氮速冻的辣椒叶片放入已灭菌去RNA酶的研钵中迅速研磨粉碎，利用TRANS公司提供的植物RNA提取试剂盒按照操作说明书进行。所用酒精等其它试剂均为国产分析纯试剂。

以提取的辣椒叶片总RNA为模板，利用上述设计的引物对提取的总RNA进行RT-PCR扩增，预计扩增片段约为504bp。

反转录反应体系20μL：6.0μL总RNA，4.0μLAll-in-OneMIX(TRANS公司提供)，10.0μLRNasefreeH₂O，25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加热5min，失活RT后，4℃保存。

PCR反应体系20μL：1.0μL反转录产物，2μL10×缓冲液，1.6μLdNTPs(2.5mmol·L^-1)，0.4μLTaqDNA聚合酶(5U·μL^-1)，0.8μL正向引物(10μmol·L^-1),0.8μL反向引物(10μmol·L^-1),13.4μLRNasefreeH₂O。

扩增条件：94℃预变性5min；94℃45sec,59℃45sec,72℃1min,36个循环；72℃延伸10min。

3、PCR扩增产物的鉴定

PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳并用凝胶成像系统检查，出现与预期大小相符的目的条带(图4)。对PCR产物进行测序，测序结果经BLAST比对,确实为辣椒叶脉黄化病毒。

本发明的PCR引物可以用于PCR衍生技术，如实时荧光PCR。

实施例1

用本发明特异性引物分别对感染了PeVYV的辣椒病株叶片、携带PeVYV的辣椒病株种子，感染了蚕豆萎蔫病毒(BroadBeanWiltVirus)的辣椒病株，感染了小西葫芦黄花叶病毒(ZucchiniYellowMosaicVirus)的南瓜病株进行RT-PCR检测，电泳结果请参见图5。结果表明，只有感染了PeVYV的辣椒叶片和种子呈阳性，扩增出预期的504个碱基的条带，而其它均为阴性。

由上可知，本发明的该对特异性引物对辣椒叶脉黄化病毒是特异的，采用该引物直接对待测样品进行RT-PCR检测，根据电泳结果的扩增条带是否为504bp，能准确判断待测样品是否感染了辣椒叶脉黄化病毒，能得到准确的结果。

Claims (4)

1.一种检测辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR引物，其特征在于，其正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。

2.一种检测辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR方法，其特征在于，该方法是提取待测样品总RNA，利用权利要求1所述的引物进行RT-PCR扩增，然后对扩增产物进行电泳鉴定。

3.如权利要求2所述的检测辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR方法，其特征在于，所述扩增产物大小为504bp。

4.如权利要求2或3所述的检测辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR方法，其特征在于，所述待测样品为茄科植物辣椒或龙葵。