CN107893129A - 检测苹果绿皱果病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测苹果绿皱果病毒方法，该方法是基于检测苹果绿皱果病毒的特异性PCR引物对(SEQ ID NO:1‑2)和用于PCR扩增内参基因ER‑1α的引物对(SEQ ID NO:3‑4)而建立的双重PCR检测法。采用本发明提供的特异性PCR引物对、双重PCR反应体系以及产物特征和结果判断标准，可以快速准确地检测苹果苗木是否带有绿皱果病毒，为苗木早期病毒检测、无毒化苗木繁育及建园奠定技术基础。

Description

检测苹果绿皱果病毒的方法

技术领域

本发明涉及植物保护领域及分子生物学检测领域，具体地说，涉及检测苹果绿皱果病毒的方法。

背景技术

苹果绿皱果病是一种由苹果绿皱果病毒(Apple green crinkle virus，AGrCV)引起的病害，病毒侵染苹果植株后，病毒分布于植株的各个器官，主要危害苹果果实，发病症状表现为在落花后20天左右，幼果表面出现水渍状直径2-6毫米的不规则斑块。随着果实逐渐膨大，斑块部位凹凸不平，果实畸形，果皮木栓化，呈铁锈色并有裂纹，使果品丧失商品价值。苹果绿皱果病毒潜育期2-3年，最长可达8年。苹果作为多年生植物，一旦被病毒感染，树体将会终生带毒，且目前尚无彻底根治的有效药剂。因此，在苹果树嫁接、苗木繁育和生产管理过程中，通过病毒检测、淘汰病毒植株、选用无病毒植株尤为重要。本方法主要用于苹果植株和种条中在苹果绿皱果病发病前、潜伏期的预先检测、遴选和淘汰。

有关苹果绿皱果病毒的研究较少，病毒核酸中已知的基因序列、变异类型亦非常有限，检测较为困难。本发明提供了一种通过双重RT-PCR检测该病毒的方法，可以快速检测苹果植株是否带有绿皱果病毒，为苹果无毒化苗木繁育、建园和生产奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测苹果绿皱果病毒的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供了用于检测苹果绿皱果病毒(Apple greencrinkle virus，AGrCV)的特异性PCR引物对，序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。

本发明还提供用于PCR扩增内参基因ER-1α的引物对，引物序列如SEQ ID NO:3-4所示。

本发明还提供含有所述引物对的检测试剂或试剂盒。

本发明进一步提供检测苹果绿皱果病毒方法，包括以下步骤：

1)提取待测苹果样品中的总RNA，反转录获得第一条cDNA链；

2)以步骤1)中获得的cDNA为模板，利用SEQ ID NO:1-4所示引物进行双重PCR反应；

3)分析PCR产物。

前述的方法，步骤1)具体为：提取待测苹果样品中的总RNA，向反应管中加入苹果样品RNA 13μL、20μM随机引物2μL，混匀，离心10-15秒，70℃变性10min，迅速冰上冷却3min；然后向体系中加入5×M-MLV缓冲液5μL、2.5mM dNTPs 2.5μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.7μL、200U/μL M-MLV反转录酶1.0μL和RNase-free Water 0.8μL，于42℃反应1h，即得第一条cDNA链。

本发明中，随机引物为5′-d(NNNNNN)-3′，N为A、G、C或T；由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

前述的方法，步骤2)进行双重PCR反应采用的反应体系为：2×Taq MasterMix 5.0μL，10μM引物SEQ ID NO:1-2各0.4μL，10μM引物SEQ ID NO:3-4各0.3μL，cDNA模板1.0μL、RNase-free Water 2.6μL。双重PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，33个循环；72℃5min。将PCR扩增产物于含有DNA荧光染料的1-1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分析，荧光成像仪记录样品电泳结果图像。

根据PCR产物核酸电泳的条带有无及大小判断带毒情况，具体为：如果电泳结果出现235bp和448bp两条特征条带(图1)，则待测样品中存在苹果绿皱果病毒；如果电泳结果仅出现235bp一条特征条带，则待测样品中不存在苹果绿皱果病毒；如果电泳结果没出现任一条上述特征条带，则检测操作有误。

前述方法中，待测苹果样品来自于苹果的叶片、枝条、花或果实。

采用本发明提供的特异性PCR引物对、双重PCR反应体系以及产物特征和结果判断标准，可以快速准确地检测苹果苗木是否带有绿皱果病毒，提高了绿皱果病毒检测的特异性，且检测低限达10拷贝/μL，为苗木早期病毒检测、无毒化苗木繁育及建园奠定技术基础。

附图说明

图1为苹果绿皱果病毒阳性样本的电泳结果示意图。其中，M，DNA分子量标准；泳道1，苹果内源基因EF1-α；泳道2，绿皱果病毒基因；泳道3，绿皱果病毒基因及ER-1α双重PCR扩增条带。

图2为本发明实施例1中苹果苗木绿皱果病毒病(AGrCV)实际样品检测电泳结果。其中，M，DNA分子量标准；泳道1-14，14份苹果样本绿皱果病毒基因及ER-1α双重PCR扩增条带。

图3为本发明实施例2中将本发明方法与已发表文献方法检测结果对比图。其中，A，已发表文献方法检测结果；B，本发明方法检测结果。M，DNA分子量标准；泳道1-6，6份苹果样本绿皱果病毒基因扩增条带。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 苹果苗木绿皱果病毒病(AGrCV)实际样品检测

1、特异性PCR引物设计与合成

苹果绿皱果病毒(AGrCV)与苹果茎痘病毒(ASPV)外壳蛋白基因(coat proteingene)核酸序列相似度较高，达70％-80％。本发明特异性PCR引物设计与合成参考Genbank中苹果AGrCV基因组序列(登录号NC_018714.1、HE963831.1、KT835289.1)保守区。引物设计时，除了必须遵循的引物设计原则之外，还注意引物不得与Genbank中所有的苹果ASPV病毒序列产生有效结合位点，从而区分AGrCV和ASPV，因此本发明在检测引物对设计上即排除了假阳性结果，所述特异性PCR引物对的序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。

2、用于PCR扩增内参基因ER-1α的引物对

用于PCR扩增内参基因ER-1α的引物对序列分别如SEQ ID NO:3-4所示。

3、2017年对北京地区苹果绿皱果病毒病带毒情况采用本方法进行了调查统计。具体过程如下：

1)2017年6月25日上午，采集4个果园(苗圃)的苹果叶片14份，立即液氮冻存，带回实验室备用。

2)当日下午，以14份待检苹果植株的叶片为试材，分别在研钵中液氮迅速研磨后取0.1g转入1.5mL离心管中；加入0.5mL RNA提取试剂(含2％β-巯基乙醇)进行组织裂解，经上柱吸附、DNaseI消化及漂洗等，最后加入30μL RNase-free水进行洗脱获得总RNA。

3)经反转录酶M-MLV和六碱基随机引物反转录合成cDNA。具体如下：向反应管中加入苹果样品总RNA 13μL、20μM浓度的六碱基随机引物2μL，混匀，离心10-15秒，70℃变性10min，迅速冰上冷却3min；然后向体系中加入5×M-MLV缓冲液5μL、2.5mM dNTPs 2.5μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.7μL、200U/μL M-MLV反转录酶1.0μL和RNase-free Water 0.8μL，42℃反应1h，即得第一条cDNA链。

4)双重PCR反应体系配置：2×Taq MasterMix 5.0μL，步骤3)制备的cDNA 1.0μL，10μM引物SEQ ID NO:1-2各0.4μL，10μM引物SEQ ID NO:3-4各0.3μL，RNase-free水2.6μL。

5)PCR反应程序为94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，33个循环；72℃5min；程序结束。

6)将PCR扩增产物于含有DNA染料的1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，120V电泳40min，最后根据电泳条带有无及大小判断带毒情况。内源基因ER-1α长度为235bp，绿皱果病毒基因长度为448bp。

7)检测结果显示，14份样本内源基因ER-1α均获得特异性扩增，各样本RNA提取及双重PCR操作可靠；7号、11号样本呈绿皱果病毒阴性，8号样本绿皱果病毒含量相对较低；14个样本中除7号、11号外，其他12个样本均带有绿皱果病毒(图2)。

实施例2 与现有检测方法比较

2017年于果园(苗圃)随机采集苹果叶片6份，并立即液氮冻存。RNA提取及病毒检测操作同实施例1。

检测结果显示，文献引物(Arch Virol,2017,162:299–306)检测出1号、4号、5号带有绿皱果病毒，检出率50％(图3A)；本发明中的苹果绿皱果病毒检测引物(SEQ ID NO:1-2)检测出1号、2号、4号、5号、6号带有绿皱果病毒，检出率83％(图3B)。由于该两种引物对检测为同一模板，因此从检测出条带的有无及丰度可以判断，本发明检测引物优于文献引物。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京市林业果树科学研究院

四川亿冠林农业开发有限公司

<120> 检测苹果绿皱果病毒的方法

<130> KHP171116368.4

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatgagaatc ctttggtgac atcttcac 28

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catgagctga aggactcact ccttg 25

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaaccttga ctggtacaag g 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggtgcatct caacagac 18

Claims (9)

1.用于检测苹果绿皱果病毒的特异性PCR引物对，其特征在于，序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。

2.含有权利要求1所述引物对的检测试剂或试剂盒。

3.根据权利要求2所述的检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述检测试剂或试剂盒中还包括用于PCR扩增内参基因ER-1α的引物对，序列分别如SEQ ID NO:3-4所示。

4.检测苹果绿皱果病毒方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测苹果样品中的总RNA，反转录获得第一条cDNA链；

2)以步骤1)中获得的cDNA为模板，利用权利要求1所述引物对和用于PCR扩增内参基因ER-1α的引物对，进行双重PCR反应；

3)分析PCR产物；

其中，步骤2)所述用于PCR扩增内参基因ER-1α的引物对同权利要求3所述。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为：提取待测苹果样品中的总RNA，向反应管中加入苹果样品RNA 13μL、20μM随机引物2μL，混匀，离心10-15秒，70℃变性10min，迅速冰上冷却3min；然后向体系中加入5×M-MLV缓冲液5μL、2.5mM dNTPs 2.5μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.7μL、200U/μL M-MLV反转录酶1.0μL和RNase-free Water 0.8μL，于42℃反应1h，即得第一条cDNA链。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)进行双重PCR反应采用的反应体系为：2×Taq MasterMix 5.0μL，10μM引物SEQ ID NO:1-2各0.4μL，10μM引物SEQ ID NO:3-4各0.3μL，cDNA模板1.0μL、RNase-free Water 2.6μL。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)进行双重PCR反应采用的反应条件为：94℃ 3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，33个循环；72℃ 5min。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)根据PCR产物核酸电泳的条带有无及大小判断带毒情况，具体为：如果电泳结果出现235bp和448bp两条特征条带，则待测样品中存在苹果绿皱果病毒；如果电泳结果仅出现235bp一条特征条带，则待测样品中不存在苹果绿皱果病毒；如果电泳结果没出现任一条上述特征条带，则检测操作有误。

9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其特征在于，待测苹果样品来自于苹果的叶片、枝条、花或果实。