JP3118572B2 - Ｒｔ−ｐｃｒによるカンキツタターリーフウイルス及びカンキツウイロイドの同時検出方法 - Google Patents
Ｒｔ−ｐｃｒによるカンキツタターリーフウイルス及びカンキツウイロイドの同時検出方法Info
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- JP3118572B2 JP3118572B2 JP11289356A JP28935699A JP3118572B2 JP 3118572 B2 JP3118572 B2 JP 3118572B2 JP 11289356 A JP11289356 A JP 11289356A JP 28935699 A JP28935699 A JP 28935699A JP 3118572 B2 JP3118572 B2 JP 3118572B2
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物ウイルス又は
ウイロイドの検出方法に関し、より詳細には、カンキツ
に感染性を有するカンキツタターリーフウイルス（ＣＴ
ＬＶ）及びカンキツウイロイドをＲＴ-ＰＣＲにより同
時検出するための特異的なプライマーに関する。
ウイロイドの検出方法に関し、より詳細には、カンキツ
に感染性を有するカンキツタターリーフウイルス（ＣＴ
ＬＶ）及びカンキツウイロイドをＲＴ-ＰＣＲにより同
時検出するための特異的なプライマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】カンキツタターリーフウイルス（ＣＴＬ
Ｖ）は、カラタチ台カンキツに接木部異常の症状を起こ
す病原体として知られている。また、カンキツウイロイ
ドには、カラタチ台木に剥皮や矮化の症状を示すカンキ
ツエクソコーティスウイロイド（ＣＥＶｄ）を始めとし
てカンキツウイロイド（ＣＶｄ）I、II、III、IV、V及
びVIの計７つのウイロイドグループが存在する。これら
のウイロイドのうち、ＣＶｄV及びVIは、本発明者らが
新たに発見したものである。
Ｖ）は、カラタチ台カンキツに接木部異常の症状を起こ
す病原体として知られている。また、カンキツウイロイ
ドには、カラタチ台木に剥皮や矮化の症状を示すカンキ
ツエクソコーティスウイロイド（ＣＥＶｄ）を始めとし
てカンキツウイロイド（ＣＶｄ）I、II、III、IV、V及
びVIの計７つのウイロイドグループが存在する。これら
のウイロイドのうち、ＣＶｄV及びVIは、本発明者らが
新たに発見したものである。
【０００３】これらの病原体感染の診断のために、これ
まで幾つかの手法が開発されている。ＣＴＬＶ感染の診
断法としては、抗血清を用いた診断が広く行われてお
り、また、その塩基配列に基づく遺伝子診断についても
報告されている（N. Yoshikawaら、Ann. Phytopathol.
Soc. Jpn., 62, 119-124 (1996)）。カンキツウイロイ
ド感染の診断法としては、ＣＶｄV及びVI以外のものに
ついては、各々個別の塩基配列に基づく個別の遺伝子診
断についての報告がある（X. Yangら、Phytopathology,
82, 279-285 (1992)、及び畑谷達児、植物防疫、第51
巻第4号、21-25 (1997)）。さらに、ＣＥＶｄ、ＣＶｄI
I及びIIIについては、これらの混合プライマーを用いて
２種のウイロイドを同時検出する診断が報告されている
（M. Tessitoriら、Proc. 13th Conf. IOCV., IOCV, Ri
verside, 230-235 (1996)）。
まで幾つかの手法が開発されている。ＣＴＬＶ感染の診
断法としては、抗血清を用いた診断が広く行われてお
り、また、その塩基配列に基づく遺伝子診断についても
報告されている（N. Yoshikawaら、Ann. Phytopathol.
Soc. Jpn., 62, 119-124 (1996)）。カンキツウイロイ
ド感染の診断法としては、ＣＶｄV及びVI以外のものに
ついては、各々個別の塩基配列に基づく個別の遺伝子診
断についての報告がある（X. Yangら、Phytopathology,
82, 279-285 (1992)、及び畑谷達児、植物防疫、第51
巻第4号、21-25 (1997)）。さらに、ＣＥＶｄ、ＣＶｄI
I及びIIIについては、これらの混合プライマーを用いて
２種のウイロイドを同時検出する診断が報告されている
（M. Tessitoriら、Proc. 13th Conf. IOCV., IOCV, Ri
verside, 230-235 (1996)）。
【０００４】しかし、カンキツ樹においては、上記のよ
うな多種類の病原体が一本の樹に同時に存在することが
多く、さらに一度に多数の樹木を診断することが多い。
このような場合に、病原体の検出を１種類又は２種類ず
つ別個に行うことは、時間、労力及びコストが多大とな
る。従って、上述の病原体のうちのできるだけ多くの種
類を同時に検出する方法は非常に有用であるということ
ができ、その開発が望まれているところである。
うな多種類の病原体が一本の樹に同時に存在することが
多く、さらに一度に多数の樹木を診断することが多い。
このような場合に、病原体の検出を１種類又は２種類ず
つ別個に行うことは、時間、労力及びコストが多大とな
る。従って、上述の病原体のうちのできるだけ多くの種
類を同時に検出する方法は非常に有用であるということ
ができ、その開発が望まれているところである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
ウイルス及びウイロイドのうちの３種以上を、遺伝子診
断の手法の一つであるＲＴ-ＰＣＲを用いて同時に検出
する方法、並びに該方法に使用することのできる核酸プ
ライマーセットを提供することにある。
ウイルス及びウイロイドのうちの３種以上を、遺伝子診
断の手法の一つであるＲＴ-ＰＣＲを用いて同時に検出
する方法、並びに該方法に使用することのできる核酸プ
ライマーセットを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意検討を行った結果、カンキツ樹から分
離したＲＮＡを鋳型として使用し、ＣＴＬＶ、ＣＥＶｄ
並びにＣＶｄI、II、III、IV、V及びVIの遺伝子ＲＮＡ
に特異的な核酸プライマーペア数種類を含む核酸プライ
マーセットを用いるＲＴ-ＰＣＲを行うことによって、
前記ウイルス及びウイロイドの３種以上を同時に検出判
定することに成功し、本発明を完成するに至った。
を達成すべく鋭意検討を行った結果、カンキツ樹から分
離したＲＮＡを鋳型として使用し、ＣＴＬＶ、ＣＥＶｄ
並びにＣＶｄI、II、III、IV、V及びVIの遺伝子ＲＮＡ
に特異的な核酸プライマーペア数種類を含む核酸プライ
マーセットを用いるＲＴ-ＰＣＲを行うことによって、
前記ウイルス及びウイロイドの３種以上を同時に検出判
定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、（ｉ）配列番号３の
塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号４の塩基配列
を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（ii）
配列番号５又は配列番号１９の塩基配列を含む核酸プラ
イマーと配列番号６又は配列番号２０の塩基配列を含む
核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（iii）配列
番号７の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号８又
は配列番号２１の塩基配列を含む核酸プライマーとの核
酸プライマーペア、（iv）配列番号９の塩基配列を含む
核酸プライマーと配列番号１０の塩基配列を含む核酸プ
ライマーとの核酸プライマーペア、（ｖ）配列番号１１
の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号１２の塩基
配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、
（vi）配列番号１３の塩基配列を含む核酸プライマーと
配列番号１４の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸
プライマーペア、（vii）配列番号１５の塩基配列を含
む核酸プライマーと配列番号１６の塩基配列を含む核酸
プライマーとの核酸プライマーペア、及び（viii）配列
番号１７の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号１
８の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマー
ペアからなる群より選択される少なくとも３種の核酸プ
ライマーペアを含む、カンキツタターリーフウイルス、
カンキツエクソコーティスウイロイド並びにカンキツウ
イロイドＩ、II、III、IV、V及びVIの少なくとも３種を
同時検出するための核酸プライマーセットを提供する。
前記核酸プライマーセットは、好ましくは前記（ｉ）〜
（viii）の核酸プライマーペアの全てを含む。
塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号４の塩基配列
を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（ii）
配列番号５又は配列番号１９の塩基配列を含む核酸プラ
イマーと配列番号６又は配列番号２０の塩基配列を含む
核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（iii）配列
番号７の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号８又
は配列番号２１の塩基配列を含む核酸プライマーとの核
酸プライマーペア、（iv）配列番号９の塩基配列を含む
核酸プライマーと配列番号１０の塩基配列を含む核酸プ
ライマーとの核酸プライマーペア、（ｖ）配列番号１１
の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号１２の塩基
配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、
（vi）配列番号１３の塩基配列を含む核酸プライマーと
配列番号１４の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸
プライマーペア、（vii）配列番号１５の塩基配列を含
む核酸プライマーと配列番号１６の塩基配列を含む核酸
プライマーとの核酸プライマーペア、及び（viii）配列
番号１７の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号１
８の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマー
ペアからなる群より選択される少なくとも３種の核酸プ
ライマーペアを含む、カンキツタターリーフウイルス、
カンキツエクソコーティスウイロイド並びにカンキツウ
イロイドＩ、II、III、IV、V及びVIの少なくとも３種を
同時検出するための核酸プライマーセットを提供する。
前記核酸プライマーセットは、好ましくは前記（ｉ）〜
（viii）の核酸プライマーペアの全てを含む。
【０００８】さらに、本発明は、被検植物に由来する核
酸が、（ｉ）配列番号３の塩基配列を含む核酸プライマ
ーと配列番号４の塩基配列を含む核酸プライマーとの核
酸プライマーペア、（ii）配列番号５又は配列番号１９
の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号６又は配列
番号２０の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プラ
イマーペア、（iii）配列番号７の塩基配列を含む核酸
プライマーと配列番号８又は配列番号２１の塩基配列を
含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（iv）配
列番号９の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号１
０の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマー
ペア、（ｖ）配列番号１１の塩基配列を含む核酸プライ
マーと配列番号１２の塩基配列を含む核酸プライマーと
の核酸プライマーペア、（vi）配列番号１３の塩基配列
を含む核酸プライマーと配列番号１４の塩基配列を含む
核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（vii）配列
番号１５の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号１
６の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマー
ペア、及び（viii）配列番号１７の塩基配列を含む核酸
プライマーと配列番号１８の塩基配列を含む核酸プライ
マーとの核酸プライマーペアからなる群より選択される
少なくとも３種の核酸プライマーペアを用いる増幅処理
により増幅されるか否かを調べることにより、被検植物
中におけるカンキツタターリーフウイルス、カンキツエ
クソコーティスウイロイド並びにカンキツウイロイド
Ｉ、II、III、IV、V及びVIの少なくとも３種の存否を同
時に決定することを含む、前記ウイルス及びウイロイド
の少なくとも３種を同時に検出する方法を提供する。前
記方法では、好ましくは前記（ｉ）〜（viii）の核酸プ
ライマーペアの全てを用いて、カンキツタターリーフウ
イルス、カンキツエクソコーティスウイロイド並びにカ
ンキツウイロイドＩ、II、III、IV、V及びVIを同時に検
出する。前記被検植物に由来する核酸は、好ましくは被
検植物中に存在するＲＮＡのｃＤＮＡである。
酸が、（ｉ）配列番号３の塩基配列を含む核酸プライマ
ーと配列番号４の塩基配列を含む核酸プライマーとの核
酸プライマーペア、（ii）配列番号５又は配列番号１９
の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号６又は配列
番号２０の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プラ
イマーペア、（iii）配列番号７の塩基配列を含む核酸
プライマーと配列番号８又は配列番号２１の塩基配列を
含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（iv）配
列番号９の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号１
０の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマー
ペア、（ｖ）配列番号１１の塩基配列を含む核酸プライ
マーと配列番号１２の塩基配列を含む核酸プライマーと
の核酸プライマーペア、（vi）配列番号１３の塩基配列
を含む核酸プライマーと配列番号１４の塩基配列を含む
核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（vii）配列
番号１５の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号１
６の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマー
ペア、及び（viii）配列番号１７の塩基配列を含む核酸
プライマーと配列番号１８の塩基配列を含む核酸プライ
マーとの核酸プライマーペアからなる群より選択される
少なくとも３種の核酸プライマーペアを用いる増幅処理
により増幅されるか否かを調べることにより、被検植物
中におけるカンキツタターリーフウイルス、カンキツエ
クソコーティスウイロイド並びにカンキツウイロイド
Ｉ、II、III、IV、V及びVIの少なくとも３種の存否を同
時に決定することを含む、前記ウイルス及びウイロイド
の少なくとも３種を同時に検出する方法を提供する。前
記方法では、好ましくは前記（ｉ）〜（viii）の核酸プ
ライマーペアの全てを用いて、カンキツタターリーフウ
イルス、カンキツエクソコーティスウイロイド並びにカ
ンキツウイロイドＩ、II、III、IV、V及びVIを同時に検
出する。前記被検植物に由来する核酸は、好ましくは被
検植物中に存在するＲＮＡのｃＤＮＡである。
【０００９】さらに、本発明は、（ｉ）配列番号３の塩
基配列を含む核酸プライマーと配列番号４の塩基配列を
含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（ii）配
列番号５又は配列番号１９の塩基配列を含む核酸プライ
マーと配列番号６又は配列番号２０の塩基配列を含む核
酸プライマーとの核酸プライマーペア、（iii）配列番
号７の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号８又は
配列番号２１の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸
プライマーペア、（iv）配列番号９の塩基配列を含む核
酸プライマーと配列番号１０の塩基配列を含む核酸プラ
イマーとの核酸プライマーペア、（ｖ）配列番号１１の
塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号１２の塩基配
列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（v
i）配列番号１３の塩基配列を含む核酸プライマーと配
列番号１４の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プ
ライマーペア、（vii）配列番号１５の塩基配列を含む
核酸プライマーと配列番号１６の塩基配列を含む核酸プ
ライマーとの核酸プライマーペア、及び（viii）配列番
号１７の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号１８
の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペ
アからなる群より選択される少なくとも３種の核酸プラ
イマーペアを含む、カンキツタターリーフウイルス、カ
ンキツエクソコーティスウイロイド並びにカンキツウイ
ロイドＩ、II、III、IV、V及びVIの少なくとも３種の同
時検出用キットを提供する。前記キットは、好ましくは
前記（ｉ）〜（viii）の核酸プライマーペアの全てを含
む。
基配列を含む核酸プライマーと配列番号４の塩基配列を
含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（ii）配
列番号５又は配列番号１９の塩基配列を含む核酸プライ
マーと配列番号６又は配列番号２０の塩基配列を含む核
酸プライマーとの核酸プライマーペア、（iii）配列番
号７の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号８又は
配列番号２１の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸
プライマーペア、（iv）配列番号９の塩基配列を含む核
酸プライマーと配列番号１０の塩基配列を含む核酸プラ
イマーとの核酸プライマーペア、（ｖ）配列番号１１の
塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号１２の塩基配
列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（v
i）配列番号１３の塩基配列を含む核酸プライマーと配
列番号１４の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プ
ライマーペア、（vii）配列番号１５の塩基配列を含む
核酸プライマーと配列番号１６の塩基配列を含む核酸プ
ライマーとの核酸プライマーペア、及び（viii）配列番
号１７の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号１８
の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペ
アからなる群より選択される少なくとも３種の核酸プラ
イマーペアを含む、カンキツタターリーフウイルス、カ
ンキツエクソコーティスウイロイド並びにカンキツウイ
ロイドＩ、II、III、IV、V及びVIの少なくとも３種の同
時検出用キットを提供する。前記キットは、好ましくは
前記（ｉ）〜（viii）の核酸プライマーペアの全てを含
む。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 １．本発明の方法 本発明の方法では、カンキツタターリーフウイルス（Ｃ
ＴＬＶ）、カンキツエクソコーティスウイロイド（ＣＥ
Ｖｄ）並びにカンキツウイロイド（ＣＶｄ）Ｉ、II、II
I、IV、V及びVIのそれぞれに特異的な核酸プライマーペ
アを用いて、被検植物から、前記ウイルス及びウイロイ
ドの少なくとも３種を同時に検出する。被検植物は特に
制限されるものではなく、いずれの種類の植物でもよい
が、好ましくはカンキツ樹である。「カンキツ」とは、
一般的にミカン科ミカン亜科（RutaceaeLignosae）に属
する植物を意味し、例としては、ウンシュウミカン、オ
レンジ、カラタチ等が挙げられる。
ＴＬＶ）、カンキツエクソコーティスウイロイド（ＣＥ
Ｖｄ）並びにカンキツウイロイド（ＣＶｄ）Ｉ、II、II
I、IV、V及びVIのそれぞれに特異的な核酸プライマーペ
アを用いて、被検植物から、前記ウイルス及びウイロイ
ドの少なくとも３種を同時に検出する。被検植物は特に
制限されるものではなく、いずれの種類の植物でもよい
が、好ましくはカンキツ樹である。「カンキツ」とは、
一般的にミカン科ミカン亜科（RutaceaeLignosae）に属
する植物を意味し、例としては、ウンシュウミカン、オ
レンジ、カラタチ等が挙げられる。
【００１１】上記のウイルス及びウイロイドのそれぞれ
に特異的な核酸プライマーペアは、それぞれのゲノムの
塩基配列に基づいて設計することができる。ＣＴＬＶ、
ＣＥＶｄ、並びにＣＶｄＩ、II、III及びIVのゲノムの
塩基配列としては、例えば、既に報告されているものを
挙げることができ、それらの塩基配列は下記表１に示す
アクセス番号でGenBankに登録されている。複数の配列
が登録されている場合には、それらの配列の間で変異の
見られない領域に基づいて、核酸プライマーペアを設計
することが好ましい。
に特異的な核酸プライマーペアは、それぞれのゲノムの
塩基配列に基づいて設計することができる。ＣＴＬＶ、
ＣＥＶｄ、並びにＣＶｄＩ、II、III及びIVのゲノムの
塩基配列としては、例えば、既に報告されているものを
挙げることができ、それらの塩基配列は下記表１に示す
アクセス番号でGenBankに登録されている。複数の配列
が登録されている場合には、それらの配列の間で変異の
見られない領域に基づいて、核酸プライマーペアを設計
することが好ましい。
【００１２】
【表１】
【００１３】ＣＶｄV及びVIの塩基配列としては、例え
ば、本発明者らが配列決定したものが挙げられ、その塩
基配列はそれぞれ配列番号１及び２に示されるが、これ
らに制限されるものではない。 上記核酸プライマーペ
アの設計は、使用する検出法の特徴を考慮して行う。例
えば、最終的に電気泳動法によって検出する場合には、
同時に検出するウイルス又はウイロイド由来のバンドが
相互に重ならないように、各核酸プライマーペア間の塩
基数を調整することができる。また、複数のウイルス又
はウイロイドに分析条件下でハイブリダイズする核酸プ
ライマーペアであっても、該核酸プライマーペア間の塩
基数が該ウイルス又はウイロイドの間で十分に異なって
いれば、使用することができる。ただし、このような場
合には、電気泳動法による検出において目的のバンド以
外のもの（ノイズ）が多数得られ、検出の精度が落ちる
可能性がある。従って、あるウイルス又はウイロイドに
分析条件下でハイブリダイズする核酸プライマーは、同
条件下において他のウイルス又はウイロイドにハイブリ
ダイズしないように設計することが好ましい。以上のよ
うにして、当業者であれば適切な核酸プライマーペアを
設計することができるため、各核酸プライマーの塩基配
列は特定のものに制限されないが、その具体例として
は、例えば、下記表２に示す塩基配列を挙げることがで
きる。
ば、本発明者らが配列決定したものが挙げられ、その塩
基配列はそれぞれ配列番号１及び２に示されるが、これ
らに制限されるものではない。 上記核酸プライマーペ
アの設計は、使用する検出法の特徴を考慮して行う。例
えば、最終的に電気泳動法によって検出する場合には、
同時に検出するウイルス又はウイロイド由来のバンドが
相互に重ならないように、各核酸プライマーペア間の塩
基数を調整することができる。また、複数のウイルス又
はウイロイドに分析条件下でハイブリダイズする核酸プ
ライマーペアであっても、該核酸プライマーペア間の塩
基数が該ウイルス又はウイロイドの間で十分に異なって
いれば、使用することができる。ただし、このような場
合には、電気泳動法による検出において目的のバンド以
外のもの（ノイズ）が多数得られ、検出の精度が落ちる
可能性がある。従って、あるウイルス又はウイロイドに
分析条件下でハイブリダイズする核酸プライマーは、同
条件下において他のウイルス又はウイロイドにハイブリ
ダイズしないように設計することが好ましい。以上のよ
うにして、当業者であれば適切な核酸プライマーペアを
設計することができるため、各核酸プライマーの塩基配
列は特定のものに制限されないが、その具体例として
は、例えば、下記表２に示す塩基配列を挙げることがで
きる。
【００１４】
【表２】
【００１５】表２において、CTLV-AP及びCTLV-AMからな
る核酸プライマーペアはＣＴＬＶを検出することがで
き、CEV-AP2及びCEV-AM2からなる核酸プライマーペアは
ＣＥＶｄを検出することができ、CBLV-AP2及びCBLV-CM
からなる核酸プライマーペアはＣＶｄＩを検出すること
ができ、CB2-AP及びCB2-CMからなる核酸プライマーペア
はＣＶｄVIを検出することができ、CV2-AP及びCV2-AMか
らなる核酸プライマーペアはＣＶｄIIを検出することが
でき、CV3-AP及びCV3-AMからなる核酸プライマーペアは
ＣＶｄIIIを検出することができ、CV4-AP4及びCV4-AM3
からなる核酸プライマーペアはＣＶｄIVを検出すること
ができ、CB3-AP及びCB3-AM6からなる核酸プライマーペ
アはＣＶｄＶを検出することができる。ここで、ＣＥＶ
ｄを検出するためには、CEV-AP2に代えてCEV-AP3を用い
ることができ、また、CEV-AM2に代えてCEV-AM3を用いる
ことができる。これらの核酸プライマーは、変異体間で
より高い保存性を有する塩基配列を含むため、検定漏れ
の危険性を減らす上で有利である。同様に、ＣＶｄＩを
検出するためには、上記のCBLV-CMに代えてCBLV-CM2を
用いることができ、該核酸プライマーもまた、同様の理
由により検定漏れの危険性を減らす上で有利である。
る核酸プライマーペアはＣＴＬＶを検出することがで
き、CEV-AP2及びCEV-AM2からなる核酸プライマーペアは
ＣＥＶｄを検出することができ、CBLV-AP2及びCBLV-CM
からなる核酸プライマーペアはＣＶｄＩを検出すること
ができ、CB2-AP及びCB2-CMからなる核酸プライマーペア
はＣＶｄVIを検出することができ、CV2-AP及びCV2-AMか
らなる核酸プライマーペアはＣＶｄIIを検出することが
でき、CV3-AP及びCV3-AMからなる核酸プライマーペアは
ＣＶｄIIIを検出することができ、CV4-AP4及びCV4-AM3
からなる核酸プライマーペアはＣＶｄIVを検出すること
ができ、CB3-AP及びCB3-AM6からなる核酸プライマーペ
アはＣＶｄＶを検出することができる。ここで、ＣＥＶ
ｄを検出するためには、CEV-AP2に代えてCEV-AP3を用い
ることができ、また、CEV-AM2に代えてCEV-AM3を用いる
ことができる。これらの核酸プライマーは、変異体間で
より高い保存性を有する塩基配列を含むため、検定漏れ
の危険性を減らす上で有利である。同様に、ＣＶｄＩを
検出するためには、上記のCBLV-CMに代えてCBLV-CM2を
用いることができ、該核酸プライマーもまた、同様の理
由により検定漏れの危険性を減らす上で有利である。
【００１６】上記ウイルス及びウイロイドの３種以上の
同時検出は、被検植物に由来する核酸が上述の核酸プラ
イマーペアの３種以上を用いる増幅処理によって増幅さ
れるか否かを調べることにより行う。上記の被検植物に
由来する核酸は、該被検植物中に含まれる核酸又はそれ
から誘導される核酸であればよく、特に制限されない
が、好ましくは、該被検植物中に含まれるＲＮＡ由来の
ｃＤＮＡである。上記の被検植物に由来する核酸は、公
知の核酸抽出法によって得ることができる。このような
核酸抽出法は、市販のキットを用いて行ってもよく、被
検植物から全ＲＮＡを抽出する場合には、例えば、ＩＳ
ＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いることができ
る。核酸抽出に用いる被検植物の部位は、核酸を含んで
いればいずれの部位でもよいが、好ましくは新梢部分で
ある。
同時検出は、被検植物に由来する核酸が上述の核酸プラ
イマーペアの３種以上を用いる増幅処理によって増幅さ
れるか否かを調べることにより行う。上記の被検植物に
由来する核酸は、該被検植物中に含まれる核酸又はそれ
から誘導される核酸であればよく、特に制限されない
が、好ましくは、該被検植物中に含まれるＲＮＡ由来の
ｃＤＮＡである。上記の被検植物に由来する核酸は、公
知の核酸抽出法によって得ることができる。このような
核酸抽出法は、市販のキットを用いて行ってもよく、被
検植物から全ＲＮＡを抽出する場合には、例えば、ＩＳ
ＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いることができ
る。核酸抽出に用いる被検植物の部位は、核酸を含んで
いればいずれの部位でもよいが、好ましくは新梢部分で
ある。
【００１７】上記の被検植物に由来する核酸として上記
ｃＤＮＡを用いる場合には、上述のようにして被検植物
からＲＮＡを抽出した後に、公知の方法を用いて該ＲＮ
ＡからｃＤＮＡを合成するとよい。このようなｃＤＮＡ
合成は、First-Strand cDNASynthesis Kit（アマシャム
ファルマシアバイオテク社製）などの市販のキットを用
いて行うこともできる。
ｃＤＮＡを用いる場合には、上述のようにして被検植物
からＲＮＡを抽出した後に、公知の方法を用いて該ＲＮ
ＡからｃＤＮＡを合成するとよい。このようなｃＤＮＡ
合成は、First-Strand cDNASynthesis Kit（アマシャム
ファルマシアバイオテク社製）などの市販のキットを用
いて行うこともできる。
【００１８】上記増幅処理は、通常、ＰＣＲ（ポリメラ
ーゼ連鎖反応）によって行う。該ＰＣＲにおいては、上
述の核酸プライマーペアを使用することができる。その
他の試薬、反応条件（反応温度、反応時間など）等は、
当業者であれば適切に選択することができる。また、こ
のようなＰＣＲは、公知の装置を用いて行うことができ
る。
ーゼ連鎖反応）によって行う。該ＰＣＲにおいては、上
述の核酸プライマーペアを使用することができる。その
他の試薬、反応条件（反応温度、反応時間など）等は、
当業者であれば適切に選択することができる。また、こ
のようなＰＣＲは、公知の装置を用いて行うことができ
る。
【００１９】以上のような増幅処理によって得られる増
幅産物は、電気泳動法などの公知の方法によって検出す
ることができる。このような方法の実施に必要な条件等
は、当業者であれば適切に選択することができる。電気
泳動法によって検出を行う場合には、上記ウイルス及び
ウイロイドに特異的な断片は、それぞれ泳動度の異なる
断片として確認することができ、それらの特異的断片の
有無により各ウイルス及びウイロイドの保毒を確認する
ことができる。
幅産物は、電気泳動法などの公知の方法によって検出す
ることができる。このような方法の実施に必要な条件等
は、当業者であれば適切に選択することができる。電気
泳動法によって検出を行う場合には、上記ウイルス及び
ウイロイドに特異的な断片は、それぞれ泳動度の異なる
断片として確認することができ、それらの特異的断片の
有無により各ウイルス及びウイロイドの保毒を確認する
ことができる。
【００２０】上記表２に示す核酸プライマーペアを用い
て上記ＰＣＲを行った場合には、ＣＴＬＶについては約
４５５塩基、ＣＥＶｄについては約３７０塩基、ＣＶｄ
Iについては約２３０塩基、ＣＶｄIIについては約３０
０塩基、ＣＶｄIIIについては約２８５塩基、ＣＶｄIV
については約２１０塩基、ＣＶｄVについては約１７０
塩基、及びＣＶｄVIについては約２５０塩基の増幅断片
が検出される。
て上記ＰＣＲを行った場合には、ＣＴＬＶについては約
４５５塩基、ＣＥＶｄについては約３７０塩基、ＣＶｄ
Iについては約２３０塩基、ＣＶｄIIについては約３０
０塩基、ＣＶｄIIIについては約２８５塩基、ＣＶｄIV
については約２１０塩基、ＣＶｄVについては約１７０
塩基、及びＣＶｄVIについては約２５０塩基の増幅断片
が検出される。
【００２１】２．本発明のキット 本発明のキットは、ＣＴＬＶ、ＣＥＶｄ並びにＣＶｄ
Ｉ、II、III、IV、V及びVIのそれぞれに特異的な核酸プ
ライマーペアから選択される少なくとも３種の核酸プラ
イマーペアを含む。本発明のキットを使用することによ
り、被検植物から、前記ウイルス及びウイロイドの少な
くとも３種を同時に検出することができる。
Ｉ、II、III、IV、V及びVIのそれぞれに特異的な核酸プ
ライマーペアから選択される少なくとも３種の核酸プラ
イマーペアを含む。本発明のキットを使用することによ
り、被検植物から、前記ウイルス及びウイロイドの少な
くとも３種を同時に検出することができる。
【００２２】本発明のキットは、さらに必要に応じて、
ISOGEN、クロロホルム、イソプロパノール、エタノール
などのＲＮＡ抽出用試薬、逆転写酵素、MgCl2、ＲＮＡ
PCR用緩衝液、ＲＮase Free dH2O 2.5ml、dNTP混合物、
ＲＮａｓｅ阻害剤などの逆転写反応用試薬（プライマー
を除く）、MgCl2、ＲＮＡ PCR用緩衝液、滅菌蒸留水、
ＤＮＡポリメラーゼなどのPCR反応用試薬（プライマー
を除く）、染色剤、電気泳動用ゲルなどの検出用試薬な
どを含んでもよい。また、本発明のキットは、各種プラ
イマー及び各種試薬を用いて上記ウイルス及びウイロイ
ドを検出するための説明書を含んでもよい。
ISOGEN、クロロホルム、イソプロパノール、エタノール
などのＲＮＡ抽出用試薬、逆転写酵素、MgCl2、ＲＮＡ
PCR用緩衝液、ＲＮase Free dH2O 2.5ml、dNTP混合物、
ＲＮａｓｅ阻害剤などの逆転写反応用試薬（プライマー
を除く）、MgCl2、ＲＮＡ PCR用緩衝液、滅菌蒸留水、
ＤＮＡポリメラーゼなどのPCR反応用試薬（プライマー
を除く）、染色剤、電気泳動用ゲルなどの検出用試薬な
どを含んでもよい。また、本発明のキットは、各種プラ
イマー及び各種試薬を用いて上記ウイルス及びウイロイ
ドを検出するための説明書を含んでもよい。
【００２３】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕 ＲＴ-ＰＣＲによるＣＴＬＶ及び７種カ
ンキツウイロイド（ＣＥＶｄ、ＣＶｄI、II、III、IV、
V及びVI）の同時検出（１） ＣＴＬＶ及び３種カンキツウイロイド（ＣＶｄII、III
及びV）を感染させたエトログシトロン、並びにＣＴＬ
Ｖ及び７種カンキツウイロイド（ＣＥＶｄ、ＣＶｄI、I
I、III、IV、V及びVI）を感染させたエトログシトロン
を対象として、ＣＴＬＶ及び７種カンキツウイロイドの
同時検出を行った。対照区では、健全エトログシトロン
を対象として上記検出を行った。なお、各種ウイルス又
はウイロイドのカンキツ樹への感染は、接木接種するこ
とによって行った。
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕 ＲＴ-ＰＣＲによるＣＴＬＶ及び７種カ
ンキツウイロイド（ＣＥＶｄ、ＣＶｄI、II、III、IV、
V及びVI）の同時検出（１） ＣＴＬＶ及び３種カンキツウイロイド（ＣＶｄII、III
及びV）を感染させたエトログシトロン、並びにＣＴＬ
Ｖ及び７種カンキツウイロイド（ＣＥＶｄ、ＣＶｄI、I
I、III、IV、V及びVI）を感染させたエトログシトロン
を対象として、ＣＴＬＶ及び７種カンキツウイロイドの
同時検出を行った。対照区では、健全エトログシトロン
を対象として上記検出を行った。なお、各種ウイルス又
はウイロイドのカンキツ樹への感染は、接木接種するこ
とによって行った。
【００２４】検定すべきカンキツ樹の新梢部分を0.05〜
0.1g採集し、この新梢部分試料から、ＩＳＯＧＥＮ（ニ
ッポンジーン社製）を用い、説明書に従って全ＲＮＡを
抽出した。この全ＲＮＡ抽出液１μｌ（全ＲＮＡ約１μ
ｇに相当）を９５℃で５分間インキュベートした後に急
冷することにより熱変性を行い、ＲＮＡの２次構造を解
消した。この溶液を用い、First-Strand cDNA Synthesi
s Kit（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用
い、添付のランダムヘキサマーを使用して、説明書に従
ってｃＤＮＡを合成した。
0.1g採集し、この新梢部分試料から、ＩＳＯＧＥＮ（ニ
ッポンジーン社製）を用い、説明書に従って全ＲＮＡを
抽出した。この全ＲＮＡ抽出液１μｌ（全ＲＮＡ約１μ
ｇに相当）を９５℃で５分間インキュベートした後に急
冷することにより熱変性を行い、ＲＮＡの２次構造を解
消した。この溶液を用い、First-Strand cDNA Synthesi
s Kit（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用
い、添付のランダムヘキサマーを使用して、説明書に従
ってｃＤＮＡを合成した。
【００２５】次いで、そのｃＤＮＡを鋳型として用い、
表２中の配列番号３〜１８に示される塩基配列を有する
１６種の核酸プライマーからなるプライマーセット及び
Ampli Taq Gold（Perkin Elmer社）を用い、説明書に従
ってＰＣＲを行った。このＰＣＲは、ＤＮＡサーマルサ
イクラー４８０型（Perkin Elmer社）を使用し、９４℃
で１０分間-６２℃で１０秒間-７２℃で１０秒間を１サ
イクル、９４℃で３０秒間（変性）-６２℃で１０秒間
（アニーリング）-７２℃で１０秒間（伸長）を３４サ
イクル、そして７２℃で５分間-１５℃で５分間を１サ
イクルの反応を行った。
表２中の配列番号３〜１８に示される塩基配列を有する
１６種の核酸プライマーからなるプライマーセット及び
Ampli Taq Gold（Perkin Elmer社）を用い、説明書に従
ってＰＣＲを行った。このＰＣＲは、ＤＮＡサーマルサ
イクラー４８０型（Perkin Elmer社）を使用し、９４℃
で１０分間-６２℃で１０秒間-７２℃で１０秒間を１サ
イクル、９４℃で３０秒間（変性）-６２℃で１０秒間
（アニーリング）-７２℃で１０秒間（伸長）を３４サ
イクル、そして７２℃で５分間-１５℃で５分間を１サ
イクルの反応を行った。
【００２６】以上のようにして得られたＰＣＲ産物をＤ
ＮＡサイズマーカーとともに６％ポリアクリルアミドゲ
ルにローディングし、８０Ｖで１時間４５分電気泳動し
た後に、銀染色法により染色した。こうして得られた電
気泳動写真を図１に示した。図１において、ＣＴＬＶの
場合は約４５５塩基、ＣＥＶｄの場合は約３７０塩基、
ＣＶｄIの場合は約２３０塩基、ＣＶｄIIの場合は約３
００塩基、ＣＶｄIIIの場合は約２８５塩基、ＣＶｄIV
の場合は約２１０塩基、ＣＶｄV の場合は約１７０塩
基、そしてＣＶｄVIの場合は約２５０塩基の特異的断片
の有無を確認することにより、これらのウイロイドを検
出することができた。
ＮＡサイズマーカーとともに６％ポリアクリルアミドゲ
ルにローディングし、８０Ｖで１時間４５分電気泳動し
た後に、銀染色法により染色した。こうして得られた電
気泳動写真を図１に示した。図１において、ＣＴＬＶの
場合は約４５５塩基、ＣＥＶｄの場合は約３７０塩基、
ＣＶｄIの場合は約２３０塩基、ＣＶｄIIの場合は約３
００塩基、ＣＶｄIIIの場合は約２８５塩基、ＣＶｄIV
の場合は約２１０塩基、ＣＶｄV の場合は約１７０塩
基、そしてＣＶｄVIの場合は約２５０塩基の特異的断片
の有無を確認することにより、これらのウイロイドを検
出することができた。
【００２７】〔実施例２〕 ＲＴ-ＰＣＲによるＣＴＬ
Ｖ及び７種カンキツウイロイド（ＣＥＶｄ、ＣＶｄI、I
I、III、IV、V及びVI）の同時検出（２） 長崎レモン、長崎不知火、熊本不知火、和歌山不知火、
茎頂接木不知火、長崎上野早生、福岡伊都早生、愛媛清
見、静岡温州、熊本オレンジ、沖縄タンカン、福岡オレ
ンジ及び静岡タンゼロの各カンキツ樹を対象として、Ｃ
ＴＬＶ及び７種カンキツウイロイドの同時検出を行っ
た。対照区では、健全エトログシトロンを対象として上
記検出を行った。
Ｖ及び７種カンキツウイロイド（ＣＥＶｄ、ＣＶｄI、I
I、III、IV、V及びVI）の同時検出（２） 長崎レモン、長崎不知火、熊本不知火、和歌山不知火、
茎頂接木不知火、長崎上野早生、福岡伊都早生、愛媛清
見、静岡温州、熊本オレンジ、沖縄タンカン、福岡オレ
ンジ及び静岡タンゼロの各カンキツ樹を対象として、Ｃ
ＴＬＶ及び７種カンキツウイロイドの同時検出を行っ
た。対照区では、健全エトログシトロンを対象として上
記検出を行った。
【００２８】検定すべきカンキツ樹の新梢部分を0.05〜
0.1g採集し、この新梢部分試料から、ＩＳＯＧＥＮ（ニ
ッポンジーン社製）を用い、説明書に従って全ＲＮＡを
抽出した。この全ＲＮＡ抽出液１μｌ（全ＲＮＡ約１μ
ｇに相当）を９５℃で５分間インキュベートした後に急
冷することにより熱変性を行い、ＲＮＡの２次構造を解
消した。この溶液を用い、First-Strand cDNA Synthesi
s Kit（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用
い、添付のランダムヘキサマーを使用して、説明書に従
ってｃＤＮＡを合成した。
0.1g採集し、この新梢部分試料から、ＩＳＯＧＥＮ（ニ
ッポンジーン社製）を用い、説明書に従って全ＲＮＡを
抽出した。この全ＲＮＡ抽出液１μｌ（全ＲＮＡ約１μ
ｇに相当）を９５℃で５分間インキュベートした後に急
冷することにより熱変性を行い、ＲＮＡの２次構造を解
消した。この溶液を用い、First-Strand cDNA Synthesi
s Kit（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用
い、添付のランダムヘキサマーを使用して、説明書に従
ってｃＤＮＡを合成した。
【００２９】次いで、そのｃＤＮＡを鋳型として用い、
実施例１で使用した１６種のプライマーからなるプライ
マーセット及びAmpli Taq Gold（Perkin Elmer社）を用
い、説明書に従ってＰＣＲを行った。このＰＣＲは、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー４８０型（Perkin Elmer社）を
使用し、９４℃で１０分間-６２℃で１０秒間-７２℃で
１０秒間を１サイクル、９４℃で３０秒間（変性）-６
２℃で１０秒間（アニーリング）-７２℃で１０秒間
（伸長）を３４サイクル、そして７２℃で５分間-１５
℃で５分間を１サイクルの反応を行った。
実施例１で使用した１６種のプライマーからなるプライ
マーセット及びAmpli Taq Gold（Perkin Elmer社）を用
い、説明書に従ってＰＣＲを行った。このＰＣＲは、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー４８０型（Perkin Elmer社）を
使用し、９４℃で１０分間-６２℃で１０秒間-７２℃で
１０秒間を１サイクル、９４℃で３０秒間（変性）-６
２℃で１０秒間（アニーリング）-７２℃で１０秒間
（伸長）を３４サイクル、そして７２℃で５分間-１５
℃で５分間を１サイクルの反応を行った。
【００３０】以上のようにして得られたＰＣＲ産物をＤ
ＮＡサイズマーカーとともに６％ポリアクリルアミドゲ
ルにローディングし、８０Ｖで１時間４５分電気泳動し
た後に、銀染色法により染色した。こうして得られた電
気泳動写真を図２に示した。図２において、ＣＥＶｄの
場合は約３７０塩基、ＣＶｄIの場合は約２３０塩基、
ＣＶｄIIの場合は約３００塩基、ＣＶｄIIIの場合は約
２８５塩基、ＣＶｄIVの場合は約２１０塩基、ＣＶｄV
の場合は約１７０塩基、そしてＣＶｄVIの場合は約２５
０塩基の特異的断片の有無を確認することにより、これ
らのウイロイドを検出することができた。なお、本実施
例では、ＣＴＬＶは検出されなかった。
ＮＡサイズマーカーとともに６％ポリアクリルアミドゲ
ルにローディングし、８０Ｖで１時間４５分電気泳動し
た後に、銀染色法により染色した。こうして得られた電
気泳動写真を図２に示した。図２において、ＣＥＶｄの
場合は約３７０塩基、ＣＶｄIの場合は約２３０塩基、
ＣＶｄIIの場合は約３００塩基、ＣＶｄIIIの場合は約
２８５塩基、ＣＶｄIVの場合は約２１０塩基、ＣＶｄV
の場合は約１７０塩基、そしてＣＶｄVIの場合は約２５
０塩基の特異的断片の有無を確認することにより、これ
らのウイロイドを検出することができた。なお、本実施
例では、ＣＴＬＶは検出されなかった。
【００３１】〔実施例３〕 ＲＴ-ＰＣＲによるＣＴＬ
Ｖ及び７種カンキツウイロイド（ＣＥＶｄ、ＣＶｄI、I
I、III、IV、V及びVI）の同時検出（３） 実施例１及び２において用いたプライマーセットにおい
て、CEV-AP2、CEV-AM2及びCBLV-CMに代えてCEV-AP3、CE
V-AM3及びCBLV-CM2を混合したプライマーセットを用い
て、実施例１及び２と同様の検出を行った。その結果、
それぞれの実施例と同様の結果が得られた（データ示さ
ず）。
Ｖ及び７種カンキツウイロイド（ＣＥＶｄ、ＣＶｄI、I
I、III、IV、V及びVI）の同時検出（３） 実施例１及び２において用いたプライマーセットにおい
て、CEV-AP2、CEV-AM2及びCBLV-CMに代えてCEV-AP3、CE
V-AM3及びCBLV-CM2を混合したプライマーセットを用い
て、実施例１及び２と同様の検出を行った。その結果、
それぞれの実施例と同様の結果が得られた（データ示さ
ず）。
【００３２】
【発明の効果】本発明により、カンキツタターリーフウ
イルス（ＣＴＬＶ）及びカンキツウイロイドの同時検出
が可能になり、これらの病原体の検出に要する費用、労
力及び時間が大幅に減少する。さらに、本発明により、
上記病原体に感染したカンキツ樹の早期診断や迅速な幼
苗検定が可能となるため、ウイロイドフリーのカンキツ
苗木供給が容易になる。
イルス（ＣＴＬＶ）及びカンキツウイロイドの同時検出
が可能になり、これらの病原体の検出に要する費用、労
力及び時間が大幅に減少する。さらに、本発明により、
上記病原体に感染したカンキツ樹の早期診断や迅速な幼
苗検定が可能となるため、ウイロイドフリーのカンキツ
苗木供給が容易になる。
【００３３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tohru Maotani, Director-General of National Institute of Fruit Tree Science, Ministry Of Agriculture, Forestry And Fisheries <120> Simultaneous Detection of Citrus Tatter Leaf Virus and 7 Citrus Viroid Species <130> P99-0487 <150> JP 10-288954 <151> 1998-10-12 <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 331 <212> RNA <213> Citrus Viroid V <400> 1 cggaggaaac uccguguggu uccugugggu caccccccgg cacccucuaa agaaaagaaa 60 gguaaggaga acucaccugu cgucgucgac gaaggcaugu gagcuucaaa cucgaugaag 120 agcgucagcg gacggccucu gagacgagcg auggacagua gagcucgucu cuaccagucg 180 cgugcugacu cucacgccca cccgcacggc ugcuccgaga gugagagcuc ucugccgcua 240 gucgagcgga cuccagagug acucucccac ccuauuuuca gcggagagcc ggcgguggag 300 uccccagggu aaaacacgau ugguguuucc c 331 <210> 2 <211> 327 <212> RNA <213> Citrus Viroid VI <400> 2 cggagacuuc uugugguucc uguggugaca ccccucagcc cuaccugcga aagaaaaaag 60 ucauuagaag gcgccagagg agacugagcg gucgucgucg acgaaggcuc cucagucgca 120 gagcgccgcu ggaucgacug gccuccggug gaaaacgaag auucgucuuc aauuucugua 180 accggaccgg ucuccuucgg ccgccgagcg cugguugccg cuagucgagc ggacuuccgu 240 cucuacccuc ccgaggcgcu uuucucacug accgacuucc guagcagcgg ggagagggug 300 aagcccugug aaccccugag ggcuccu 327 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Tatter Leaf Virus gene <400> 3 cctgaattga aaacctttgc tgccactt 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Tatter Leaf Virus gene <400> 4 tagaaaaacc acactaaccc ggaaatgc 28 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Exocortis Viroid gene <400> 5 gggaaacctg gaggaagtcg aggt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Exocortis Viroid gene <400> 6 cggggatccc tgaaggactt cttc 24 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Viroid I gene <400> 7 tccccttcac ccgagcgctg c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Viroid I gene <400> 8 acgaccagtc agctcctctg 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Viroid VI gene <400> 9 ctgtaaccgg accggtctcc ttc 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Viroid VI gene <400> 10 acgaccgctc agtctcctct 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Viroid II gene <400> 11 ggcaactctt ctcagaatcc agc 23 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Viroid II gene <400> 12 ccggggctcc tttctcaggt aagt 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Viroid III gene <400> 13 ctccgctagt cggaaagact ccgc 24 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Viroid III gene <400> 14 tcaccaactt agctgccttc gtc 23 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Viroid IV gene <400> 15 tctggggaat ttctctgcgg gacc 24 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Viroid IV gene <400> 16 tctatctcag gtcgcgaagg aagaagc 27 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Viroid V gene <400> 17 cgtcgacgaa ggcatgtgag ctt 23 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Viroid V gene <400> 18 gtccgctcga ctagcggcag agagc 25 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Exocortis Viroid gene <400> 19 ggaaacctgg aggaagtcga g 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Exocortis Viroid gene <400> 20 ccggggatcc ctgaaggact t 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Citrus Viroid I gene <400> 21 tcgacgacga ccagtcagct 20
【００３４】
【００３５】
【配列番号３及び４】 カンキツタターリーフウイルス
遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドで
ある。
遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドで
ある。
【００３６】
【配列番号５及び６】 カンキツエクソコーティスウイ
ロイド遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオ
チドである。
ロイド遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオ
チドである。
【００３７】
【配列番号７及び８】 カンキツウイロイドＩ遺伝子の
配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。
配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。
【００３８】
【配列番号９及び１０】 カンキツウイロイドVI遺伝子
の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。
の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。
【００３９】
【配列番号１１及び１２】 カンキツウイロイドII遺伝
子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドであ
る。
子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドであ
る。
【００４０】
【配列番号１３及び１４】 カンキツウイロイドIII遺
伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドであ
る。
伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドであ
る。
【００４１】
【配列番号１５及び１６】 カンキツウイロイドIV遺伝
子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドであ
る。
子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドであ
る。
【００４２】
【配列番号１７及び１８】 カンキツウイロイドＶ遺伝
子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドであ
る。
子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドであ
る。
【００４３】
【配列番号１９及び２０】 カンキツエクソコーティス
ウイロイド遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌク
レオチドである。
ウイロイド遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌク
レオチドである。
【００４４】
【配列番号２１】 カンキツウイロイドＩ遺伝子の配列
に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。
に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。
【図１】本発明の方法により行ったＣＴＬＶ、ＣＥＶｄ
並びにＣＶｄＩ、II、III、IV、V及びVIの同時検出の結
果を示す電気泳動写真である。
並びにＣＶｄＩ、II、III、IV、V及びVIの同時検出の結
果を示す電気泳動写真である。
【図２】本発明の方法により行ったＣＴＬＶ、ＣＥＶｄ
並びにＣＶｄＩ、II、III、IV、V及びVIの同時検出の結
果を示す電気泳動写真である。
並びにＣＶｄＩ、II、III、IV、V及びVIの同時検出の結
果を示す電気泳動写真である。
フロントページの続き (56)参考文献 特表 平１−503356（ＪＰ，Ａ) Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ, 1992，Ｖｏｌ．82，Ｎｏ．３，ｐ．279 −285 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，1994，Ｖ ｏｌ．75，Ｎｏ．12，ｐ．3581−3584 Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｊｕｌｙ. 1998，Ｖｏｌ．143，Ｎｏ．５，ｐ．971 −980 Ｐｒｏｃ．13ｔｈ Ｃｏｎｆ．ＩＯＣ Ｖ．，ＩＯＣＶ，Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ, 1996，ｐ．230−235 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 （ｉ）配列番号３の塩基配列を含む核酸
プライマーと配列番号４の塩基配列を含む核酸プライマ
ーとの核酸プライマーペア、（ii）配列番号５又は配列
番号１９の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号６
又は配列番号２０の塩基配列を含む核酸プライマーとの
核酸プライマーペア、（iii）配列番号７の塩基配列を
含む核酸プライマーと配列番号８又は配列番号２１の塩
基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、
（iv）配列番号９の塩基配列を含む核酸プライマーと配
列番号１０の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プ
ライマーペア、（ｖ）配列番号１１の塩基配列を含む核
酸プライマーと配列番号１２の塩基配列を含む核酸プラ
イマーとの核酸プライマーペア、（vi）配列番号１３の
塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号１４の塩基配
列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（vi
i）配列番号１５の塩基配列を含む核酸プライマーと配
列番号１６の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プ
ライマーペア、及び（viii）配列番号１７の塩基配列を
含む核酸プライマーと配列番号１８の塩基配列を含む核
酸プライマーとの核酸プライマーペアからなる群より選
択される少なくとも３種の核酸プライマーペアを含む、
カンキツタターリーフウイルス、カンキツエクソコーテ
ィスウイロイド並びにカンキツウイロイドＩ、II、II
I、IV、V及びVIの少なくとも３種を同時検出するための
核酸プライマーセット。 - 【請求項２】 前記（ｉ）〜（viii）の核酸プライマー
ペアの全てを含む請求項１記載の核酸プライマーセッ
ト。 - 【請求項３】 被検植物に由来する核酸が、（ｉ）配列
番号３の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号４の
塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペ
ア、（ii）配列番号５又は配列番号１９の塩基配列を含
む核酸プライマーと配列番号６又は配列番号２０の塩基
配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、
（iii）配列番号７の塩基配列を含む核酸プライマーと
配列番号８又は配列番号２１の塩基配列を含む核酸プラ
イマーとの核酸プライマーペア、（iv）配列番号９の塩
基配列を含む核酸プライマーと配列番号１０の塩基配列
を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（ｖ）
配列番号１１の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番
号１２の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライ
マーペア、（vi）配列番号１３の塩基配列を含む核酸プ
ライマーと配列番号１４の塩基配列を含む核酸プライマ
ーとの核酸プライマーペア、（vii）配列番号１５の塩
基配列を含む核酸プライマーと配列番号１６の塩基配列
を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、及び
（viii）配列番号１７の塩基配列を含む核酸プライマー
と配列番号１８の塩基配列を含む核酸プライマーとの核
酸プライマーペアからなる群より選択される少なくとも
３種の核酸プライマーペアを用いる増幅処理により増幅
されるか否かを調べることにより、被検植物中における
カンキツタターリーフウイルス、カンキツエクソコーテ
ィスウイロイド並びにカンキツウイロイドＩ、II、II
I、IV、V及びVIの少なくとも３種の存否を同時に決定す
ることを含む、前記ウイルス及びウイロイドの少なくと
も３種を同時に検出する方法。 - 【請求項４】 前記（ｉ）〜（viii）の核酸プライマー
ペアの全てを用いて、カンキツタターリーフウイルス、
カンキツエクソコーティスウイロイド並びにカンキツウ
イロイドＩ、II、III、IV、V及びVIを同時に検出する請
求項３記載の方法。 - 【請求項５】 被検植物に由来する核酸が、被検植物中
に存在するＲＮＡのｃＤＮＡである請求項３記載の方
法。 - 【請求項６】 （ｉ）配列番号３の塩基配列を含む核酸
プライマーと配列番号４の塩基配列を含む核酸プライマ
ーとの核酸プライマーペア、（ii）配列番号５又は配列
番号１９の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号６
又は配列番号２０の塩基配列を含む核酸プライマーとの
核酸プライマーペア、（iii）配列番号７の塩基配列を
含む核酸プライマーと配列番号８又は配列番号２１の塩
基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、
（iv）配列番号９の塩基配列を含む核酸プライマーと配
列番号１０の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プ
ライマーペア、（ｖ）配列番号１１の塩基配列を含む核
酸プライマーと配列番号１２の塩基配列を含む核酸プラ
イマーとの核酸プライマーペア、（vi）配列番号１３の
塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号１４の塩基配
列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、（vi
i）配列番号１５の塩基配列を含む核酸プライマーと配
列番号１６の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プ
ライマーペア、及び（viii）配列番号１７の塩基配列を
含む核酸プライマーと配列番号１８の塩基配列を含む核
酸プライマーとの核酸プライマーペアからなる群より選
択される少なくとも３種の核酸プライマーペアを含む、
カンキツタターリーフウイルス、カンキツエクソコーテ
ィスウイロイド並びにカンキツウイロイドＩ、II、II
I、IV、V及びVIの少なくとも３種の同時検出用キット。 - 【請求項７】 前記（ｉ）〜（viii）の核酸プライマー
ペアの全てを含む請求項６記載のキット。
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|---|---|---|---|
| JP11289356A JP3118572B2 (ja) | 1998-10-12 | 1999-10-12 | Ｒｔ−ｐｃｒによるカンキツタターリーフウイルス及びカンキツウイロイドの同時検出方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10-288954 | 1998-10-12 | ||
| JP28895498 | 1998-10-12 | ||
| JP11289356A JP3118572B2 (ja) | 1998-10-12 | 1999-10-12 | Ｒｔ−ｐｃｒによるカンキツタターリーフウイルス及びカンキツウイロイドの同時検出方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000184893A JP2000184893A (ja) | 2000-07-04 |
| JP3118572B2 true JP3118572B2 (ja) | 2000-12-18 |
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ID=26557397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11289356A Expired - Lifetime JP3118572B2 (ja) | 1998-10-12 | 1999-10-12 | Ｒｔ−ｐｃｒによるカンキツタターリーフウイルス及びカンキツウイロイドの同時検出方法 |
Country Status (1)
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|---|---|
| JP (1) | JP3118572B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101956023A (zh) * | 2010-09-16 | 2011-01-26 | 西南大学 | 检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片 |
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|---|---|---|---|---|
| KR100442987B1 (ko) * | 2002-07-03 | 2004-08-04 | 학교법인 경희대학교 | 과수 바이러스 검정용 프라이머 및 이를 이용한 바이러스검출방법 |
| JP5278919B2 (ja) * | 2009-06-02 | 2013-09-04 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | ウイロイドＰＳＴＶｄ及びＴＣＤＶｄの同時検出方法 |
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| CN110218816A (zh) * | 2018-03-02 | 2019-09-10 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法 |
-
1999
- 1999-10-12 JP JP11289356A patent/JP3118572B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｊｕｌｙ．１９９８，Ｖｏｌ．１４３，Ｎｏ．５，ｐ．９７１−９８０ |
| Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，Ｖｏｌ．７５，Ｎｏ．１２，ｐ．３５８１−３５８４ |
| Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９２，Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．３，ｐ．２７９−２８５ |
| Ｐｒｏｃ．１３ｔｈ Ｃｏｎｆ．ＩＯＣＶ．，ＩＯＣＶ，Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ，１９９６，ｐ．２３０−２３５ |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101956023A (zh) * | 2010-09-16 | 2011-01-26 | 西南大学 | 检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片 |
| CN101956023B (zh) * | 2010-09-16 | 2012-10-31 | 西南大学 | 检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000184893A (ja) | 2000-07-04 |
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