KR102647442B1 - 시카델라 비리디스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
시카델라 비리디스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 시카델라 비리디스(Cicadella viridis)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트는 포도피어슨병 관련 매개충인 시카델라 비리디스를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 포도피어슨병을 조기에 예측 및 진단하여 포도피어슨병 피해로 인한 경제적 손해를 줄일 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 시카델라 비리디스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
포도피어슨병(Pierce's Disease of Grape)은 자이렐라 파스티디오사(Xylella fastidiosa)라고 불리는 세균에 의해서 발생하는 것으로, 포도에 심각한 피해를 주고 있는 세균병이다. 포도피어슨병은 1880년대부터 미국의 캘리포니아 남부지역에서 그 존재가 알려져 있었고, 당시 3만 5천에이커에 달하는 포도밭을 파괴시켰다. 하지만, 그 시기에는 어떤 병원체가 이 병을 일으키는지 밝혀낼 수 없어서 미지의 병(Mysterious Disease)으로 부르거나, 단순히 병이 발생한 지역명을 붙여 애너하임병(Anaheim Disease) 또는 캘리포니아포도병(California vine Disease) 등으로 불렸다. 병원균을 분리하지 못했기 때문에 처음에는 바이러스에 의한 병으로 생각되었지만 1978년 세균(X. fastidiosa)에 의한 병인 것으로 밝혀졌고, 이 병에 대한 연구를 수행한 N. B. Pierce라는 연구자의 이름을 따서 포도피어슨병이라는 정식 병명도 가지게 되었다.
포도피어슨병의 병원균인 자이렐라 파스티디오사는 매우 넓은 기주를 가지고 있으며, 포도뿐만 아니라 복숭아, 감귤 등 경제적으로 매우 중요한 식물에 심각한 피해를 주고 있어 우리나라의 금지병해충으로 지정되어 있다. 또한, 자이렐라 파스티디오사는 오랫동안 미국, 멕시코, 브라질 등 아메리카 대륙에만 분포하였으나, 최근 대만, 이란 등 아시아 국가에서 배, 포도, 아몬드 등의 기주에서 발생이 보고되었으며, 이탈리아와 프랑스에도 유입·확산되어 올리브 등에 심각한 피해를 일으키고 있어 공적방제를 실시하고 있다. 포도피어슨병은 접목이나 매개충에 의해 전염될 수 있고, 최근 묘목류의 인위적인 이동에 따른 병원균 유입으로 지역적으로 분리되어 있던 아종(subspecies)들 간의 유전자 교환이 이루어져 기주범위 및 병원성이 변하고 있다고 알려져 있다.
현재 국내에서 포도피어슨병의 발생 보고는 없으나, 발생 양상이 다변화되고 있어 유입 가능성이 더욱 높아지고 있고, 유입 및 발생 시 박멸이 거의 불가능하기 때문에 진답법을 포함한 관리 방안 수립이 시급한 실정이다. 이에 본 발명자들은 매개충인 시카델라 비리디스에 대한 특이성이 매우 우수한 프라이머 세트를 사용하여 신속정확하게 포도피어슨병을 진단할 수 있는 방법을 개발하였다.
한편, 한국등록특허 제1860783호에 '검역 세균인 애시도보락스 가틀레애를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1368304호에 복숭아순나방과 같은 '과실 해충 검정용 프라이머와 프라이머 세트 및 이를 dldyld하는 과실 해충 검정 키트'가 개시되어 있으나, 본 발명의 포도피어슨병 매개충인 '시카델라 비리디스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 포도피어슨병 매개충인 시카델라 비리디스(Cicadella viridis)의 CO1(Cytochrome oxidase 1) 유전자 염기서열에 기반한 프라이머 세트를 제작하였고, 상기 제작된 프라이머 세트가 종 특이성(species-specificity)이 우수하여 시카델라 비리디스만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 시카델라 비리디스(Cicadella viridis)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 시카델라 비리디스를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 포도피어슨병 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 시카델라 비리디스를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 포도피어슨병 관련 매개충인 시카델라 비리디스(Cicadella viridis)를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 포도피어슨병을 조기에 예측 및 진단하여 포도피어슨병 피해로 인한 경제적 손해를 줄일 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 결과이다. 레인 1: 시카델라 비리디스(Cicadella viridis), 레인 2: 호말로디스카 비트리페니스(Homalodisca vitripennis), 레인 3: 쿠에르나 코스탈리스(Cuerna costalis), 레인 4: 그라포세팔라 베르수타(Graphocephala versuta), 레인 5: 온코메토피아 니그리칸스(Oncometopia nigricans), 레인 6: 딜로봅테루스 코스탈리마이(Dilobopterus costalimai), 레인 7: 자이폰 플라비켑스(Xyphon flaviceps), 레인 8: 레피로니아 쿼드랑굴라리스(Lepyronia quadrangularis), 레인 9: 디세로프록타 아파치(Diceroprocta apache), 레인 10: 필라에누스 스푸마리우스(Philaenus spumarius), 레인 11: 파라울라시제스 이로라테(Paraulacizes irrorate), 레인 12: 그라포세팔라 콕시니아(Graphocephala coccinea).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 시카델라 비리디스(Cicadella viridis)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 증폭 부위에 결합할 수 있는 서열번호 1 및 2의 염기서열에서 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 시카델라 비리디스를 특이적으로 검출하기 위한 조성물 또는 키트를 제공한다.
본 발명의 시카델라 비리디스를 특이적으로 검출하기 위한 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 시카델라 비리디스를 특이적으로 검출하기 위한 조성물 또는 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
포도피어슨병 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 시카델라 비리디스를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 포도피어슨병 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 포도피어슨병 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 포도피어슨병 감염 의심 시료는 감염 의심 식물체의 잎, 묘목, 줄기, 과수 또는 종자 등일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 상기 식물체는 포도피어슨병에 감염될 수 있는 식물이면 그 종류에 제한이 없다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 시카델라 비리디스를 특이적으로 검출하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 시카델라 비리디스(
Cicadella viridis
)의 게놈 DNA 추출
포도피어슨병 매개충인 시카델라 비리디스는 국내 김천시 부항면 신옥리 부항댐에서 수집하였다. 수집된 시카델라 비리디스 매개충의 머리(또는 다리) 부분을 마쇄하고 ATL 버퍼(tissue lysis) 180 ㎕를 넣어 남은 샘플도 충분히 마쇄한 후 새로운 1 ㎖ 튜브에 옮겨 담았으며, Proteinase K 20 ㎕를 넣고 혼합(voltexing)한 다음 56℃에서 최소 3시간 또는 밤새 반응시켜 분해(lysis) 과정을 수행하였다. 이후 AL 버퍼(lysis) 200 ㎕를 넣어 혼합하고, 56℃에서 10분 이상 방치한 후 에탄올 200 ㎕ 넣고 용해될 때까지 충분히 혼합하였으며, Dneasy Mini spin column에 넣고 원심분리(8,000 rpm 1분)하였다. 원심분리 후 아래 튜브를 버리고 새 컬럼에 옮기고 AW1 버퍼(wash) 500 ㎕를 넣은 후 원심분리(8,000 rpm, 1분)하였으며, 다시 아래 튜브를 버리고 동일한 컬럼에 옮긴 후 AW2 버퍼(wash) 500 ㎕넣고 원심분리(13,500 rpm 3분)하였다. 최종적으로 1.5 ㎖ 튜브에 컬럼을 옮기고 뚜겅(캡)을 열어 1~2분 동안 말려준 다음 AE 버퍼(elution) 50 ㎕를 넣고 대략 2~3분 정도 RT에 둔 다음 원심분리(8,000 rpm 1분)하였으며, AE 버퍼 50 ㎕(또는 100㎕)를 필터에 넣고 2~3분 기다린 후에 원심분리(8,000 rpm 2분)하여 게놈 DNA를 추출하였다.
2. 시카델라 비리디스 특이 프라이머의 설계
NGS 염기서열(차세대 염기서열 분석법)을 이용하여 NCBI RefSeq DB 분석하여, CO1(Cytochrome oxidase 1) 유전자 염기서열에 기반한 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머는 Primer 3와 NCBI primer-Blast 프로그램을 이용하여 디자인하였다.
| 프라이머 명칭 | 서열(5'→3') (서열번호) | 크기(bp) |
| Cv-F | ATTGGTGGTTTTGGTAATTG (1) | 285 |
| Cv-R | AGATGAAATACCAGCTAAATGT (2) |
3. 중합효소연쇄반응(PCR)
PCR 반응물은 상기 추출한 게놈 DNA(20 ng) 1 ㎕, 정방향 및 역방향 프라이머(10 μM) 각각 1 ㎕씩, 증류수 7 ㎕ 및 Premixture(Plutos) 10 ㎕를 혼합하여 총 20 ㎕가 되도록 하였다. PCR은 전변성(pre-denaturation) 95℃ 2분; 변성(denaturation) 95℃ 30초, 결합(annealing) 55℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 30초의 과정을 총 35회 반복; 최종 신장(final extension) 72℃ 5분의 조건으로 수행하였다. PCR 증폭 산물은 LabChip 장비(LabchipGX, PerkinElmer, 미국)를 통해 확인하였다.
실시예 1. 프라이머 세트 특이성 분석
상기 표 1의 프라이머 세트를 이용하여 시카델라 비리디스(Cicadella viridis)뿐만 아니라 호말로디스카 비트리페니스(Homalodisca vitripennis), 쿠에르나 코스탈리스(Cuerna costalis), 그라포세팔라 베르수타(Graphocephala versuta), 온코메토피아 니그리칸스(Oncometopia nigricans), 딜로봅테루스 코스탈리마이(Dilobopterus costalimai), 자이폰 플라비켑스(Xyphon flaviceps), 레피로니아 쿼드랑굴라리스(Lepyronia quadrangularis), 디세로프록타 아파치(Diceroprocta apache), 필라에누스 스푸마리우스(Philaenus spumarius), 파라울라시제스 이로라테(Paraulacizes irrorate), 그라포세팔라 콕시니아(Graphocephala coccinea)와 같은 다양한 포도피어슨병 매개충 시료를 대상으로 PCR을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 프라이머 세트는 다양한 포도피어슨병 매개충 중에서 시카델라 비리디스(C. viridis)에서만 특이적 증폭 반응이 일어난 것을 확인하였다(도 1). 이를 통해, 본 발명의 프라이머 세트는 다른 포도피어슨병 매개충 게놈 DNA에는 반응하지 않으면서 시카델라 비리디스를 효과적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)
<120> Specific primer set for detecting Cicadella viridis and uses
thereof
<130> PN21172
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
attggtggtt ttggtaattg 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
agatgaaata ccagctaaat gt 22
Claims (5)
- 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 시카델라 비리디스(Cicadella viridis)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트.
- 제1항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 시카델라 비리디스(Cicadella viridis)를 특이적으로 검출하기 위한 키트.
- 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
- 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 시카델라 비리디스(Cicadella viridis)를 특이적으로 검출하는 방법. - 제4항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
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2021
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