KR101913742B1

KR101913742B1 - 딸기 위황병 병원균을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101913742B1
Application number: KR1020170105212A
Authority: KR
Inventors: 곽연식; 홍성원
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2017-08-21
Filing date: 2017-08-21
Publication date: 2018-10-31
Also published as: WO2019039653A1

Abstract

본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 딸기 위황병 병원균(Fusarium oxysporum f.sp fragariae)을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 딸기 위황병 병원균을 특이적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

딸기 위황병 병원균을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도{Specific primer set for detecting Fusarium oxysporum f.sp fragariae and uses thereof}

본 발명은 딸기 위황병 병원균을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)은 전 세계적으로 많은 종의 식물에 심각한 병을 일으키는 병원균으로 기주 특이성이 높아서 병을 일으키는 기주에 따라 120개 이상의 f.sp(formae specialis)로 구성되어 있다. 딸기에 발생하는 시들음병 또는 위황병에 대한 병원균은 푸사리움 옥시스포룸 f.sp 프라가리애(Fusarium oxysporum f.sp fragariae)이다.

푸사리움에 의한 병의 발병은 토양 환경과 밀접한 관련이 있는데, 딸기 시들음병은 전염원인 후막포자가 토양 속에 생존하여 전염하는 토양전염성 병해이다. 또한 이병모주로부터 발생하는 런너를 통해 자묘로 침입하여 발병시키는 영양번식전염도 가능하여, 토양 병 방제를 위해 토양 훈증이나 약제 살포 방법을 사용할 경우 토양 미생물상의 파괴와 환경에 큰 영향으로 사용이 쉽지 않은 실정이다. 또한 무병묘를 확보하기 위해서는 조직배양을 통한 건전묘 육성이 되어야 하는데 이에 따른 많은 시간과 노력이 투여되어야 하는 문제점이 있다. 시들음병에 대한 생물학적 방제 연구는 오랜 역사를 가지고 있지만 실용화된 방제방법은 효과적이지 않거나, 처리하기 쉽지 않은 문제점이 있다.

본 발명에서는 딸기 재배지에 막대한 경제적 피해를 끼치는 딸기 위황병 병원균에 대해 신속하고 정확한 검출을 위한 진단프라이머를 개발하고자 하였다. 또한, 토양 내 병원균 밀도에 따른 딸기 위황병 발생의 상관관계를 구명하기 위해, 정량적인 진단이 가능하도록 프로토콜을 구축하고자 하였다.

한편, 한국공개특허 제2017-0018209호에는 '양배추 시들음병 저항성 관련 마커를 표지하는 프라이머 세트 및 이를 이용한 저항성 양배추 품종 선별 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1681645호에는 '무에 시들음병을 일으키는 푸자리움 옥시스포룸 라파니 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 푸자리움 옥시스포룸 라파니 검출 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 딸기 위황병 병원균을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 딸기 위황병 병원균인 Fusarium oxysproum f.sp fragariae의 특이적 유전자 영역을 이용하여, 딸기 위황병 병원균을 정확하게 검출할 수 있는 qRT-PCR용 프라이머를 개발하였고, 상기 프라이머 세트가 딸기 위황병 병원균에만 특이적으로 반응하며, 병원균 밀도에 따른 정량적 분석이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 딸기 위황병 병원균(Fusarium oxysporum f.sp fragariae)을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 딸기 위황병 병원균을 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 딸기 위황병 병원균을 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 딸기의 육묘 재배 및 본답 재배시에 토양내 존재하는 병원균의 밀도를 상시 체크하여, 딸기 위황병을 조기에 예측 및 진단할 수 있어, 딸기 재배지의 위황병 피해로 인한 경제적 손해를 줄일 수 있을 것이다.

도 1은 딸기 위황병 병원균(Fusarium oxysporum f.sp fragariae)에 특이적인 유전지역 Han-Skippy의 염기서열 정보와 본 발명의 프라이머 세트의 위치를 보여준다.
도 2는 본 발명의 딸기 위황병 병원균 검출용 프라이머 세트를 이용한 qRT-PCR 표준 곡선으로, r² 값이 0.99 이상으로 표준 곡선을 신뢰할 수 있음을 보여주는 결과이다.
도 3은 본 발명의 딸기 위황병 병원균 검출용 프라이머 세트의 특이성 및 민감도를 검증하기 위해, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 외의 푸사리움 속 6종의 곰팡이를 이용하여 qRT-PCR을 수행한 결과(A)와, 딸기 위황병 병원균을 처리한 상토(bed soil) 및 일반 토양(soil)으로부터 DNA를 추출하여 qRT-PCR을 수행한 결과(B)이다. F9: Fusarium oxysporum f.sp fragariae.
도 4는 식재된 딸기에 위황병 병원균을 농도별로 접종시킨 후, 총 5주 동안 육안으로 병징을 조사한 결과(A)와 토양 내 위황병 병원균의 밀도를 qRT-PCR로 분석한 결과(B)이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 딸기 위황병 병원균(Fusarium oxysporum f.sp fragariae)을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 딸기 위황병 병원균(Fusarium oxysporum f.sp fragariae)을 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한, 본 발명은

딸기 시료 또는 딸기가 식재된 토양 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 딸기 위황병 병원균(Fusarium oxysporum f.sp fragariae)을 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 딸기 시료 또는 딸기가 식재된 토양 시료에서 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 딸기 위황병 병원균을 검출하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 딸기위황병 병원균에서 Han-Skippy 유전자를 이용한 qRT-PCR용 프라이머 제작 및 표준 곡선 조건

2016년 2월부터 딸기 위황병 병원균(Fusarium oxysporum f.sp fragariae)의 특이적 영역으로 알려진 Han-skippy 유전자(서열번호 3)를 이용하여, 딸기 위황병 병원균만 검출되는, PCR 산물의 길이가 72bp 이며 Tm(melting temperature) 값은 51℃인 qRT-PCR(quantitative real time PCR)용 프라이머를 제작하였다(도 1).

제작된 프라이머 세트는 각각 정방향 Fofra qPCR F : 5'-TTC GCT CCT CCC ATA CAA-3' (서열번호 1) 및 역방향 Fofra qPCR R: 5'-AAA CCA CGC AGA GAG TAA A-3' (서열번호 2)의 프라이머 세트로, 상기 프라이머 세트를 이용하여, DNA 양에 따른 Ct(threshold cycle) 값을 확보하여 절대정량을 파악하고자 표준 곡선(standard curve)을 작성하였다. qRT-PCR 반응물은 Syber-Green Master mix(Toyobo, 일본) 25㎕, DNA 1~10ng, 프라이머 각각 2㎕ 및 멸균수를 이용하여 총 50㎕의 용량으로 맞추었으며, qRT-PCR 반응조건은 하기 표 1과 같고, DNA는 100ng 부터 0.01ng 까지 10배씩 희석하여 사용하였다. qRT-PCR 결과, Ct 값은 10배씩 희석된 농도를 처리한 DNA 시료마다 약 3.3 Ct 차이 나는 것을 알 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 프라이머 세트가 주형 시료를 정량적으로 정확하게 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 2).

qRT-PCR 반응조건

단계	온도(℃)	시간
전-변성	95	1분
변성	95	30초
결합	51	30초
신장	72	45초
변성 단계로 돌아가 39회 추가 반복
최종 신장	72	5분
보관	4	∞

실시예 2. 프라이머 세트의 특이성 및 민감도 분석

딸기 위황병 병원균에 특이적인 본 발명의 프라이머 세트가 푸사리움 속(Fusarium)의 다른 병원균의 DNA에 비특이적 반응을 보이는지 확인하기 위해, KACC(농업미생물자원센터)에서 6종의 푸사리움 속 병원균을 분양받은 후 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 qRT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 딸기 위황병 병원균을 제외한 다른 병원균의 DNA 시료에는 본 발명의 프라이머 세트가 반응을 보이지 않는 것을 알 수 있었다(도 3A).

또한 일반 토양 및 상토에 딸기 위황병 병원균을 10⁶, 10⁴, 또는 10² cfu/㎖의 농도로 처리한 후, 각각의 토양 시료로부터 FastDNA SPIN kit for soil(MP Biomedicals, 미국)을 사용하여 DNA를 추출하였다. 간단하게, 채집한 딸기 근권(rhizosphere) 0.5~0.7g를 Lysing matrix E tube에 담은 후, 978㎕ SPB 버퍼와 122㎕ MT 버퍼를 넣어준 후, 비드비트 기계를 이용하여 스피드 6.0 로 10분간 섞어주었다. 상기 시료를 14,000rpm으로 10분간 원심분리한 후, 상층액을 2㎖ 튜브에 옮겨준 다음 PPS 버퍼 250㎕를 넣고 10분간 반응시킨 후 14,000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 15㎖ 튜브에 옮겨준 후 1㎖ binding matrix 버퍼를 넣은 후 2분간 교반하고, 3분간 반응시켰다. 반응시킨 용액의 최상층액 500㎕를 버리고, 나머지 용액을 피펫팅(pipette)하여 잘 섞은 후 spin 튜브에 최대 700㎕ 씩 옮긴 후 1분간 원심분리한 후 하층액을 버리는 과정을 총 2회 수행하였다. 그 후, 500㎕ prepared sews-m 버퍼를 첨가한 후 1분간 원심분리한 후 하층액을 버리고 원심분리를 한번 더 실시하였다. 하층액이 버려진 샘플은 상온에서 5분간 말린 후 다시 DES 버퍼 50~100㎕를 넣은 후 55℃에서 5분간 반응시킨 후, 1분간 원심분리하여 하층액을 새로운 튜브에 옮기고, 추후 실험에 이용하였다. 각각의 토양으로부터 추출된 DNA를 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 qRT-PCR을 수행한 후, Ct 값을 분석하여 표준 곡선에 대응하는 DNA 양을 각각 계산하였다. 그 결과, 각 시료에 대해서 병원균 처리 농도와 유사하게 DNA 양이 상응하게 확인되어, 본 발명의 프라이머 세트가 정량적 검출능이 우수함을 확인할 수 있었다(도 3B).

실시예 3. 토양 내 딸기 위황병 병원균 농도와 위황병 발병 정도 실험

딸기를 심은 후 딸기 위황병 병원균을 각각 10¹, 10³, 10⁵, 또는 10⁷cfu/㎖/토양 g의 농도로 접종하고, 육안상 관찰되는 병 발생 정도와 실제 토양 내 존재하는 병원균 밀도와의 상관관계를 분석하였다. 구체적으로는, 딸기 식재 후 1주일간 딸기를 재배한 후, 딸기 위황병 병원균을 서로 다른 농도로 딸기 뿌리 부분에 상처를 입혀 접종시켰다. 그 후, 총 5주 동안 매 주마다 육안조사를 실시하였으며, 병의 증상에 따라 1~5점 기준을 정하고, 그에 해당되는 증상에 표기하는 방식을 사용하였다. 점수의 기준은 다음과 같다: 1; 1개 잎이 뒤틀리거나 시들음 증상, 2; 3개 잎이 뒤틀리거나 시들음 증상, 3; 전체적으로 시들음 증상, 4; 부분 괴사 증상, 5; 전체 괴사.

qRT-PCR 분석은 병원균 접종 5주 후, 토양 시료로부터 DNA를 추출하고 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 반응을 수행한 후, 표준 곡선을 이용하여 토양내 병원균 밀도를 계산하였다. 육안조사에서 병징이 뚜렷하게 나타나는 처리구역은 10⁵및 10⁷cfu/㎖의 농도로 병원균을 처리한 군이었으며(도 4A), 각 처리군의 토양 내 병원균 밀도를 확인한 결과에서는, 10⁵및 10⁷cfu/㎖의 농도로 병원균을 처리한 군에서 무처리 대조군보다 높은 수준의 병원균 밀도가 확인되어, 토양 내에 딸기 위황병 병원균의 밀도가 10⁵cfu/㎖ 농도 이상 존재할 때 병이 발병한다는 것을 유추할 수 있었다(도 4B).

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Specific primer set for detecting Fusarium oxysporum f.sp fragariae and uses thereof <130> PN17261 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ttcgctcctc ccatacaa 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aaaccacgca gagagtaaa 19 <210> 3 <211> 223 <212> DNA <213> Fusarium oxysporum f.sp fragariae <400> 3 caccagactg gggtgcttaa agtttattac catccaggac cacctaatgc ataactaaaa 60 tttcgctcct cccatacaaa atccaaattt tgatgtccac aaaaaggccc gattctcaat 120 taataaatga gactttggag aaagtttcta gaaaattgct caaattttac tctctgcgtg 180 gttttttgac ctcccgaccg ctgcgtgtgc gctggcagtg ctt 223

Claims

서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 딸기 위황병 병원균(Fusarium oxysporum f.sp fragariae)을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트.
제1항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 딸기 위황병 병원균을 특이적으로 검출하기 위한 키트.
제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
딸기 시료 또는 딸기가 식재된 토양 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 딸기 위황병 병원균(Fusarium oxysporum f.sp fragariae)을 특이적으로 검출하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.