KR102636357B1 - 고추에서 발생하는 5종의 곰팡이 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고추 곰팡이 진단용 프라이머 세트; 상기 프라이머 쌍을 포함하는 고추 곰팡이 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 고추 곰팡이 진단용 키트; 및 고추 곰팡이 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명은 다양한 고추 샘플에서 채취한 주요 5종의 곰팡이를 분리 동정하였으며, 직접 확보한 5종의 고추 곰팡이 각각에 선택적, 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 설계하여 곰팡이 진단의 신속성 및 정확성을 높일 수 있는바, 고추 곰팡이병 진단, 고추 무병묘 생산 및 고추 피해 예방에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명은 다양한 고추 샘플에서 채취한 주요 5종의 곰팡이를 분리 동정하였으며, 직접 확보한 5종의 고추 곰팡이 각각에 선택적, 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 설계하여 곰팡이 진단의 신속성 및 정확성을 높일 수 있는바, 고추 곰팡이병 진단, 고추 무병묘 생산 및 고추 피해 예방에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고추 곰팡이 진단용 프라이머 세트; 상기 프라이머 쌍을 포함하는 고추 곰팡이 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 고추 곰팡이 진단용 키트; 및 고추 곰팡이 진단 방법에 관한 것이다.
고추 (Capsicum annuum (L.))는 가지과(the family Solanaceae)에 속하는 중요한 향신료 작물의 하나로, 고추의 주된 생산국가는 한국을 비롯하여 중국, 멕시코, 터키, 인도네시아, 인도, 스페인, 미국등이 있다(2018년 유엔 세계 식량 및 농업 기구(FAO)). 국내에서는 주로 건고추와 생식용으로 사용되는 풋고추가 재배되고 있다. 고추는 과채류중 높은 온도를 요구하는 고온성 채소로, 지역마다 차이는 있지만 주로 4월부터 5월에 노지에 심어 풋고추는 6월에 수확을 시작하고, 건고추인 붉은 고추는 7월~8월에 수확하며, 겨울이 되기 전 11월 또는 12월에 재배한 고추를 제거해준다.
다른 작물들과 마찬가지로, 고추도 재배 시에 다양한 질병에 의해 과실의 품질과 수량에 많은 피해를 입고 있다. 대표적인 병으로는 Colletotrichum gloeosporioides에 의한 탄저병(Anthracnose)이 있으며 주로 잎과 줄기에 발생하며 부정형 암갈색의 반점 혹은 잎마름으로 변한다. Phytophthora capsici에 의한 역병(Phytophthora blight)은 주로 잎, 과실, 뿌리에 회백색곰팡이가 발생하며 물러썩음과 시들음 병징을 보여준다. Botrytis cinerea에 의한 (잿빛곰팡이병), Fusarium oxysporum에 의한 시들음병, Leveillula taurica에 의한 흰가루병(Powdery Mildew), Sclerotium rolfsii에 의한 흰비단병, Rhizoctonia solani과 Pythium ultimum의 경우 모잘록병등의 곰팡이에 의한 병과, 그밖에 세균성점무늬병, 다양한 바이러스들이 고추에 병을 일으키고 있다. 특히 고추 곰팡이병의 경우 비가 자주오거나 장마시기에 많이 발생하기 때문에 곰팡이병을 조기에 잘 관찰하고 주기적으로 관련 농약 살포가 매우 중요하다. 하지만 대부분의 농가에서는 곰팡이병 발생과 상관없이 품질 좋은 고추 과실을 얻기 위해 주기적으로 많은 양의 농약을 살포하고 있다.
그러나, 세균, 곰팡이, 바이러스 등 다양한 병원성 식물 미생물의 감염은 고추의 생산량과 품질 감소에 많은 영향을 주고 있다. 이에, 한국에서는 고품질의 고추 생산을 위해 재배되고 있는 고추 작물에 다양한 농약들을 주기적으로 살포하는 것이 현실이다. 고추는 대부분 5월경 노지에 심어 주로 여름내내 재배 및 생산하고, 겨울이 되기전에 고추 작물들을 제거한다. 하지만, 노지나 비닐하우스에서 제거되지 않고 남겨진 고추 작물에는 다양한 미생물이 증식하게 되고, 많은 종류의 곰팡이들은 월동할 수 있는 포자를 생산하여 수년 동안 생존하기도한다.
한국에서는 습하고 더운 여름 기후로 인해 다양한 병원성 곰팡이병들이 많이 확산되고 있는 실정이다. 대표적인 고추 감염 곰팡이병으로는 흰곰팡이병을 일으키는 별빛균핵버섯(Sclerotinia sclerotiorum), 묘잘록병을 일으키는 난균류(Pythium sp.), 흰비단병균(Sclerotium rolfsii), 고추역병균(Phytophthora capsici), 시들음병균(Fusarium oxysporum) 등이 있다.
최근에는 차세대염기서열분석(Next-generation sequencing; NGS) 기술의 빠른 발달로 인해 이를 이용하여 곰팡이를 비롯한 다양한 미생물의 유전체, 전사체 정보의 확보 및 미생물 동정 등을 손쉽게 할 수 있게 되었다. 특히 NGS와 생물정보학 분석을 통해 새롭게 분리된 곰팡이균의 정확한 동정이 가능하며, 관련 유전자 정보등을 손쉽게 확보할 수 있다.
정확한 곰팡이 동정은 곰팡이병을 예방하는데 매우 중요하다. 곰팡이병을 진단하는 가장 일반적인 방법으로는 곰팡이균 배양을 통한 방법이 있다. 이 방법의 경우 특이적인 배지에 자라는 곰팡이로부터 DNA를 추출한 후, 곰팡이 특이적인 internal-transcribed-space (ITS) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한다. 증폭된 PCR 산물은 클로닝(Cloning)과 Sanger-sequencing을 통해 염기서열을 결정하고, 새롭게 결정된 ITS 염기서열은 BLAST를 이용해 기존 곰팡이 ITS 데이타베이스에 유전자 서열을 비교한 후 새롭게 동정된 곰팡이 균의 종을 결정한다. 그러나, ITS 프라이머를 이용한 방법의 경우 곰팡이 종을 동정하는데 많은 시간이 걸리며, 때때로 식물기주에서도 ITS 유전자 부분이 증폭되기 때문에 곰팡이 진단에 많은 어려움이 있다. 따라서, 곰팡이를 효과적으로 진단하기 위해서는 곰팡이 종 특이적 유전자들을 이용한 진단방법 개발이 필수적이다.
이에, 본 발명의 발명자들은 고추 감염 곰팡이의 진단 및 모니터링, 나아가 고추 무병묘 생산 및 고추 피해 예방에 활용하고자, 다양한 지역에서 채취한 고추로부터 5종의 곰팡이를 분리 동정하여, 5종의 고추 곰팡이 각각에 선택적, 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 설계함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고추 곰팡이 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 고추 곰팡이 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 고추 곰팡이 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고추 곰팡이 진단 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고추 곰팡이 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다.
본 발명에서 용어 "고추 곰팡이"는 고추에 나타나는 질병의 원인이 되는 곰팡이를 총칭하는 것으로, 예컨대 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 등을 모두 포함하는 것일 수 있으며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명에서는 다양한 지역에서 채취한 고추로부터 5종의 고추 곰팡이인 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)을 동정하였다. 구체적으로, 동정된 곰팡이의 종 특이적 유전자를 확보하여 이를 바탕으로 고추 곰팡이 진단용 프라이머 세트를 제작하였다.
본 발명에서 고추 곰팡이 진단용은 고추 곰팡이 검출용을 의미한다.
본 발명에서 상기 고추 곰팡이 진단용 프라이머는 PCR용 프라이머 쌍을 의미한다. 본 발명의 프라이머 쌍은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하며, 구체적으로는 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)을 진단할 수 있는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 파이티움 종(Pythium sp.)을 진단할 수 있는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii)를 진단할 수 있는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici)를 진단할 수 있는 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)을 진단할 수 있는 서열번호 9 및 서열번호 10을 진단할 수 있는 프라이머 쌍을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 고추에서 동정한 5종의 고추 곰팡이 각각에서 곰팡이 종 특이적인 유전자 정보를 확보하여, 이를 바탕으로 PCR 방법을 이용해 각 곰팡이를 특이적으로 정확하게 진단할 수 있는 프라이머 세트를 디자인하였다.
구체적으로, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍은 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)의 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍이고, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍은 파이티움 종(Pythium sp.)의 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍이고, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍은 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii)의 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍이고, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍은 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici)의 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍이며, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍은 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)의 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고추 곰팡이 진단용 조성물 및 이를 포함하는 고추 곰팡이 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로는 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 상기 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트를 사용할 경우, 1회 PCR 반응 조건에서 실시하여도 검체 내에 존재하는 5종의 고추 곰팡이를 한번에 진단할 수 있다.
상기 조성물 및 키트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍과, 추가로 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적 상 상기 키트에서 증폭 반응을 수행하기 위한 시약으로 DNA 폴리머라제(polymerase), dNTPs, Taq 중합효소 및 PCR 완충액 등을 포함할 수 있으며, 또한 PCR 산물의 증폭 여부를 확인하기 위해 전기영동(electrophoresis)의 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 나아가, 필요한 경우 RNase 억제제, DEPC-water 및 멸균수 등이 포함될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 시료로부터 고추 곰팡이 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 핵산을 주형으로 제1항의 프라이머 쌍을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고추 곰팡이 진단 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계의 시료는 본 발명의 고추 곰팡이 존재 여부를 확인하기 위해 필요한 핵산, 구체적으로는 DNA를 추출하기 위한 미지의 물질을 의미하는 것으로, 예컨대 상기 바이러스가 감염된 고추 또는 고추 나무의 잎, 줄기, 뿌리 등을 포함할 수 있으며, 그밖에도 식품, 천연물(예컨대, 물) 또는 생물학적 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 표적 핵산을 증폭하는 단계는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이용하여 수행할 수 있으며, 구체적으로 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는, PCR 조건으로 94℃에서 3분, 이어서 94℃에서 20초, 60℃에서 40 초 (어닐링 온도는 모든 프라이머에서 동일함), 및 72℃에서 40초 동안 35회 사이클이었으며, 72℃에서 5분 동안 최종 신장(final extension)하였다.
상기 (c) 단계에서 증폭된 표적 핵산의 검출은 모세관 전기영동(capillary electrophoresis), DNA 칩, 겔 전기영동(gel electrophoresis), 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는, 증폭된 PCR 산물을 겔 전기 영동에 이어 EtBr 염색으로 확인하였으며, 나아가 pGEM-T-Easy Vector(Promega, Wisconsin, US)에서 증폭된 PCR 산물을 클로닝 한 후 Sanger 시퀀싱하여 증폭된 PCR 산물의 서열을 확인하였다.
본 발명은 다양한 지역에서 채취한 고추로부터 5종의 곰팡이를 분리 동정하였으며, 직접 확보한 5종의 고추 곰팡이 각각에 선택적, 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 설계하여 진단의 신속성 및 정확성을 높일 수 있는바, 고추 곰팡이병 진단, 고추 무병묘 생산 및 고추 피해 예방에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 곰팡이 종 특이적 유전자를 분석 및 선발하는 단계를 나타낸 모식도이다.
도 2는 5 종의 고추 곰팡이로부터 추출한 DNA, template 및 디자인한 곰팡이 특이적 프라이머를 사용하여 얻어진 증폭된 PCR 산물을 확인한 결과를 나타낸 것이다. M은 100 bp DNA 마커를 나타내고, 1번부터 5번 레인은 각각 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)을 나타낸다.
도 2는 5 종의 고추 곰팡이로부터 추출한 DNA, template 및 디자인한 곰팡이 특이적 프라이머를 사용하여 얻어진 증폭된 PCR 산물을 확인한 결과를 나타낸 것이다. M은 100 bp DNA 마커를 나타내고, 1번부터 5번 레인은 각각 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)을 나타낸다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 고추 곰팡이 연구를 위한 샘플 수집 및 곰팡이 분리 동정
국내에서 발견되는 주요 고추 곰팡이를 식별하고자, 4개 지역(태안, 완주, 밀양 및 광주)에서 균핵병, 잘록병, 흰비단병, 역병 또는 뿌리썩음병 증상을 보이는 고추들을 수집하였다. 수집된 샘플에서 총 5종의 곰팡이 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)을 분리 동정하였고(표 1), 이렇게 분리 동정된 곰팡이들은 DNA 추출에 사용하였다.
| 균주번호 | 기주식물 | 분리지역 | 곰팡이 | 병징 |
| 14-253 | 고추 | 태안 | Sclerotinia sclerotiorum | 균핵병 |
| 16-306 | 고추 | 완주 | Pythium sp. | 잘록병 |
| 17-453 | 고추 | 완주 | Sclerotium rolfsii | 흰비단병 |
| 18-488 | 고추 | 밀양 | Phytophthora capsici | 역병 |
| 19-019 | 고추 | 광주 | Fusarium oxysporum | 뿌리썩음병 |
실시예 2: DNA 또는 RNA 추출 및 라이브러리 제작
고추 샘플로부터 분리 동정된 5종의 고추 병원성 곰팡이 유전자 정보를 확보하기 위하여 total DNA 및 total RNA를 추출하였다. 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 및 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici)에 해당하는 4종 곰팡이는 DNA를 추출하여 DNA 라이브러리를 제작하였고, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)의 경우에는 RNA를 추출하여 mRNA 라이브러리를 제작하였다. 제작된 다섯 개의 라이브러리는 차세대염기서열분석(next-generation sequencing, NGS) 기기인 Novaseq 6000 시스템을 이용해 Next generation sequencing(NGS)를 수행하였다.
실시예 3: 전사체 조립 및 곰팡이 식별
실시예 2에서 수득한 raw data 중 4개의 DNA 데이터는 Spades 프로그램(https://cab.spbu.ru/software/spades/)을 이용하여 조립하였고, 1개의 RNA 데이터는 Trinity 프로그램(https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki)을 이용하여 de novo assembly를 수행하였다. 그 결과를 아래 표 2에 정리하였다.
| 식물 | 균주번호 | 핵산 종류 | Read 수 | Contig 수 | 조립된 유전체 및 전사체 크기(MB) | 조립에 사용된 프로그램 | 학명 |
| 고추 | 14-253 | DNA | 74,278,060 | 57,102 | 53.268 | Spades | Sclerotinia sclerotiorum |
| 고추 | 16-306 | DNA | 96,170,106 | 96,293 | 57.752 | Spades | Pythium sp. |
| 고추 | 17-453 | DNA | 82,520,108 | 60,885 | 77.448 | Spades | Sclerotium rolfsii |
| 고추 | 18-488 | DNA | 88,100,480 | 66,030 | 38.378 | Spades | Phytophthora capsici |
| 고추 | 19-019 | RNA | 49,595,002 | 26,220 | 44.798 | Trinity | Fusarium oxysporum |
각 곰팡이별로 조립된 contig의 수는 최소 26,220 contigs (푸사리움 옥시스포룸)에서 최대 96,293 contigs (파이티움 종)로 나타났다. 조립된 유전체와 전사체의 유전자 기능을 파악하기 위해 조립된 contig들을 이용하여 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 non-redundant 단백질 데이터베이스에 BLASTX를 수행하였다. 이때 cutoff로 Evalue 1E-5를 적용하였다. MEGAN6 프로그램(https://software-ab.informatik.uni-tuebingen.de/download/megan6/welcome.html)을 이용해 BLASTX 결과를 분석하여 5종 곰팡이의 정확한 종을 확인하였다. 대표적으로, 고추에서 분리한 19-019 균주의 경우 대부분의 유전자들이 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)에 매치되었다.
실시예 4: 5종의 고추 곰팡이 유전자를 이용한 곰팡이 종 특이적 유전자 선발
도 1의 모식도에 나타낸 방법에 따라 곰팡이 종 특이적 유전자를 선발하였다.
각 곰팡이별로 조립된 유전자 정보를 사용하여 TLBASTX를 수행하였다. 이때, 각 곰팡이 전사체를 데이터베이스로 하고, Evalue 1E-5를 기준으로 매치되는 모든 유전자들은 제거하였다. 각 곰팡이별로 반복적으로 분석을 수행하였다.
각 곰팡이 특이적으로 선발된 유전자들을 가지고, NCBI non-redundant 단백질 데이터베이스에 BLASTX 수행 후 MEGAN6를 이용하여 taxonomy 분석을 통해 동물, 식물, 세균, 바이러스 등 다른 생명체와 유사성을 보이는 모든 유전자 서열들을 제거하였다.
오염된 유전자들을 제거하고 필터링된 유전자 서열들을 가지고 다시 NCBI의 nucleotide(NT) 데이터베이스에 BLASTN을 수행하였다. 이때 NT 데이터베이스의 다른 곰팡이와 매치 되는 유전자들을 모두 제거하였다.
위의 분석 과정들을 통해 최종적으로 고추에서 분리한 5종 병원성 곰팡이 종 특이적 유전자들을 선발하였다(표 3).
| 균주번호 | 핵산 종류 | 학명 | 곰팡이 종 특이적 유전자 수 |
| 14-253 | DNA | Sclerotinia sclerotiorum | 1669 |
| 16-306 | DNA | Pythium sp. | 267 |
| 17-453 | DNA | Sclerotium rolfsii | 2 |
| 18-488 | DNA | Phytophthora capsici | 2 |
| 19-019 | RNA | Fusarium oxysporum | 2621 |
실시예 5: 5종 고추 곰팡이의 특이적 진단을 위한 PCR 프라이머 개발
5종 고추 곰팡이로부터 확보된 종 특이적 유전자 서열을 바탕으로 각 곰팡이를 특이적으로 진단할 수 있는 PCR 프라이머를 디자인하였다. 5종의 곰팡이들을 하나의 PCR 반응을 통해 진단할 수 있는 Multiplex PCR을 위해 증폭되는 PCR 산물의 길이를 서로 다르게 하여 다양한 프라이머들을 디자인하였다.
곰팡이로부터 추출한 DNA를 템플렛(template)과 상기 디자인된 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과를 바탕으로 각 곰팡이 특이적으로 증폭되는 프라이머를 최종적으로 선발하였다.
PCR 반응을 수행하기 위해, 50 ml PCR 튜브에 DNA template 1 μL, Forward primer (10 pmol/ul) 1 μL, Reverse primer (10 pmol/ul) 1 μL, 10 X Buffer 3 μL, dNTP (2.5 mM) 4 μL, EX-Taq 0.5 μL를 넣고 최종적으로 증류수로 최종 볼륨을 30 μL로 맞췄다.
Genomic DNA 추출을 위해 경우 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하였다. PCR은 Solg 2X Multiplex PCR Series (SolGent, Daejeon, Korea)를 사용하였다. 곰팡이 PCR 조건은 94℃ 에서 3분, 이어서 94℃에서 20초, 60℃에서 40초 (어닐링 온도는 모든 프라이머에서 동일함), 및 72℃에서 40초 동안 35 사이클이었으며, 72℃에서 5분 동안 최종 신장(final extension)하였다.
증폭된 PCR 결과물들은 전기 영동 후 EtBr 염색을 통해 확인하였다(도 2). PCR 수행 결과 각 곰팡이 특이적 프라이머들은 타겟 곰팡이에서만 PCR 증폭산물(amplicon)을 나타내었다. 또한 증폭된 PCR 산물 사이즈는 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum) 400 bp, 파이티움 종(Pythium sp.) 500 bp, 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 400 bp, 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 100 bp, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 300 bp로 서로 다르게 하여 multiplex가 가능하도록 하였다. 추가적으로 증폭된 모든 PCR 산물들을 pGEM-T-Easy Vector (Promega, Wisconsin, US)에서 클로닝 한 후 Sanger 시퀀싱하여 증폭된 PCR 산물의 서열을 확인하였으며, 이렇게 곰팡이 특이적 프라이머로 증폭된 유전자의 염기서열은 서열번호 11 내지 15에 나타내었다.
최종적으로, PCR 결과를 바탕으로 선발된 고추 곰팡이 특이적 프라이머를 아래 표 4에 나타내었다.
| 곰팡이 | 프라이머 이름 | 5'-프라이머 서열-3' | PCR 산물 크기 | 서열번호 |
| Sclerotinia sclerotiorum | 14-253-600-F4 | GTTATCGTGGAGCAGTCACCC | 600 | 1 |
| 14-253-600-R4 | CGCTTGATCGATTGCCTCAC | 2 | ||
| Pythium sp. | 16-306-500-F3 | TCGCACTGGTTCGTGATTCT | 500 | 3 |
| 16-306-500-R3 | AATGCCACGTACCCTCGTATC | 4 | ||
| Sclerotium rolfsii | 17-453-400-F1 | AAAATCACCGTGCGCGTCTA | 400 | 5 |
| 17-453-400-R1 | CGTGGAGATCATTTCCTTCTGC | 6 | ||
| Phytophthora capsici | 18-488-300-F2 | CCAATACGCCTGCTCTTCGT | 300 | 7 |
| 18-488-300-R2 | TTAGTGTTGTCGGAGCAGGT | 8 | ||
| Fusarium oxysporum | 19-019-200-F1 | ATGTCCGTGAGAAGAGGTCC | 200 | 9 |
| 19-019-200-R1 | ACGTGTTGGCTAGCTTGAGA | 10 |
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> Primer sets for diagnosing five fungi infecting Capsicum annuum
and diagnostic methods using thereof
<130> KPA2021-231
<160> 15
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 14-253-600-F4
<400> 1
gttatcgtgg agcagtcacc c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 14-253-600-R4
<400> 2
cgcttgatcg attgcctcac 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 3
tcgcactggt tcgtgattct 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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aatgccacgt accctcgtat c 21
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<220>
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aaaatcaccg tgcgcgtcta 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17-453-400-R1
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cgtggagatc atttccttct gc 22
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ccaatacgcc tgctcttcgt 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ttagtgttgt cggagcaggt 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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atgtccgtga gaagaggtcc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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acgtgttggc tagcttgaga 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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gttatcgtgg agcagtcacc cacccttcag caaccattaa cattgcaaca cctgcccatt 60
accaaacagc catccagtac cagaccttcc tatagtaatc taagacggat acaaagacag 120
tatcgtgagc acaggcgtcg tcggttactt gagaaattag agcgaattaa gggaaatcac 180
ggacctggga gagtgcaacc ccccaaaaag tccttagggc aatccgatgt cgaagaaggg 240
gatttaagaa tggaattgca ggaggcggaa cgttgtgtgg attggcatga aaagacggct 300
gcggagttgc tcgagaatgt cgatttagag ttagaatctt ttgatcttgt ggaagcgaaa 360
ctcgctgtgg acgtttttat ctcgaaaatc aaggaaagat tagacatgga gaatgtgcgg 420
aagcttttga tcaaggaagc tacgctggag gaatggaaaa agtggggtaa aaagttaatg 480
gatagggcgg atagggcgga tagggagcgc ggaggaggga aaaggaagag tgagggggag 540
ggggagggga accttgtttg gaggtttggt agagactggg gtgaggcaat cgatcaagcg 600
600
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<211> 500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16-306-500
<400> 12
tcgcactggt tcgtgattct cttgacccgg tcgcattgag cccaacgacc tcaccggccc 60
cgtggtcgcg tactatcatc aaggacgcac tcaacgtctt ctgtcctcgt ggtggggact 120
cgttctttga tactaaactc accgctgaat cgcgctttgc gacgcattgg gactcaatct 180
acgtcgaccg agtgacactt cgggtatctt gccgactctg tgatgctacg cgggacgcta 240
ttgagctcta caaacgtcaa gttgaaacag gtcttcgcca acacgagctc ctcttgcgtt 300
gccaggaagc tacgtgggcg accaagaccc cagccgaatg cgaacgactt gtggctgaat 360
ttcgtgccaa gtgcttccca ccagacgctt atattcgtcc tgaatgtgcc gaatggcccg 420
accatcgtct ccttcgtcac atttgtgaac acggaaagct ccaagcgtgg caaattgggg 480
atacgagggt acgtggcatt 500
<210> 13
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17-453-400
<400> 13
aaaatcaccg tgcgcgtcta ccagaccaac ccgaacgcgt tcttccatcc cgtcgaaaag 60
gcagtatgga agtacgccaa cggtggttgc tggaccatta ccgatgacca gcacgttctt 120
atcatgggcg gtagcggcac ctcgggcacc ctgcgcttcc atgctgacaa tggcgagagc 180
ttcactgcca catttggtgt tcacaactac aagcgctggt gcgatatcgt gacgaacctg 240
gcggcggacc agactggcat ggtgatcaac cagcagtatt acgagcagaa ggacagggag 300
gaggctaggg agcgccagct aagcaactat caagtcaaga atgccaaagg aaggaacttc 360
cagatcgttt atactcaggc agaaggaaat gatctccacg 400
<210> 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 18-488-300
<400> 14
ccaatacgcc tgctcttcgt ggtctacgac ccaccgccga tactccgtcg gtcgaagatg 60
acaaggaaga cagaaaagac caccaccatg tcaagaaagt caagaagatc gccattcctg 120
ttcccgttgc tgttgaggtg ccgcaataca tcccggttcc agtcagcgtt ccgtccacgg 180
tggtggccag ctccaacaat gcagtcgtcg gtccctccac gaacgtagct ggccctggtg 240
ctgcttcccc gggagctcca ggaacaccgg gagctgtaac acctgctccg acaacactaa 300
300
<210> 15
<211> 200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19-019-200
<400> 15
atgtccgtga gaagaggtcc tctcagaggg aagtcgctgc gaggtcttgt gtggagcgct 60
catctgctgg cgttgccttc ggtcagtcgg gtcaacacgt ggtggacaga gggaaacgcg 120
atgaagaagg tttactatga gatgtgtaga cgtggactcg gttcgatagt tgctcagtat 180
tctcaagcta gccaacacgt 200
Claims (6)
- 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는,
스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고추 곰팡이 진단용 프라이머 세트.
- 제1항의 프라이머 세트를 포함하는, 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고추 곰팡이 진단용 조성물.
- 제2항의 조성물을 포함하는, 고추 곰팡이 진단용 키트.
- 제3항에 있어서, 상기 키트는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 고추 곰팡이 진단용 키트.
- (a) 시료로부터 고추 곰팡이 핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 핵산을 주형으로 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 파이티움 종(Pythium sp.), 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii), 파이토프토라 캡시사이(Phytophthora capsici) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고추 곰팡이 진단 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 (b) 표적 핵산을 증폭하는 단계는 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)에 의해 수행되는 것인, 진단 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210124692A KR102636357B1 (ko) | 2021-09-17 | 2021-09-17 | 고추에서 발생하는 5종의 곰팡이 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020210124692A KR102636357B1 (ko) | 2021-09-17 | 2021-09-17 | 고추에서 발생하는 5종의 곰팡이 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20230041280A KR20230041280A (ko) | 2023-03-24 |
| KR102636357B1 true KR102636357B1 (ko) | 2024-02-15 |
Family
ID=85872609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210124692A KR102636357B1 (ko) | 2021-09-17 | 2021-09-17 | 고추에서 발생하는 5종의 곰팡이 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102636357B1 (ko) |
-
2021
- 2021-09-17 KR KR1020210124692A patent/KR102636357B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Aradhika Tripathi et al., Archives of Microbiology, 2021.03.08.* |
| J. Yu et al., Letters in Applied Microbiology, 69, pp.64-70, 2019.* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230041280A (ko) | 2023-03-24 |
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