KR102667135B1 - 신종 콩 제미니 바이러스의 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법 - Google Patents
신종 콩 제미니 바이러스의 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는, 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단용 프라이머 세트; 상기 프라이머 쌍을 포함하는 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단용 조성물; 및 상기 프라이머 쌍을 이용하여 콩 제미니 바이러스 SGVB를 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 콩으로부터 신종 콩 제미니 바이러스 SGVB를 동정하였으며, 직접 확보한 신종 콩 제미니 바이러스에 선택적, 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 설계하여 진단의 정확성을 높일 수 있는바, 콩 감염 바이러스의 모니터링 및 바이러스 프리(virus free) 콩 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명은 콩으로부터 신종 콩 제미니 바이러스 SGVB를 동정하였으며, 직접 확보한 신종 콩 제미니 바이러스에 선택적, 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 설계하여 진단의 정확성을 높일 수 있는바, 콩 감염 바이러스의 모니터링 및 바이러스 프리(virus free) 콩 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는, 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단용 프라이머 세트; 상기 프라이머 쌍을 포함하는 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단용 조성물; 및 상기 프라이머 쌍을 이용하여 콩 제미니 바이러스 SGVB를 진단하는 방법에 관한 것이다.
콩［Glycine max (L.) Merrill］은 콩(Fabaceae)과(family)에 속하는 작물로서 자가 수분이 가능한 쌍떡잎 작물중의 하나이다. 콩은 세계에서 매우 중요한 식량작물중의 하나이며, 아시아의 다양한 국가에서는 식물성 기름과 단백질을 공급해주는 매우 중요한 원료이기도 하다.
콩 재배 시, 다양한 병해충에 의한 피해가 많은데, 그 중에서도 재배되고 있는 대부분의 콩 품종들은 다양한 식물 RNA 바이러스에 감수성을 가지고 있어 바이러스 피해를 많이 보고 있다. 전 세계 콩에 피해를 주는 대부분의 바이러스들은 RNA 유전체를 가진 바이러스로 알려져 있다. 현재까지 콩을 감염시키는 DNA 바이러스는 몇몇 종만 알려져 있다. 브라질 중부지역의 콩에서 Geminiviridae과에 속하는 bean golden mosaic virus (BGMV), sida micrantha mosaic virus (SiMoV), okra mottle virus (OMoV)를 포함하는 3종의 베고모바이러스(begomovirus)종이 동정되었다.
최근 본 연구팀에서는 콩에 감염되어 있는 다양한 바이러스를 동정하고 유전체를 분석하였다. 대표적인 콩 감염 바이러스로는 soybean mosaic virus (SMV), soybean yellow mottle mosaic virus (SYMMV), soybean yellow common mosaic virus (SYCMV)있다. 또한 추가적으로 peanut mottle virus (PMV), soybean dwarf virus, clover yellow vein virus, bean common mosaic virus, peanut stunt virus, tomato spotted wilt virus, bean common mosaic necrosis virus들이국내 콩에 감염되었다는 것이 보고되었다. 이처럼 많은 다양한 RNA 바이러스들이 콩에 감염되어 있다는 것이 국내에 보고되어 있지만, 아직까지 한국의 콩에 감염되어 있는 DNA 바이러스에 대한 보고는 전혀 없다.
이에, 본 발명의 발명자들은 RNA-sequencing과 생물정보학 분석을 통하여 1종의 신종 DNA 바이러스인 soybean geminivirus B(SGVB)를 동정하였고, PCR과 Sanger-sequencing을 이용하여 SGVB의 전체 유전체 서열을 밝혔으며, 확보된 유전체 서열을 바탕으로 SGVB를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 PCR 기반 분자 진단 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는, 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 콩 제미니 바이러스 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는, 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 용어 "콩 제미니 바이러스"는 콩에 나타나는 질병의 원인이 되는 바이러스를 의미한다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다.
본 발명에서 콩 제미니 바이러스 진단용은 콩 제미니 바이러스 검출용을 의미한다.
구체적으로, 본 발명에서는 신종 콩 제미니 바이러스 SGVB를 동정하였다. 구체적으로, 상기 콩 제미니 바이러스 SGVB는 서열번호 7의 전체 염기서열로 이루어져 있다.
본 발명에서 상기 신종 또는 변종 콩 제미니 바이러스의 진단을 위한 프라이머는 PCR용 프라이머 쌍을 의미한다. 본 발명의 프라이머 쌍은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하며, 구체적으로는 콩 제미니 바이러스 SGVB를 진단할 수 있는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍을 의미할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 콩 제미니 바이러스 진단용 조성물 및 이를 포함하는 콩 제미니 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로는 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물 및 키트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍과, 추가로 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적 상 상기 키트에서 증폭 반응을 수행하기 위한 시약으로 DNA 폴리머라제(polymerase), dNTPs 및 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 또한 PCR 산물의 증폭 여부를 확인하기 위해 전기영동(electrophoresis)의 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 시료로부터 콩 제미니 바이러스 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 핵산을 주형으로 제1항의 프라이머 쌍을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계의 시료는 본 발명의 콩 제미니 바이러스의 존재 여부를 확인하기 위해 필요한 핵산, 구체적으로는 DNA를 추출하기 위한 미지의 물질을 의미하는 것으로, 예컨대 상기 바이러스가 감염된 콩, 뿌리, 줄기, 콩 잎 등을 포함할 수 있으며, 그밖에도 식품, 천연물(예컨대, 물) 또는 생물학적 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 표적 핵산을 증폭하는 단계는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트를 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는, PCR 조건으로 98℃ 30분, 30 cycles로 [98℃ 10초, 50℃ 30초, 72℃ 30초], 최종적으로 72℃에서 5분을 수행하였다.
상기 (c) 단계에서 증폭된 표적 핵산의 검출은 모세관 전기영동(capillary electrophoresis), DNA 칩, 겔 전기영동(gel electrophoresis), 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는, 증폭된 PCR 산물을 겔 전기 영동에 이어 EtBr 염색으로 확인하였으며, 나아가 pGEM-T-Easy Vector(Promega, Wisconsin, US)에서 증폭된 PCR 산물을 클로닝 한 후 Sanger 시퀀싱하여 증폭된 PCR 산물의 서열을 확인하였다.
본 발명은 콩으로부터 신종 콩 제미니 바이러스 SGVB를 동정하였으며, 직접 확보한 신종 콩 제미니 바이러스에 선택적, 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 설계하여 진단의 정확성을 높일 수 있는바, 콩 감염 바이러스의 모니터링 및 바이러스 프리(virus free) 콩 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 새롭게 디자인한 서열번호 1 및 2의 SGVB 특이적 프라이머를 이용하여 수행한 첫번째 PCR 및 서열번호 3 및 4의 SGVB 특이적 프라이머를 이용하여 수행한 두번째 PCR로 증폭된 앰플리콘을 나타낸다. (M: DNA ladder, 1 및 2: SGVB 감염 샘플로 수행한 PCR 반복 샘플)
도 2는 콩 제미니 바이러스 SGVB의 유전체 구조 모식도를 나타낸 것이다. SGVB는 DNA 단일 가닥으로 구성되어 있고, 총 길이는 2,616 nt 이며, C1, C2, MP, CP를 포함하여 총 4개의 ORF를 포함하고 있다. 숫자는 각 ORF에 대한 nucleotide 위치를 의미한다.
도 3은 콩 제미니 바이러스 SGVB의 전체 유전체 서열을 바탕으로 다른 제미니 바이러스와의 계통학적 관계를 나타낸 것이다. BLASTN을 바탕으로 SGVB와 높은 유사성을 보이는 37개 다른 제미니바이러스 전체 유전체 서열들을 ClustalW로 정렬한 후 MEGA7 프로그램을 이용해 Maximum likelihood 방법으로 계통수를 분석하였다. potato yellow mosaic virus는 outgroup으로 사용하였고, Bootstrap replicate 1000을 사용하였다.
도 4는 SGVB의 replicase 단백질 서열을 바탕으로 SGVB와 다른 20개 제미니바이러스와의 계통학적 관계를 나타낸 것이다. Replicase 단백질 서열을 ClustalW로 정렬한 후 MEGA7 프로그램을 이용해 Maximum likelihood 방법으로 계통수를 분석하였다. Apple stem grooving virus의 replicase단백질 서열이 outgroup으로 사용되었고, Bootstrap replicate 1000을 사용하였다.
도 5는 SGVB 진단을 위해 디자인한 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 증폭된 PCR 산물들을 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 콩 제미니 바이러스 SGVB의 유전체 구조 모식도를 나타낸 것이다. SGVB는 DNA 단일 가닥으로 구성되어 있고, 총 길이는 2,616 nt 이며, C1, C2, MP, CP를 포함하여 총 4개의 ORF를 포함하고 있다. 숫자는 각 ORF에 대한 nucleotide 위치를 의미한다.
도 3은 콩 제미니 바이러스 SGVB의 전체 유전체 서열을 바탕으로 다른 제미니 바이러스와의 계통학적 관계를 나타낸 것이다. BLASTN을 바탕으로 SGVB와 높은 유사성을 보이는 37개 다른 제미니바이러스 전체 유전체 서열들을 ClustalW로 정렬한 후 MEGA7 프로그램을 이용해 Maximum likelihood 방법으로 계통수를 분석하였다. potato yellow mosaic virus는 outgroup으로 사용하였고, Bootstrap replicate 1000을 사용하였다.
도 4는 SGVB의 replicase 단백질 서열을 바탕으로 SGVB와 다른 20개 제미니바이러스와의 계통학적 관계를 나타낸 것이다. Replicase 단백질 서열을 ClustalW로 정렬한 후 MEGA7 프로그램을 이용해 Maximum likelihood 방법으로 계통수를 분석하였다. Apple stem grooving virus의 replicase단백질 서열이 outgroup으로 사용되었고, Bootstrap replicate 1000을 사용하였다.
도 5는 SGVB 진단을 위해 디자인한 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 증폭된 PCR 산물들을 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 콩 제미니 바이러스 연구를 위한 샘플 수집 및 RNA-Sequencing
충청북도 농업기술원 실험 농장에서 실험 재배되고 있는 콩 중, 바이러스 병징을 심하게 보이는 16개의 콩 잎을 수집하였다. 수집된 콩 잎들은 모자이크, 얼룩 반점, 황색등의 심한 바이러스 병징을 보였다. 수집된 콩 잎은 액체질소에 즉시 얼린 후 total RNA 추출 전까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다.
수집된 냉동 잎들은 개별적으로 막자사발과 막자를 이용해 액체질소를 가지고 곱게 갈았다. 샘플별로 곱게 갈은 잎들을 조금씩 합친 후 잎 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용해 total RNA를 추출하였다. 추출된 total RNA는 TruSeq RNA Library Preparation Kit v2 (Illumina, San Diego, U.S.A.)을 이용해 RNA-sequencing용 라이브러리를 제작하였다. 제작된 라이브러리는 HiSeq2000 system 시스템 (Macrogen, Seoul, Korea). 을 이용하여 paired-end (100bp X 2) 방법을 이용해 sequencing을 수행하였다.
실시예 2: 전사체 조립 및 바이러스 식별
RNA-sequencing을 통해 얻어진 raw data는 Trinity 프로그램(https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki)을 이용해 de novo assembly 수행하였다. 조립된 contig들은 NCBI’s Viral genome database에 BLASTX (Evalue 1e-5 as a cutoff)를 수행하여 감염된 바이러스들을 동정하였다. 동정된 콩 바이러스는 bean common mosaic virus, peanut mottle virus, soybean mosaic virus, soybean yellow common mosaic virus, soybean yellow mottle mosaic virus를 포함한 5종의 RNA 바이러스 였으며, 추가로 DNA 바이러스와 유사성을 보이는 2,130bp 길이의 바이러스 관련 contig(SGVB isolate Kong)를 동정하였다.
동정된 DNA 바이러스 관련 contig를 NCBI’s nucleotide 데이터베이스에 BLASTN을 수행한 결과 chickpea chlorotic dwarf virus(CpCDV) strain R isolate BF:Tan:To164:15 (GenBank Ky047533.1)과 73% coverage와 80% nucleotide identity를 보여주었다. BLAST결과를 바탕으로 동정된 바이러스의 이름을 soybean geminivirus B(SGVB) 분리주(isolate) "Kong"이라고 명명하였다.
실시예 3: 신종 콩 제미니 바이러스 Soybean geminivirus B (SGVB) 유전체 증폭 및 유전자 서열 확인
새롭게 동정된 바이러스의 전체 유전체 염기서열을 얻기 위하여, 확보된 contig 염기서열을 바탕으로 아래와 같이 프라이머를 새롭게 디자인하였다.
| 프라이머 | 염기서열 | 서열번호 |
| SGVB1_for | 5’-ATGGTGGGACCCTTTAAAGGTAAC-3’ | 3 |
| SGVB1_rev | 5’- TTATTGATTACCAACGGACTTGAAGTGCA-3' | 4 |
이렇게 디자인된 프라이머와 Phusion high-fidelity DNA polymerase (NEB, Ipswich, U.S.A.)를 이용하여 첫 번째 PCR를 수행하였다(도 1). PCR 온도는 98℃에서 30초 (1회), [98℃에서 10초, 50℃에서 30초, 72℃에서 30초] (30회 반복), 72℃에서 5분 (1회)으로 진행하였으며, 0.2 ml PCR 튜브에 DNA template 1 μL (100ng), Forward primer (10 pmol/ul) 2.5 μL, Reverse primer (10 pmol/ul) 2.5 μL, PCR Buffer 10 μL, dNTP mix (2.5 mM) 4 μL, phusion high-fidelity DNA polymerase 0.5 μL를 넣고 최종적으로 RNase-free 증류수로 최종 볼륨을 50 μL로 맞췄다. 첫 번째 PCR로 얻어진 amplicon을 pGEM-T easy vector(Promega, Madison, U.S.A.)에 클론한 후 Sanger-sequencing을 이용해 sequence를 분석하였다.
그 뒤 확보된 바이러스 염기서열을 바탕으로 2차 프라이머를 아래 표 2와 같이 디자인하였다.
| 프라이머 | 염기서열 | 서열번호 |
| SGVB2_for | 5'- AGTCAACGCTCCATCAAGGT-3’ | 5 |
| SGVB2_rev | 5’- CAGATCCCGTTGGGAGTTAA-3' | 6 |
2차 프라이머와 PrimerSTAR GXL DNA polymerase (Takara, Shiga, Japan)를 이용해 PCR을 다음과 같은 조건으로 수행하였다(도 1). PCR 온도는 98℃에서 5분 (1회), [98℃에서 10초, 55℃에서 15초, 68℃에서 1분] (30회 반복), 68℃에서 5분 (1회) 으로 진행하였으며 0.2 ml PCR 튜브에 DNA template 1 μL (100ng), Forward primer (10 pmol/ul) 2.5 μL, Reverse primer (10 pmol/ul) 2.5 μL, PCR Buffer 10 μL, dNTP mix (2.5 mM) 4 μL, PrimeSTAR GXL DNA polymerase 2 μL를 넣고 최종적으로 RNase-free 증류수로 최종 볼륨을 50 μL로 맞췄다. PCR을 수행한 후 amplicon을 pGEM-T easy vector(Promega)에 클론한 후 Sanger-sequencing을 수행하여 최종적으로 서열번호 7로 표시되는 SGVB 전체 바이러스 유전체 서열을 확보하였다.
실시예 4: 식별된 바이러스의 게놈 분석
확보된 SGVB 염기서열을 바탕으로 SGVB의 open reading frame (ORF)을 ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)를 이용하여 분석한 결과, 총 4개의 ORF를 포함하고 있었다. 각 ORF는 서열번호 8로 표시되는 movement protein(MP), 서열번호 9로 표시되는 coat protein(CP), 서열번호 10으로 표시되는 C2 protein, 서열번호 11로 표시되는 C1 protein을 코딩하는 것으로 확인하였다. 즉, 도 2에 나타낸 구조를 갖는 것으로 확인하였다.
실시예 5: 식별된 바이러스의 계통 발생학적 분석
계통수(phylogenetic tree) 분석을 위해, 4개의 ORF가 코딩하는 단백질 서열들을 NCBI non-redundant 데이터베이스에 BLASTP를 수행하였다.
수행결과, 아래 표 3에 나타낸 바와 같이, SGVB의 MP 단백질은 Chickpea chlorotic dwarf virus(CpCDV)와 92% coverage와 68.89% identity를 갖고, SGVB CP 단백질은 Chickpea redleaf virus 2와 100% coverage와 89.94% identity를 가진다. SGVB C1 단백질은 antisense방향으로 coding되며 CpCDV의 replicase B 단백질과 69% coverage, 71.93% identity를 보여주고, SGVB C2 단백질도 antisense방향으로 coding되며, CpCDV의 replicacase A 단백질과 100% coverage, 77.47% identity를 보여준다.
| SGVB protein | ORF | Size of protein (aa) | Homologous protein | Homologous virus | Accession No. | Coverage | Identity |
| SGVB_MP | 145-438 (sense) |
97 | Movement protein | Chickpea chlorotic dwarf virus | AIY33051.1 | 92% | 68.89% |
| SGVB_CP | 705-1,184 (sense) |
159 | Coat protein | Chickpea redleaf virus 2 | QDA77210.1 | 100% | 89.94% |
| SGVB_C1 | 2,005-2,496 (antisense) |
163 | RepB | Chickpea chlorotic dwarf virus | AHF52852.1 | 69% | 71.93% |
| SGVB_C2 | 1,550-2,431(antisense) | 138 | RepA | Chickpea chlorotic dwarf virus | AMN14229.1 | 100% | 77.47% |
국제바이러스분류위원회(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)의 제미니 바이러스 신종 바이러스 기준은 nucleotide sequence identity가 78% 미만이어야 한다. BLASTN 수행결과 SGVB 분리주 Kong의 경우 Chickpea chlorotic dwarf virus isolate CpCDV_H_SD_SD180_2013(GenBank KM229842.1)와 가장 유사성이 높으며, 두 바이러스 유전체 서열을 Clustal Omega를 이용해 정렬 후 nucleotide identity를 분석한 결과 73.57%로 나타났다. 따라서 SGVB 분리주는 ICTV 규칙에 따라 신종 바이러스라고 할 수 있다.
확보된 SGVB의 전체 염기서열을 바탕으로 다른 제미니바이러스와 계통학적 분석을 수행한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, SGVB는 Mastrevirus 속(genus)에 포함되는 bean yellow dwarf virus (NC_003493.2), CpCDV (NC 011058.1)와 같은 그룹을 이루었다. C1 replicase B 단백질 서열을 바탕으로 다른 제미니바이러스와 계통학적 분석을 수행한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, SGVB는 CpCDV와 같은 그룹을 이루었다. 따라서 SGVB 분리 Kong은 Mastrevirus 속에 속하는 신종 바이러스로 밝혀졌다.
실시예 6: 콩 제미니 바이러스 SGVB의 특이적 진단을 위한 PCR 프라이머 개발
다른 콩 감염바이러스과 구별하여, SGVB만을 진단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 SGVB의 일부 유전자 서열을 이용해서 PCR용 프라이머를 디자인하였다(표 4).
| 프라이머 | 염기서열 | 사이즈(bp) | 서열번호 |
| SGVB_for | ATGGTGGGACCCTTTAAAGGTAAC | 763 | 1 |
| SGVB_rev | TTATTGATTACCAACGGACTTGAAGTACA | 763 | 2 |
상기 표 4의 SGVB 특이적 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하였다.
DNA 추출을 위해 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하였다. PCR은 phusionhigh-fidelity DNA polymerase (NEB, Ipswich, MT, U.S.A.)를 사용하였다. 0.2 ml PCR 튜브에 DNA template 1 μL (100ng), Forward primer (10 pmol/ul) 2.5 μL, Reverse primer (10 pmol/ul) 2.5 μL, PCR Buffer 10 μL, dNTP mix (2.5 mM) 4 μL, phusion high-fidelity DNA polymerase 0.5 μL를 넣고 최종적으로 RNase-free 증류수로 최종 볼륨을 50 μL로 맞췄다.
PCR은 98℃ 30분, 30 cycles로 [98℃ 10초, 50℃ 30초, 72℃ 30초], 최종적으로 72℃에서 5분을 수행한 후 4℃에서 보관하였다. 증폭된 PCR 결과물들은 전기 영동 후 EtBr 염색을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 763bp 길이의 앰플리콘이 SGVB 감염 콩 샘플에서만 증폭되었다. 증폭된 앰플리콘을 pGEM-T-Easy Vector (Promega, Wisconsin, US)에 클론 후 Sanger sequencing을 통해 확인하였으며, 증폭된 SGVB의 일부 유전자 서열은 서열번호 12로 나타내었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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tatacgccat cttacgagtc tgagagttat actgctccgt cgcaggcttc aagtaacaac 240
gagttcggga aagttgtcat cgctttggtt attgttcttg tcgctgtagg tgttgtttat 300
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acaacgaccg aaatagggtt tggaaatacc cctgctaggc ccggttctca acctgcacaa 420
aatggtggga ccctttaaag gtaacgtcta caggaggaag agaggaagga acgctagggt 480
ttatgatgca ctgggtgtta actcccaacg ggatctgagt caacgctcca tcaaggtcta 540
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gtgtaaagtt ttctgctggt ggggctgctt ttctgttaag caatttccca cagggtgcca 660
atgataactg ccgtcacacc aacaagacaa tcttgtacaa gttaatgtgc aagaacagtg 720
tgtatgtgga tgcctctcac tatccgaagg ttttccggtg cccctgtacg ttttggttgg 780
tgtatgacaa atcacctggg tctagtattc ctagtactgg ggatattttc gaaggtcctt 840
cgttgtttcc taataacccg aaggtgtggt cagtttcaag ggcagcatgt catcgctttg 900
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tcaagagatt gggtgttagc actgagtgga agaatagttc cacgggtgat gtaggtgata 1080
taaaagaagg ggcaatgtac attgttgttg ccccttcgca gaagtctgat gtgtatgtaa 1140
atggttattt ccgagtgtac ttcaagtccg ttggtaatca ataaaataag ttttattatg 1200
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acacaaaaaa acagaaacaa aatcacaccc caaacatatt acagtatagt gaccctcagt 1320
tagaaggaga ggcacgttta gtgactcgac gcaacctgag caaaaaatgt ttctccatca 1380
cacatgtaat ggattacaca attagcttca aagtagtctt tctgttgaga tgtcatatta 1440
tgcatccagt cttcgtcgtc attgcaaatg attatggaag ggatcccacc ttttattttc 1500
ttcttttttc catatttagg gttgacagtg tagtcatact ggcaacctat taattgcttc 1560
cagagtggga cgaatttgaa ggggatgtcg tcaatgacgt tgtaggtggc atggtcgtcg 1620
taggtggtgt agtcgatggt tccgttccag taattgtgtc gtccgaggct tcttgcccat 1680
gttgtcttgc cggttctggt tggtccgcag atgtagaggg aggggtgtct ggttctagtc 1740
cctccatcgt cctggttaaa tcagccatcc attcaaggtc agcttgggct tcactatatg 1800
ggactggatg tatatatgtg taagcgtcaa tacttacatg atatagatgt tgttccctcc 1860
aagtggctag gtcttcgtgg cagcgaagat cttcagtgct gatggaaggt acatatgttt 1920
ctggttgtgg tggaaagagc ctgtttgctg agtattctag ccactgtaat ttagtggccc 1980
attcatgagg aaattgttct ttgatcatct cgagatattc ctccttagat gttgcagtct 2040
ggataatagt tctccatcgt gcatcagatt ttgaaggaga gactcgatga tctttgaagt 2100
ctcctctggt tttgacatct ccgtccttag aaatgtattc aaggacttgt ttagagtttc 2160
tagctggttg gatattaggg tgatttcctt caaaatcgaa aaaagaagaa tccctaatac 2220
aaggtttttt atcaagttga ataagagcgt ggtaatgggt agtgccatcc tgatgaaatt 2280
cagtagcaat agcaaggtaa taaataataa aaggtgtaag cttttcccag agaaactcga 2340
agagttcatc tctctgggaa gaacatttgg ggtatgtgag gaaaacatat tttgattgaa 2400
gtctgaatga ggcgttgggt gttcgaggca tattgaagta agttgtgact ccatacagtg 2460
atccccaaac tctattataa cagggcgtgg aggcatggag gcaagggcat tgtggtaatt 2520
tggaaagtaa gtggaattgc acgtggcatt tacttagaaa ttaagtttta aaactttcgc 2580
agaaagtgcc cgggataagg tgggtccacg cccatt 2616
<210> 8
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Movement_protein
<400> 8
Met Glu Arg Leu Leu Tyr Gln Val Phe Pro Val Asn Tyr Thr Pro Ser
1 5 10 15
Tyr Glu Ser Glu Ser Tyr Thr Ala Pro Ser Gln Ala Ser Ser Asn Asn
20 25 30
Glu Phe Gly Lys Val Val Ile Ala Leu Val Ile Val Leu Val Ala Val
35 40 45
Gly Val Val Tyr Leu Ala Tyr Ser Leu Phe Leu Lys Asp Cys Ile Leu
50 55 60
Leu Phe Lys Ala Lys Lys Gln Arg Thr Thr Thr Glu Ile Gly Phe Gly
65 70 75 80
Asn Thr Pro Ala Arg Pro Gly Ser Gln Pro Ala Gln Asn Gly Gly Thr
85 90 95
Leu
<210> 9
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Coat_protein
<400> 9
Met Cys Lys Asn Ser Val Tyr Val Asp Ala Ser His Tyr Pro Lys Val
1 5 10 15
Phe Arg Cys Pro Cys Thr Phe Trp Leu Val Tyr Asp Lys Ser Pro Gly
20 25 30
Ser Ser Ile Pro Ser Thr Gly Asp Ile Phe Glu Gly Pro Ser Leu Phe
35 40 45
Pro Asn Asn Pro Lys Val Trp Ser Val Ser Arg Ala Ala Cys His Arg
50 55 60
Phe Val Val Lys Lys Thr Trp Thr Val Met Leu Glu Cys Asn Gly Val
65 70 75 80
Asp Pro Ser Lys Ala Gln Ser Ala Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly Pro Cys
85 90 95
Asn Gln Val Lys Phe Val Ser Lys Phe Phe Lys Arg Leu Gly Val Ser
100 105 110
Thr Glu Trp Lys Asn Ser Ser Thr Gly Asp Val Gly Asp Ile Lys Glu
115 120 125
Gly Ala Met Tyr Ile Val Val Ala Pro Ser Gln Lys
130 135 140
<210> 10
<211> 293
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C2_protein
<400> 10
Met Pro Arg Thr Pro Asn Ala Ser Phe Arg Leu Gln Ser Lys Tyr Val
1 5 10 15
Phe Leu Thr Tyr Pro Lys Cys Ser Ser Gln Arg Asp Glu Leu Phe Glu
20 25 30
Phe Leu Trp Glu Lys Leu Thr Pro Phe Ile Ile Tyr Tyr Leu Ala Ile
35 40 45
Ala Thr Glu Phe His Gln Asp Gly Thr Thr His Tyr His Ala Leu Ile
50 55 60
Gln Leu Asp Lys Lys Pro Cys Ile Arg Asp Ser Ser Phe Phe Asp Phe
65 70 75 80
Glu Gly Asn His Pro Asn Ile Gln Pro Ala Arg Asn Ser Lys Gln Val
85 90 95
Leu Glu Tyr Ile Ser Lys Asp Gly Asp Val Lys Thr Arg Gly Asp Phe
100 105 110
Lys Asp His Arg Val Ser Pro Ser Lys Ser Asp Ala Arg Trp Arg Thr
115 120 125
Ile Ile Gln Thr Ala Thr Ser Lys Glu Glu Tyr Leu Glu Met Ile Lys
130 135 140
Glu Gln Phe Pro His Glu Trp Ala Thr Lys Leu Gln Trp Leu Glu Tyr
145 150 155 160
Ser Ala Asn Arg Leu Phe Pro Pro Gln Pro Glu Thr Tyr Val Pro Ser
165 170 175
Ile Ser Thr Glu Asp Leu Arg Cys His Glu Asp Leu Ala Thr Trp Arg
180 185 190
Glu Gln His Leu Tyr His Val Ser Ile Asp Ala Tyr Thr Tyr Ile His
195 200 205
Pro Val Pro Tyr Ser Glu Ala Gln Ala Asp Leu Glu Trp Met Ala Asp
210 215 220
Leu Thr Arg Thr Met Glu Gly Leu Glu Pro Asp Thr Pro Pro Ser Thr
225 230 235 240
Ser Ala Asp Gln Pro Glu Pro Ala Arg Gln His Gly Gln Glu Ala Ser
245 250 255
Asp Asp Thr Ile Thr Gly Thr Glu Pro Ser Thr Thr Pro Pro Thr Thr
260 265 270
Thr Met Pro Pro Thr Thr Ser Leu Thr Thr Ser Pro Ser Asn Ser Ser
275 280 285
His Ser Gly Ser Asn
290
<210> 11
<211> 163
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C1_protein
<400> 11
Met Pro Pro Arg Pro Val Ile Ile Glu Phe Gly Asp His Cys Met Glu
1 5 10 15
Ser Gln Leu Thr Ser Ile Cys Leu Glu His Pro Thr Pro His Ser Asp
20 25 30
Phe Asn Gln Asn Met Phe Ser Ser His Thr Pro Asn Val Leu Pro Arg
35 40 45
Glu Met Asn Ser Ser Ser Phe Ser Gly Lys Ser Leu His Leu Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Thr Leu Leu Leu Leu Leu Asn Phe Ile Arg Met Ala Leu Pro
65 70 75 80
Ile Thr Thr Leu Leu Phe Asn Leu Ile Lys Asn Leu Val Leu Gly Ile
85 90 95
Leu Leu Phe Ser Ile Leu Lys Glu Ile Thr Leu Ile Ser Asn Gln Leu
100 105 110
Glu Thr Leu Asn Lys Ser Leu Asn Thr Phe Leu Arg Thr Glu Met Ser
115 120 125
Lys Pro Glu Glu Thr Ser Lys Ile Ile Glu Ser Leu Leu Gln Asn Leu
130 135 140
Met His Asp Gly Glu Leu Leu Ser Arg Leu Gln His Leu Arg Arg Asn
145 150 155 160
Ile Ser Arg
<210> 12
<211> 763
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SGVB_partial_763bp
<400> 12
atggtgggac cctttaaagg taacgtctac aggaggaaga gaggaaggaa cgctagggtt 60
tatgatgcac tgggtgttaa ctcccaacgg gatctgagtc aacgctccat caaggtctat 120
ttccaataga cgtgaatcct tgcaggttgc aacgttcact tggaccagtt ctggtgcggg 180
tgtaaagttt tctgctggtg gggctgcttt tctgttaagc aatttcccac agggtgccaa 240
tgataactgc cgtcacacca acaagacaat cttgtacaag ttaatgtgca agaacagtgt 300
gtatgtggat gcctctcact atccgaaggt tttccggtgc ccctgtacgt tttggttggt 360
gtatgacaaa tcacctgggt ctagtattcc tagtactggg gatattttcg aaggtccttc 420
gttgtttcct aataacccga aggtgtggtc agtttcaagg gcagcatgtc atcgctttgt 480
ggtgaagaag acgtggaccg tgatgcttga gtgtaacggt gttgacccaa gcaaggcgca 540
gagtgcaagt tattatgggc ctggtccgtg taaccaggtg aagtttgtct ccaagttctt 600
caagagattg ggtgttagca ctgagtggaa gaatagttcc acgggtgatg taggtgatat 660
aaaagaaggg gcaatgtaca ttgttgttgc cccttcgcag aagtctgatg tgtatgtaaa 720
tggttatttc cgagtgtact tcaagtccgt tggtaatcaa taa 763
Claims (7)
- 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진, 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단용 프라이머 세트로서,
상기 프라이머 쌍으로 증폭된 콩 제미니 바이러스 SGVB의 PCR 증폭 산물은 763 bp인, 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 콩 제미니 바이러스 SGVB는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것인, 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단용 프라이머 세트.
- 제1항의 프라이머 쌍을 포함하는 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단용 조성물.
- 제3항의 조성물을 포함하는, 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단용 키트.
- 제4항에 있어서,
상기 키트는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단용 키트.
- (a) 시료로부터 콩 제미니 바이러스 핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 핵산을 주형으로 제1항의 프라이머 쌍을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 콩 제미니 바이러스 SGVB 진단 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 핵산은 DNA인 것인, 진단 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210131582A KR102667135B1 (ko) | 2021-10-05 | 2021-10-05 | 신종 콩 제미니 바이러스의 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210131582A KR102667135B1 (ko) | 2021-10-05 | 2021-10-05 | 신종 콩 제미니 바이러스의 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230048763A KR20230048763A (ko) | 2023-04-12 |
| KR102667135B1 true KR102667135B1 (ko) | 2024-05-21 |
Family
ID=85984229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210131582A KR102667135B1 (ko) | 2021-10-05 | 2021-10-05 | 신종 콩 제미니 바이러스의 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102667135B1 (ko) |
-
2021
- 2021-10-05 KR KR1020210131582A patent/KR102667135B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GenBank Accession number MH428830 (2020.08.18.)* |
| Velarde-Felix 등, Revista Mexicana de Ciencias Agricolas, Vol. 9, No. 7, 페이지 1389-1398 (2018.09.28.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230048763A (ko) | 2023-04-12 |
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