KR101651812B1 - 펠라르고늄띠모양반점바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 및 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 펠라르고늄띠모양반점바이러스(PZSV, Pelargonium zonate spot virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 PZSV 진단용 키트 및 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 PZSV를 진단하는 방법에 관한 것으로, PZSV에 대한 감염 여부를 기존 항혈청을 이용한 진단법에 비해 1,000배 이상 정확하고, 빠르게 확인할 수 있으므로, 검역 현장에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

Description

펠라르고늄띠모양반점바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer set for diagnosing Pelargonium zonate spot virus and uses thereof}
본 발명은 펠라르고늄띠모양반점바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1 및 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 펠라르고늄띠모양반점바이러스(PZSV, Pelargonium zonate spot virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 PZSV 진단용 키트 및 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 PZSV를 진단하는 방법에 관한 것이다.
농업적으로 중요한 작물의 대부분은 식물 바이러스 또는 비로이드(viroid) 감염에 의해 수확량 감소 및 품질 저하가 나타나고, 이로 인해 심각한 경제적 손실이 발생하게 된다. 식물 바이러스에 의한 병은 곰팡이 또는 세균에 의한 병과는 다르게 농약을 살포하여 예방하거나 치료하는 것이 불가능하다. 따라서, 식물체나 종자의 바이러스 감염 여부에 대한 정밀하고 신속한 진단은 재배 작물의 바이러스 감염에 의한 피해를 사전에 방지하고, 바이러스 병 관리를 위한 선결요건이다.
펠라르고늄띠모양반점바이러스(PZSV, Pelargonium zonate spot virus)는 지름 25-35nm 크기 입자로 group IV (+) ssRNA 바이러스로서 브로모바이러스과(Bromoviridae) 아누라바이러스속(Anulavirus)으로 분류된다. PZSV는 토마토종자(Lycopersicon esculentum), 국화(Chrysanthemum indicum), 아티초크(Cynara cardunculus) 및 제라늄속(Pelargonium spp.)에 감염될 수 있으며, 토마토에서 종자를 경유하여 꽃가루로 전염되기도 한다. PZSV의 RNA 총 길이는 약 8.48Kb이고, 총 4개의 유전자가 4개의 단백질(2a, 복제, 이동 및 외피단백질)을 암호화하며, G+C 함유량은 43.9%이다.
현재 RNA 바이러스의 진단에는 높은 검출 감도와 편리성을 갖는 RT-PCR 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있다. PCR 방법을 이용하여 바이러스를 진단하는 경우에는, 특이적 반응의 강도가 낮아 감염 여부의 판별이 곤란하거나, 다른 핵산과의 비특이적 반응이 일어나는 것을 대비한 검사 시스템이 필요하다. 또한, 분리주 특이적 프라이머를 사용할 경우 진단에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이 프라이머의 개발이 요구된다.
따라서, 본 발명에서는 PZSV 진단용 최적 프라이머 및 이에 부합하는 검정용 프라이머(nested primer)와 이를 뒷받침할 수 있는 종 특이 프라이머 은행 및 양성 대조구를 제공하여, 식물체로부터 펠라르고늄띠모양반점바이러스를 신속하게 검출할 수 있는 PCR 시스템을 구축하고자 한다.
한편, 한국등록특허 제1248059호에는 '멜론괴저반점바이러스(MNSV)의 멜론 분리주 및 수박 분리주의 동시진단 프라이머 세트 및 이를 포함하는 진단 키트'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2012-0121639호에는 '토마토반점위조바이러스 저항성 판별 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 펠라르고늄띠모양반점바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 펠라르고늄띠모양반점바이러스(PZSV)를 특이적으로 검출할 수 있는 최적의 PCR 프라이머 세트, 검정용 네스티드(nested) PCR 프라이머 세트 및 PCR 반응시 양성 대조구로 이용할 수 있는 DNA 단편을 포함하는 플라스미드를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 펠라르고늄띠모양반점바이러스(PZSV, Pelargonium zonate spot virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 PZSV 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 PZSV를 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 PZSV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, PZSV 진단용 키트 및 RT-PCR을 이용한 PZSV 진단 방법을 이용하면, 가지과 작물을 비롯한 식물들로부터 PZSV에 대한 감염 여부를 항혈청을 이용한 진단법에 비해 1,000배 이상 정확하고, 빠르게 확인할 수 있으므로, 검역 현장에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 펠라르고늄띠모양반점바이러스(PZSV) 감염 증상이 나타난 식물체의 사진이다.
도 2는 PZSV 진단용 프라이머 조합(표 3 참고)을 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과로 PZSV에 대한 특이성 검사를 위한 1차 선발 결과를 나타낸다.
도 3은 PZSV 진단용 프라이머 조합 중 1차 선발을 통해 선별된 프라이머 세트들을 이용하여 양성 대조구와 참고 바이러스인 AMV, BBWV, CLRV, CCMV, PVX, PVY, PDV, PNRSV, TNV, TRV, TSV, TBRV, TBSV 및 TSWV를 주형으로 하여 비특이성 검사를 수행한 2차 선발의 결과(A)와(각 프라이머 세트별 로딩 순서는 양성 대조구, AMV, BBWV, CLRV, CCMV, PVX, PVY, PDV, PNRSV, TNV, TRV, TSV, TBRV, TBSV 및 TSWV의 순서) 2차 선발을 통해 선별된 두 개의 프라이머 세트를 이용하여 기주의 게노믹 DNA와의 비특이성 검사를 수행한 3차 선발의 결과(B)이다.
도 4는 PZSV 진단용 프라이머 세트 4와 19의 민감성 실험 결과(A) 및 검정용 네스티드(nested) PCR 프라이머 선발 결과(B)를 나타낸다. (A)의 음수로 표시된 숫자들은 양성 대조구 플라스미드의 희석농도를 나타낸다.
도 5는 검정용 네스티드 프라이머 PZSV_F2 및 PZSV_R4 프라이머 위치를 포함하며, 비특이적 염기서열을 삽입한 돌연변이-양성 대조구의 염기서열(343bp)을 나타낸다. 검정용 프라이머인 PZSV_F2 및 PZSV_R4 프라이머의 결합 위치는 [_], 염기서열 삽입 위치는 검정색 박스로 표시하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 펠라르고늄띠모양반점바이러스(PZSV, Pelargonium zonate spot virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 본 발명의 PZSV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 1 및 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(조합 4) 및 서열번호 4 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(조합 19)를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 서열번호 1 및 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 서열번호 2 및 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(네스티드 프라이머(nested primer), 조합 9) 및 서열번호 4 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(네스티드 프라이머, 조합 18)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 서열번호 1 및 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(조합 4) 및 서열번호 4 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(조합 19)에 서열번호 2 및 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(네스티드 프라이머, 조합 9) 및 서열번호 4 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(네스티드 프라이머, 조합 18)를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 PZSV 진단용 프라이머 세트는 PZSV 진단용 프라이머 조합 4(PZSV_F1; 서열번호 1 및 PZSV_R4; 서열번호 11)의 RT-PCR 산물에 대한 검정 기능을 가진 네스티드 프라이머 세트(PZSV_F2; 서열번호 2 및 PZSV_R4; 서열번호 11) 및 PZSV 진단용 프라이머 조합 19(PZSV_F4; 서열번호 4 및 PZSV_R6; 서열번호 13)의 RT-PCR 산물에 대한 검정 기능을 가진 네스티드 프라이머 세트(PZSV_F4; 서열번호 4 및 PZSV_R5; 서열번호 12)를 추가로 포함할 수 있다. 1차 RT-PCR 검사 결과의 검정이 필요할 경우, 즉 RT-PCR 산물이 PZSV로부터 유래된 결과인지 확인하기 위하여 이 프라이머 조합에 대한 검정용 프라이머(네스티드 프라이머)를 이용하여 PCR 검사를 실시한다. 이때 RT-PCR 반응 결과가 PZSV 유래에서 비롯되었다면 검정용 PCR에서 양성 반응을 나타낼 것이다.
상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1, 2, 4, 11, 12 또는 13의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 4의 프라이머(18개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트(alkylphosphorothioate) 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, PZSV 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 PZSV 진단용 키트에 있어서, 상기 키트는 서열번호 15의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 15의 염기서열을 갖는 DNA 단편은 PZSV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 또는 PCR 반응에 대한 양성 대조구의 기능을 가진 플라스미드로서 이용될 수 있다(도 5).
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레아제(ribonuclease) 저해제, 내열성 중합 효소 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DNA 폴리머라제는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(RNA dependent DNA polymerase)와 같은 역전사 효소일 수 있으며, 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수 아세포증 바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase; AMV RTase), 마우스 백혈병 바이러스-유래 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase; MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase; RAV-2 RTase)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 버퍼는 역전사 버퍼 및 PCR 버퍼를 모두 포함할 수 있으며, 상기 내열성 중합 효소는 EF Taq 중합 효소일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은
식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, PZSV를 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 총 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물은 게라마크론, 국화쥐손이, 남가새과, 무늬제라늄, 우단쥐손이, 제라늄, 펠라르고늄, 센티드제라늄, 아이비제라늄, 긴꽃쥐손이 등의 쥐손이풀과(Geraniaceae) 또는 토마토, 피망, 고추, 하바네로 고추, 칠리, 가지, 감자, 흰독말풀 및 야생 담배를 포함한 가지과(Solanaceae) 식물일 수 있고, 바람직하게는 가지과 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 토마토일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, PZSV에 감염될 수 있는 식물이면 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 PZSV를 진단하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 펠라르고늄띠모양반점바이러스( PZSV ) 진단용 프라이머의 설계 및 조합
PCR 검사법 개발 대상인 펠라르고늄띠모양반점바이러스(PZSV, Pelargonium zonate spot virus)와 참고 바이러스 주(유사염기서열 및 동일 기주 감염 바이러스) 염기서열을 NCBI에서 확보한 뒤(표 1), BioEdit 버전 7.1.3을 사용하여 다중 정렬(multiple alignment)을 수행하였다.
PZSV 프라이머 제작을 위한 PZSV와 참고 바이러스 주 NCBI 염기서열 정보
바이러스 종류 두문자어 GenBank 등록번호
Pelargonium zonate spot virus PZSV NC_003649
Alfalfa mosaic virus AMV NC_001495
Cowpea chlorotic mottle virus CCMV NC_003543
Citrus leaf rugose virus CLRV NC_003548
Prune dwarf virus PDV NC_008038
Prunus necrotic ringspot virus PNRSV NC_004362
Tobacco streak virus TSV NC_003844
Tobacco necrosis virus TNV M33002
Tomato bushy stunt virus TBSV M21958
Potato virus X PVX NC_011620
Potato virus Y PVY NC_001616
Tomato black ring virus TBRV NC_004439
Broad bean wilt virus BBWV NC_005289
NC_005290
Tobacco rattle virus TRV NC_003805
NC_003811
Tomato spotted wilt virus TSWV NC_002052
NC_002050
NC_002051
프라이머 제작은 DNAMAN DNA analysis software package(DNAMAN version 6.0; Lynnon Biosoft, 캐나다)를 사용하였으며, 프라이머 Tm 값은 51-59℃(프라이머 별, 최고 5℃ 차이)를 조건으로 종 특이적인 염기서열을 탐색하였다(표 2).
PZSV 프라이머 정보
프라이머 명칭 서열(5'→3') 서열번호 길이(bp) 위치
정방향


 PZSV_F1 GTTTCCTAAGGTTCGTGACT 1 20 1,023~1,042
PZSV_F2 CTGTCCTCTACTCTTCCACT 2 20 1,199~1,218
PZSV_F3 TCAGCACGACGAAAGTTC 3 18 1,303~1,320
PZSV_F4 GGTTGGGTGAGTCATTTC 4 18 1,360~1,377
PZSV_F5 TGACCGACGATAAGGAAC 5 18 1,514~1,531
PZSV_F6 TTACCAGTAGTGCCGTTG 6 18 1,664~1,681
PZSV_F7 TTGAGTGAACCGCTGGAT 7 18 1,768~1,785
역방향


 PZSV_R1 ACAAGTTTCAGATTCTCCTCC 8 21 1,168~1,188
PZSV_R2 TGGAAGAGTAGAGGACAGAC 9 20 1,197~1,216
PZSV_R3 CCAACCCTTCCATTCCAA 10 18 1,348~1,365
PZSV_R4 CTTTGTTCCTTATCGTCGG 11 19 1,517~1,535
PZSV_R5 TAAGAACATCAGCCGCCT 12 18 1,550~1,567
PZSV_R6 ACGGCACTACTGGTAACA 13 18 1,662~1,679
PZSV_R7 TCACAGCAAGTCTGCCAT 14 18 1,784~1,801
탐색된 프라이머들은 정방향과 역방향으로 설계하였고, 이것을 기초로 예상 증폭 산물이 80-1,300bp 사이에서 PCR 증폭이 가능한 프라이머 세트를 구성하였다(표 3).
PZSV 진단용 프라이머 조합 및 RT-PCR 산물의 예상 크기
조합 정방향 역방향 RT-PCR 산물 크기(bp)
1 PZSV_F1 PZSV_R1 166
2 PZSV_F1 PZSV_R2 194
3 PZSV_F1 PZSV_R3 343
4 PZSV_F1 PZSV_R4 513
5 PZSV_F1 PZSV_R5 545
6 PZSV_F1 PZSV_R6 657
7 PZSV_F1 PZSV_R7 779
8 PZSV_F2 PZSV_R3 167
9 PZSV_F2 PZSV_R4 337
10 PZSV_F2 PZSV_R5 369
11 PZSV_F2 PZSV_R6 481
12 PZSV_F2 PZSV_R7 603
13 PZSV_F3 PZSV_R4 233
14 PZSV_F3 PZSV_R5 265
15 PZSV_F3 PZSV_R6 377
16 PZSV_F3 PZSV_R7 499
17 PZSV_F4 PZSV_R4 176
18 PZSV_F4 PZSV_R5 208
19 PZSV_F4 PZSV_R6 320
20 PZSV_F4 PZSV_R7 442
21 PZSV_F5 PZSV_R6 166
22 PZSV_F5 PZSV_R7 288
23 PZSV_F6 PZSV_R7 138
상보적 DNA(cDNA)의 합성은 APLV 감염시료의 잎에서 추출한 총 RNA 2㎕를 주형으로, 반응 버퍼(Roche, 스위스) 4㎕, N25-프라이머(50 pmol, NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN N; 서열번호 16)(N25-프라이머를 이용한 핵산의 합성 방법; 한국공개특허 10-2006-0121442) 3㎕, 2mM dNTP(Enzynomics, 한국) 2㎕, RNasin(Promega, 미국) 0.7㎕, M-MuLV 역전사효소(Roche, 스위스) 1.6㎕ 및 탈이온 증류수 6.7㎕를 넣어 총 볼륨을 20㎕로 하여 수행하였다. 그 후, 합성된 cDNA 1㎕를 주형으로, Fast PCR PreMixture(Plutos, 한국) 10㎕에 25 pmol의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 1㎕씩 포함하여, 총 볼륨 20㎕에 맞추어 PCR 반응을 진행하였다. 원 스텝(One step) RT-PCR을 수행하는 경우에는, RT-PCR PreMixture(Plutos, 한국)를 사용하였으며, 42℃에서 60분의 역전사반응 이후 PCR과 동일한 조건으로 수행하였다. PCR 조건은 최초 95℃에서 10분의 변성 후, 95℃에서 45초, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분 과정을 35회 반복하고 마지막으로 72℃에서 5분 동안 반응하였다. 모든 PCR 산물은 1.2% 아가로스 겔 150㎖에 TopRed nucleic acid gel stain(Biopure, 영국) 4㎕를 넣어 80분간 전기영동 하였으며, UV 하에서 형성된 특이밴드를 확인하였다.
실시예 2. PZSV 진단용 최적 프라이머 세트 선발 및 진단용 프라이머 은행 구축
PZSV의 진단용 최적 프라이머 세트의 선발을 위해 설계한 23가지 프라이머 조합으로 1~3차까지의 선발 과정을 진행하였다.
진단용 프라이머의 1차 선발은 표 3의 프라이머 세트 조합들을 사용하여 PCR 또는 RT-PCR로 PZSV에 특이적인지를 확인하여 선발하였고, 2차 선발은 1차 선발 과정을 통해 선별된 프라이머 세트들을 사용하여 참고 바이러스 주(염기서열 유사바이러스 및 공통 감염 기주에 감염될 수 있는 바이러스, 표 1 참고)를 PCR 또는 RT-PCR 수행하여 비특이적인 결과를 확인하는 방법으로 선발하였다. 선발된 프라이머는 기주에서 총 RNA를 추출하여 검사에 사용하였으므로, 기주의 게노믹 DNA에도 비특이적이어야 한다. 따라서 3차 선발은 2차 선발에서 선택되어진 프라이머 세트를 사용하여 기주의 게노믹 DNA에 비특이적인 것을 PCR로 확인하였다. 또한 검정용 네스티드(nested) PCR의 혼합물은 Fast PCR PreMixture 10㎕, PCR 산물인 주형 DNA 1㎕, 정방향 및 역방향 프라이머 각 1㎕를 넣어주었으며, 탈이온 증류수를 이용하여 총 볼륨이 20㎕가 되도록 하였다. 이때, RT-PCR 산물의 밴드가 강하게 형성된 경우에는 1/100로, 약하게 형성된 경우는 1/10로 희석하였으며, 밴드를 형성하지 않은 경우에는 RT-PCR 산물의 원액을 주형으로 사용하여 반응을 수행하였다. 검정용 PCR 조건은 전술한 RT-PCR 수행 조건에서 역전사반응 단계인 42℃, 60분의 과정을 제외하고 동일하게 수행하였다.
펠라르고늄띠모양반점바이러스(PZSV, Pelargonium zonate spot virus)의 분석을 위하여 선정된 23개 PCR 프라이머 세트를 이용하여 제작된 플라스미를 대상으로 검출결과를 비교하였다. 특정밴드 형성을 확인하기 위한 분석결과, 적용된 23개의 프라이머 세트 모두에서 138~779bp 크기의 밴드가 형성되었다(도 2). 23개 조합의 결과에서 증폭위치를 고려하여 특정밴드를 형성한 7개 조합(3, 4, 5, 10, 12, 16 및 19)을 1차 선발대상으로 선정한 후, 2차 선발과정을 수행하였다.
PZSV의 양성 대조구와 특이성을 확인하기 위한 AMV, BBWV, CLRV, CCMV, PVX, PVY, PDV, PNRSV, TNV, TRV, TSV, TBRV, TBSV 및 TSWV의 참고 바이러스들을 대상으로 1차 선정된 7개 조합의 프라이머 세트를 적용한 결과, 프라이머 세트 3, 5, 10, 12 및 16에서는 비특이적 밴드를 형성한 반면, 프라이머 세트 4와 19에서는 참고 바이러스에 대하여 밴드를 형성하지 않아, PZSV에 대한 프라이머의 특이성을 확인할 수 있었으며, 이중 프라이머 세트 4와 19를 PZSV를 분석하기 위해 적합한 프라이머로 선발하였다(도 3A).
한편, PZSV의 검출에 대해서는 토마토에서 PZSV의 발생가능성이 제기됨에 따라 식물체의 게노믹 DNA를 주형으로 특이성을 재분석하였다. 프라이머 세트 4와 19를 적용하여 재분석을 수행한 결과, 모두 비특이적 밴드가 형성되지 않음에 따라, 프라이머 세트 4와 19를 최종 적합 프라이머로 선정하고 민감도 분석을 수행하였다(도 3B).
실시예 3. PZSV 진단용 프라이머 세트 민감도 측정 및 검정용 네스티드 프라이머 제작
제작된 1ng/㎕의 플라스미드는 10-10까지 10단계 희석하여 특이도 분석에서 선정된 프라이머 세트 4와 19를 적용하고 분석한 결과, 프라이머 세트 4는 10-7까지 특정밴드를 형성하였으며, 프라이머 세트 19도 10-7까지 특정밴드가 형성되는 것을 확인하였다(도 4A).
최종 선정된 RT-PCR 프라이머 세트로부터 검정용 네스티드(nested) PCR 분석을 위한 네스티드 PCR 프라이머를 다시 선발하여 최종 분석용 프라이머를 선정하고자 하였다. 프라이머 세트 4를 위한 네스티드 PCR 프라이머는 총 4 세트(PZSV_F2/R1; F2/R3; F2/R4; F3/R4)가 선정되었으며, 프라이머 세트 19를 위한 네스티드 PCR 프라이머 역시 총 3 세트(PZSV_F4/R4; F4/R5; F5/R6)를 선정하여 평가를 수행하였다. 프라이머 세트 4에 대해서는 4 세트의 네스티드 프라이머 모두 특정 밴드가 형성되었으나, RT-PCR 산물과 증폭 크기를 고려하고, 염기서열 분석을 하였을 때 문제가 없으며 가장 뚜렷하고 밝은 밴드를 형성하는 337bp의 산물이 증폭된 PZSV_F2/R4가 가장 적합한 것으로 판단되었다. 프라이머 세트 19에 대해서도 검정용 PCR에서 모두 특정밴드가 형성되었으나 208bp를 증폭하는 PZSV_F4/R5 네스티드 프라이머 세트가 가장 적합한 것으로 판단되었다(도 4B).
이상의 결과들로부터 PZSV를 분석하기 위한 RT-PCR 프라이머 조합은 프라이머 세트 4(PCR 산물 크기 513 bp)와 19(PCR 산물 크기 320 bp)으로 최종 선정되었으며, 각각의 검정용 네스티드(nested) PCR의 증폭 산물들은 각각 337bp와 208bp로 나타났다(표 4).
PZSV의 최종 RT-PCR과 네스티드 PCR 진단용 프라이머 조합 및 산물의 크기
프라이머 염기서열 서열번호 프라이머
길이(bp)		 증폭 산물
길이(bp)
세트 PCR 종류 이름

4

 RT PZSV_F1 GTTTCCTAAGGTTCGTGACT 1 20 513
PZSV_R4 CTTTGTTCCTTATCGTCGG 11 19
Nested PZSV_F2 CTGTCCTCTACTCTTCCACT 2 20 337
PZSV_R4 CTTTGTTCCTTATCGTCGG 11 19

19

 RT PZSV_F4 GGTTGGGTGAGTCATTTC 4 18 320
PZSV_R6 ACGGCACTACTGGTAACA 13 18
Nested PZSV_F4 GGTTGGGTGAGTCATTTC 4 18 208
PZSV_R5 TAAGAACATCAGCCGCCT 12 18
실시예 4. PZSV 진단용 유전자변형 양성대조구 제작
선발된 프라이머 세트 구간을 포함하는 PCR 산물을 증폭하였으며, 삽입 DNA로 pGEM-T easy 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하였다. 5개 클론을 염기서열 분석하였고, 프라이머 세트 부착부위가 일치하는 하나의 클론을 선정하였다. 선발된 클론을 대상으로, 네스티드(nested) 프라이머 세트 증폭부위 안쪽으로 제한효소가 반응할 수 있는 염기서열인 6개의 뉴클레오티드를 위치지정돌연변이(site-directed mutagenesis) 키트(Enzynomics, 한국)를 이용하여 삽입하였다. 국내에 시판되는 EZchangeTM 위치지정돌연변이 키트는 돌연변이를 가진 프라이머로, 플라스미드 DNA를 주형으로 새로운 돌연변이를 가진 선형 플라스미드를 PCR 방법으로 증폭한 다음 원래의 플라스미드를 제거하고 말단 키네이션(kination)과 라이게이션(ligation)을 동시에 수행하고, 형질전환을 수행하는 3단계의 반응을 사용하는 방법으로, Xho I (CTCGAG)의 제한효소 자리를 삽입하였다.
검정용 네스티드(nested) PCR 이후 염기서열을 분석한 결과, 6개의 염기서열이 삽입된 것을 모두 확인할 수 있었으며(그림 5), 이에 따라 PZSV 검사에 양성대조구로 상기 제작된 플라스미드를 사용할 경우, 시료분석에서 나타날 수 있는 교차오염의 가능성을 염기서열 분석에 의해 감지하고 판단할 수 있기 때문에, 종자시료 분석에 적용이 가능할 것으로 판단되었다.
<110> REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Primer set for diagnosing Pelargonium zonate spot virus and uses thereof <130> PN13420 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtttcctaag gttcgtgact 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctgtcctcta ctcttccact 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tcagcacgac gaaagttc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggttgggtga gtcatttc 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgaccgacga taaggaac 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttaccagtag tgccgttg 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ttgagtgaac cgctggat 18 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 acaagtttca gattctcctc c 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tggaagagta gaggacagac 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ccaacccttc cattccaa 18 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctttgttcct tatcgtcgg 19 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 taagaacatc agccgcct 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 acggcactac tggtaaca 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tcacagcaag tctgccat 18 <210> 15 <211> 343 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PZSV positive control <400> 15 ctgtcctcta ctcttccact attattgtga acggaatgac tatgatggcc ggagaaaggc 60 tagacgttct tgattatcac cacgtggcct tttccctcat gttatcagca cgacgaaagt 120 tcgatatgtt cgggaaagca atgaattcgt tggaatggaa gggttgggtg agtcatttct 180 ttaaatctct ttggccctct ctcgaggggg accttcggga cctattcgga cgttattttc 240 ctagtttgat tcgttattac gacaaaattg agtttgttga aaaacttact cattgcgaag 300 ttttcgtgaa cgaactgggg atgaccgacg ataaggaaca aag 343 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 25

Claims (9)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 펠라르고늄띠모양반점바이러스(PZSV, Pelargonium zonate spot virus) 특이적 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 2 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 PZSV 특이적 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  4. 제1항 또는 제3항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, PZSV 특이적 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 DNA 단편을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 PZSV 특이적 진단용 키트.
  6. 제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 PZSV 특이적 진단용 키트.
  7. 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제3항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, PZSV를 특이적으로 진단하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 식물은 가지과(Solanaceae) 식물인 것을 특징으로 하는 PZSV를 특이적으로 진단하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 PZSV를 특이적으로 진단하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of General Virology (2003), vol. 84, pp. 3143-3151.
Plant disease, May 2007, Vol. 91, No. 5, pp99-104.
Plant Pathol J. 2013 Mar;29(1):99-104.

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