KR102409004B1 - Emdv를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 EMDV (Eggplant mottled dwarf virus)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 5개의 프라이머 세트는 EMDV를 특이적으로 검출할 수 있으므로, EMDV의 국내로의 도입을 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 사료된다.

Description

EMDV를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도{Specific primer set for detecting Eggplant mottled dwarf virus and uses thereof}

본 발명은 EMDV (Eggplant mottled dwarf virus)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

기후 변화에 따른 생태계 변화와 식물바이러스의 진화와 변이 등에 의해서 식물바이러스 감염 및 피해 양상이 변화하고 있다. 또한, 최근 국제교역과 다양한 식물들의 수출입 증가는 새로운 해외 식물바이러스들의 국내 유입 가능성을 높이고 있다.

2000년 이후 미국, 호주, 중국 등 여러나라에서 식물검역을 강화하고 있다. 이것은 새로운 병해충의 침입을 막기 위한 비용이 새로운 병해충이 침입하여 발생하는 피해액과 방제비를 합한 비용과 비교할 때 훨씬 경제적이기 때문이다.

EMDV (Eggplant mottled dwarf virus)는 랍도비리대(Rhabdoviridae) 과의 뉴클레오랍도바이러스(Nucleorhabdovirus) 속에 속하는 식물 바이러스로서, 주로 담배, 가지 또는 토마토 등의 많은 종들에서 광범위하게 발생된다. EMDV에 감염되면 식물의 왜소화, 잎의 크기 감소 및 컬링 현상, 괴경의 감소 현상 등이 발생한다. 또한 EMDV는 검역대상 병원체로서, 수입되는 식물체로부터 이를 검출할 수 있는 효과적인 진단법을 필요로 한다.

현재, RNA 바이러스의 검출에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있고, 병원체의 PCR 검출을 위해서는 종 특이적인 프라이머 개발이 가장 중요하다. 특히, 식물검역에서 활용되는 검사법은 종내 존재하는 다양한 변이체를 포괄적으로 진단할 수 있어야하며, 검역검사 대상인 식물품목에서 비특이 반응을 나타내지 않아야 한다.

한편, 한국등록특허 제1552222호에는 'EMDV를 특이적으로 진단 또는 검출하기 위한 프로브 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1928445호에는 '가지과 작물 바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한 가지과 작물 바이러스 검출 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 'EMDV를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다. 또한, 해당 바이러스에 대한 PCR 검사법이 개발되어 있더라도 바이러스의 특성상 지속적으로 염기서열 변이가 발생하기 때문에, 이러한 다양한 변이 시퀀스를 갖는 종내 분리주들을 아우를 수 있는 PCR 검사법으로 고도화될 필요성이 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 Eggplant mottled dwarf virus (EMDV)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 개발하기 위해 공지된 데이터베이스에서 EMDV의 핵산 정보를 수집하여 총 16개의 후보 프라이머 세트를 설계한 후, 대상 바이러스와의 특이적 반응을 보이는 후보 프라이머 세트 11개를 1차 선발하였고, 1차 선발된 프라이머 세트 중 근연종 바이러스에 비특이적 반응을 보이지 않는 5개의 후보 프라이머 세트를 2차 선발하였으며, 2차 선발된 프라이머 세트들의 식물 유래 핵산에 대한 비특이적 반응 여부를 통해 상기 5개의 후보 프라이머 세트를 최종 선발하였다. 또한, 최종 선발된 프라이머 세트에 대한 민감도를 분석한 결과, 본 발명에 따른 프라이머 세트들은 1 ~ 10^-4 ng 수준의 RNA 농도까지 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 4 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 17의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 8 및 19의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 8 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 8 및 21의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 EMDV (Eggplant mottled dwarf virus)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, EMDV를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 조성물을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, EMDV를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 EMDV (Eggplant mottled dwarf virus)를 특이적으로 검출할 수 있는 5개의 프라이머 세트는 EMDV를 쉽고 빠르게 검출할 수 있으므로, EMDV의 국내로의 도입을 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 사료된다.

도 1a 내지 도 1c는 NCBI GenBank에서 활용가능한 51개의 EMDV (Eggplant mottled dwarf virus) 시퀀스 정렬 결과 및 EMDV 검출용 후보 프라이머의 위치를 보여준다.
도 2는 EMDV 양성 시료를 이용한 후보 프라이머 세트의 검증 결과이다.
도 3a 및 도 3b는 근연종 바이러스 4종[LBVaV (Lettuce big-vein associated virus), MMV (Maize mosaic virus), PYDV (Potato yellow dwarf virus) 및 SYNV (Sonchus yellow net virus)]을 이용한 후보 프라이머 세트의 검증 결과이다.
도 4는 EMDV 검역검사 대상 식물체 시료를 이용한 후보 프라이머 세트의 검증 결과이다.
도 5는 End-point 테스트를 통한 후보 프라이머 세트의 검출 한계 분석 결과이다.
도 6은 PCR 검사를 위해 제작된 양성대조구 클론의 염기서열에서, 최종 선택된 후보 프라이머 세트들의 위치를 보여준다.
도 7은 PCR 검사를 위해 제작된 양성대조구 클론을 대상으로 후보 프라이머 세트를 이용한 PCR 반응 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 4 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 17의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 8 및 19의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 8 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 8 및 21의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 EMDV (Eggplant mottled dwarf virus)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 조성물을 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트 조성물은 바람직하게는 상기 5개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 가장 바람직하게는 5개의 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 4, 7, 8, 13, 17, 19, 20 및 21의 서열 내의 16개 이상, 17개이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 4의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 4, 7, 8, 13, 17, 19, 20 및 21의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명의 서열번호 4, 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향(forward) 프라이머이며, 서열번호 13, 17, 19, 20 및 21의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향(reverse) 프라이머이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, EMDV (Eggplant mottled dwarf virus)를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레아제(ribonuclease) 저해제, 내열성 중합 효소 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DNA 폴리머라제는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(RNA dependent DNA polymerase)와 같은 역전사 효소일 수 있으며, 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수 아세포증 바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase; AMV RTase), 마우스 백혈병 바이러스-유래 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase; MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase; RAV-2 RTase)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 버퍼는 역전사 버퍼 및 PCR 버퍼를 모두 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 키트는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 양성대조구를 추가로 포함할 수 있다. 상기 서열번호 22의 염기서열은 본 발명에서 선택된 5개의 프라이머 세트(총 8개의 올리고뉴클레오 프라이머)가 각각 비특이적 반응 없이 각 프라이머 세트의 예측되는 증폭 산물 크기와 동일한 크기의 증폭산물을 생산할 수 있도록 프라이머 염기서열과 인위적인 염기서열을 추가하여 인공적으로 합성한 염기서열로(도 6), DNA 단편 또는 상기 염기서열을 포함하는 벡터의 형태 등으로 키트에 포함될 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 조성물을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, EMDV (Eggplant mottled dwarf virus)를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 총 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물은 가지, 고추, 담배, 오이, 토마토, 파프리카, 인동덩굴, 돈나무, 까마중 등의 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, EMDV에 감염될 수 있는 식물이면 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 EMDV를 검출하는 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Eggplant mottled dwarf virus (EMDV)를 검출하기 위한 프라이머 세트 설계

NCBI GenBank에서 활용가능한 51개의 EMDV 시퀀스(2021년 1월 기준)를 서열 정렬하고(도 1), 이 결과를 통해 EMDV 특이적 검출을 위한 후보 프라이머를 설계하였다(표 1).

설계된 후보 프라이머 세트를 검증하기 위해서는 균주(타겟 바이러스 및 근연종)에 대한 특이성 테스트 및 검사품목에 대한 비특이적 산물 생성 여부 확인이 필요하였다. 본 발명에 사용될 근연종 바이러스는 LBVaV (Lettuce big-vein associated virus), MMV (Maize mosaic virus), PYDV (Potato yellow dwarf virus) 및 SYNV (Sonchus yellow net virus)이다. 상기 타겟 바이러스 및 근연종 바이러스는 모두 Agdia Inc.(USA)에서 구입하여 사용하였다. 검사품목 식물체는 가지, 고추, 담배, 오이, 토마토 및 파프리카이다. 상기 식물체는 바이러스 무감염으로 판단되는 종자나 묘를 구입하여 사용하였다.

실시예 2. EMDV를 검출하기 위한 프라이머 세트의 검증

상기 실시예 1을 통해 설계한 후보 프라이머 세트의 검증 및 선발을 위해 PCR을 수행하였다. 총 RNA 시료는 RNeasy plant mini kit (QIAgen, Germany)를 사용하여 추출하였다. RT-PCR은 RT-PCR Premix (PLUTOS, Korea; P사), AccuPower RT-PCR PreMix & Master Mix (Bioneer, Korea; B사), SuPrimeScript RT-PCR Premix (GeNet Bio, Korea; G사)를 이용하여 수행되었으며, 혼합물의 조성 및 반응 조건은 하기 표2 및 표 3과 같다.

RT-PCR mixture

Component	Volume (㎕)
Total RNA	1
Forward primer (10 pmole)	1
Reverse primer (10 pmole)	1
D.W.	6
N25 primer (50 pmole)	1
Premix	10
Total	20

RT-PCR condition

Step	Temperature (℃)	Time
1. Reverse transcription	42	60 min
2. Initial denaturation	94	5 min
3. Denaturation	95	30 sec
4. Annealing	60	30 sec
5. Extension	72	1 min
Go to step 3, 31 cycles
6. Final extension	72	5 min
7. Storage	12	∞

2-1. EMDV 종 특이성 확인

먼저, EMDV 양성 시료를 이용한 후보 프라이머의 검증을 실시하였다.

EMDV 감염 시료를 이용하여 16개 후보 프라이머 세트를 검증한 결과, 예상되는 산물 크기 외에 비특이적 반응이 나타난 프라이머 세트 no. 6, 7, 8, 10, 16을 제외한 11개 (no. 1, 2, 3, 4, 5, 9, 11, 12, 13, 14, 15)의 프라이머 세트가 1차로 선발되었다(도 2).

2-2. 근연종 바이러스를 이용한 후보 프라이머 세트의 검증

1차로 선발된 11개의 프라이머 세트를 이용하여 4종 근연 바이러스를 대상으로 비특이 반응 여부를 확인한 결과, 비특이 반응이 나타난 프라이머 세트 no. 1, 2, 3, 5, 14, 15를 제외한 5개 (no. 4, 9, 11, 12, 13)의 프라이머 세트가 선발되었다(도 3).

2-3. 검사대상 식물체를 이용한 후보 프라이머 세트의 검증

2차로 선발된 5개의 프라이머 세트를 이용하여 6종의 검사대상 식물체를 대상으로 5개 프라이머 세트의 비특이 반응 여부를 확인한 결과, 상기 5개 (no. 4, 9, 11, 12, 13)의 프라이머 세트 모두가 비특이적 반응을 나타내지 않아, 해당 프라이머 세트 모두를 최종적으로 선발하였다(도 4).

2-4. End-point 테스트를 통한 후보 프라이머 세트의 검출 한계 분석

최종 선발된 5개의 프라이머 세트의 검출 한계를 확인하기 위해, 총 RNA 주형을 100, 10, 1, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 ng의 농도로 달리하여 민감도 분석을 수행하였다. 그 결과, 최종 선발된 모든 프라이머 세트는 RT-PCR premix 제품에 상관없이 1 ng의 RNA 농도까지 검출할 수 있었으며, RT-PCR premix 제품에 따라 주형 농도 10^-4 ng에서도 타겟 밴드가 확인되는 것이 관찰되었다(도 5). 상기 결과를 통해 본 발명의 프라이머 세트가 우수한 민감도를 가진 마커임을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 양성대조구 클론을 제작하기 위한 염기서열 설계 및 검증

본 발명자는 최종 선택된 프라이머 세트들의 PCR 검사 시 양성대조구로 사용될 수 있는 양성대조구 클론을 제작하였다. 상기 양성대조구 클론은, 본 발명에서 최종적으로 선택된 5개의 프라이머 세트(총 8개의 올리고뉴클레오 프라이머)가 각각 비특이적 반응 없이 각 프라이머 세트의 예측되는 증폭산물 크기와 동일한 크기의 증폭산물을 생산할 수 있도록 프라이머 염기서열과 인위적인 염기서열을 추가하여 설계한 염기서열(서열번호 22, 도 6)이다. 본 발명자는 양성대조구 염기서열을 설계한 후, pMG-Amp 벡터(Macrogen, 한국)에 클로닝된 형태로 준비하였다.

제작된 양성대조구 클론의 효율성을 확인하기 위해서, 1 ng 및 10^-1 ng의 양성대조구 클론을 주형으로 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 혼합물의 조성은 표 2에서 Total RNA와 N25 프라이머를 제외한 구성과 동일하고, 반응 조건은 표 3에서 역전사(Reverse transcription) 반응을 제외한 구성과 동일하게 수행하였다. 그 결과, 도 7에 개시된 바와 같이, 본 발명에서 최종적으로 선택된 5개의 프라이머 세트는 모두 예상되는 크기의 PCR 산물을 증폭하는 것을 알 수 있었고, 이를 통해 제작된 양성대조구 클론이 PCR 검사 시 본 발명의 프라이머 세트에 대한 양성대조구로 효과적으로 기능할 수 있음을 알 수 있었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Specific primer set for detecting Eggplant mottled dwarf virus and uses thereof <130> PN21472 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtrgccaaga ctgtagaatc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcargtrtac aagatgctcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 catgaagagr ccagcrccag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cgctcagarg aacgattagg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gagatagtca atcaagcagg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgtccggtag ctatcatctg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 grggaccagt catacadagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cckgaatgca cytactggga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggrtcmacat ggcatctgtg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agrgtatcca cccttatagg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctggygctgg yctcttcatg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cctaatcgtt cytctgagcg 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 catcytgaac ytcactactc c 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cctgcacgga tgttttcttg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gcthtgtatg actggtccyc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tcccagtarg tgcattcmgg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cacagatgcc atgtkgaycc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cctataaggg tggatacyct 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gtgccacagt atgtrtcytc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tgaacaggya accatggtcc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ctgctgatgt tgcacatrtc 20 <210> 22 <211> 1452 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> positive control <400> 22 aaatgttcac cgtctaccct aagccgattc gaggaccagt catacaaagc tggacttgaa 60 ctctagcgtt catccatcac ggtagtcatt caagaaggag cccagtgtca cgagagacgt 120 ttctcacggc ccatccgagc aggtggccct gacggttaat tgactcctga ggcaaatcaa 180 acgggaataa ttgcagttcc cgattgtagc gaaaccttaa gatccatgag gaagaagcta 240 gtgcaggcgg accgaagaat cttagttacc attggtctac aaaagcttgt gctcaggtca 300 ggtcatcgcg tcagaaatcg aggggacgtg cctccggaat gcacctactg ggaattggct 360 aaacgacaag tccatcttcg tctcgaatct acgaatggat ccaatgggac tgttatcctc 420 attgccactg gaggcgaatg accatactgg tcagaagtcc cgactcctcg acgctaatca 480 ctaatttggc aatcctgagt gttgaagctc tacgctattg gtcgaaccta gcaataccgc 540 ccgattgcta tccagagctt ctcacattcc tggcataata agccactgcc gagcttatac 600 ttagtcctaa cagacaaacg tctgccaaat gtacgctcag aagaacgatt aggtgccaga 660 tgacaggcat tagccgttga tcagggtcca catggcatct gtgrattgcg cttacaaaga 720 gacccactct gcccagattc agggcaaccg agatgcgcct atggaaggca ggtcaggaaa 780 ctacattcaa atcttaacag agtcagacag gaactgtcct ggcccggatc gtaacgagga 840 tacatactgt ggcacrtttg cctcgataaa tcggatcacg ttaaagcaat ctcgaggcaa 900 gtccttcact ggatggactt aggctcggac catggttgcc tgttcarcgg tataaggctg 960 atttctgtaa gaccgagggc gagatttccg caagtccgat gcaccgcatt aagcggagtt 1020 tacggatcca taaagctatt agccgattcc aggagtagtg aggttcagga tgrccgtcag 1080 agaagacata ggtgactcta gctatagaat cgatatgtgc aacatcagca graataacgg 1140 cagaggtgga tacagatgtt tggtccaagt ctggatggct ccagttcatg attgatagct 1200 cctgcgaacg acgagctgga tagtaatgcg aactgtcgaa ttacttcggg cacgatgtcg 1260 acttccaagt gaggcttgga tgcggaagat gtgaggtcag ttcctcagca acagagctac 1320 ctggagatcc gactcgctta gatacatggg aacacctgca atcggtcagc cattgaagaa 1380 atgctagccc ttgaggattg tgtgagcaca atattgccga taggtataaa gcaatggatg 1440 acagcaacca aa 1452

Claims (6)

1. 서열번호 4 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 17의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 8 및 19의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 8 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 8 및 21의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 EMDV (Eggplant mottled dwarf virus)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 조성물.
2. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, EMDV (Eggplant mottled dwarf virus)를 특이적으로 검출하기 위한 키트.
3. 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
4. 제2항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 양성대조구를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
5. 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 조성물을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, EMDV (Eggplant mottled dwarf virus)를 특이적으로 검출하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.

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