KR102279794B1 - 감자 황반 모자이크 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감자 황반 모자이크 바이러스 (Potato aucuba mosaic virus; PAMV)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 3개의 프라이머 세트는 PAMV를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 식물체의 PAMV 감염에 의한 피해를 경감시키는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

Description

감자 황반 모자이크 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도{Specific primer set for detecting Potato aucuba mosaic virus and uses thereof}

본 발명은 감자 황반 모자이크 바이러스 (Potato aucuba mosaic virus)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

기후 변화에 따른 생태계 변화, 식물과 바이러스의 진화와 변이, 그리고 바이러스 매개곤충이 증가함에 따라 바이러스 피해가 확산되고 있다. 또한, 최근 국제교역과 다양한 식물들의 수출입 증가는 새로운 식물 바이러스의 국내 유입 가능성을 높이고 있다.

2000년 이후 미국, 호주, 중국 등 여러나라에서 식물검역을 강화하고 있다. 이것은 새로운 병해충의 침입을 막기 위한 비용이 새로운 병해충이 침입하여 발생하는 피해액과 방제비를 합한 비용과 비교할 때 훨씬 경제적이기 때문이다.

현재, RNA 바이러스의 검출에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있고, 병원체의 PCR 검출을 위해서는 종 특이적인 프라이머 개발이 가장 중요하다.

감자 황반 모자이크 바이러스 (Potato aucuba mosaic virus; PAMV)는 알파플렉시바이러스과 (Alphaflexiviridae) 포텍스바이러스속 (Potexvirus) 바이러스로, 단일가닥 RNA 게놈을 가지고 있다. 주로 진딧물에 의해 매개되며, 감자와 토마토를 포함하는 가지과 식물을 감염시키는 것으로 알려졌다.

한편, 한국공개특허 제2010-0082971호에는 '호박모자이크바이러스 진단용 프라이머 조합 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2013-0088092호에는 '가지과 식물에 대한 병원성 바이러스 검출 마커 및 이를 이용한 검출방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 감자 황반 모자이크 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다. 또한, 해당 바이러스에 대한 PCR 검사법이 개발되어 있더라도 바이러스의 특성상 지속적으로 염기서열 변이가 발생하기 때문에, 이러한 변이 시퀀스를 아우를 수 있는 PCR 검사법으로 고도화될 필요성이 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 감자 황반 모자이크 바이러스(PAMV)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 개발하기 위해 공지된 데이터베이스에서 PAMV의 핵산 정보를 수집하여 후보 프라이머 세트를 설계한 후, 대상 바이러스 유전자와의 특이적 반응을 보이는 후보 프라이머 세트 12개를 1차 선발하였고, 1차 선발된 프라이머 세트 중 근연종 바이러스 유전자에 비특이적 반응을 보이지 않는 7개의 후보 프라이머 세트를 2차 선발하였으며, 2차 선발된 프라이머 세트들의 식물체 유전자에 대한 비특이적 반응 여부를 통해 3개의 후보 프라이머를 최종 선발하였다. 또한, 최종 선발된 프라이머 세트에 대한 민감도를 분석한 결과, 본 발명에 따른 프라이머 세트들은 10^-2 내지 10^-3 ng 수준의 바이러스 RNA 농도까지 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 19의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 감자 황반 모자이크 바이러스 (Potato aucuba mosaic virus; PAMV)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, PAMV를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, PAMV를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 감자 황반 모자이크 바이러스 (Potato aucuba mosaic virus; PAMV)를 특이적으로 검출할 수 있는 3개의 프라이머 세트는 PAMV를 쉽고 빠르게 검출할 수 있으므로, 식물체의 PAMV 감염에 의한 피해를 경감시키는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

도 1 및 도 2는 PAMV 시퀀스 정렬 결과 및 PAMV 검출용 후보 프라이머의 위치를 보여준다.
도 3은 PAMV 양성 및 음성 시료를 이용한 후보 프라이머 세트의 검증 결과이다.
도 4 및 도 5는 근연종 바이러스 4종을 이용한 후보 프라이머 세트의 검증 결과이다.
도 6은 PAMV 검사대상 시료를 이용한 후보 프라이머 세트의 검증 결과이다.
도 7은 End-point 테스트를 통한 후보 프라이머 세트의 검출 한계 분석 결과이다.
도 8은 PCR 검사를 위해 제작된 양성대조구 클론의 염기서열에서, 최종 선택된 프라이머 세트들의 위치를 보여준다.
도 9는 PCR 검사를 위해 제작된 양성대조구 염기서열을 포함하는 클론의 PCR 반응 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 19의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 감자 황반 모자이크 바이러스 (Potato aucuba mosaic virus; PAMV)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 조성물을 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트 조성물은 바람직하게는 상기 3개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 바람직하게는 3개의 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1, 5, 7, 10, 18 및 19의 서열 내의 16개 이상, 17개이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1, 5, 7, 10, 18 및 19의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명의 서열번호 1, 5 및 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향(forward) 프라이머이며, 서열번호 10, 18 및 19의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향(reverse) 프라이머이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 감자 황반 모자이크 바이러스 (Potato aucuba mosaic virus)를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레아제(ribonuclease) 저해제, 내열성 중합 효소 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DNA 폴리머라제는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(RNA dependent DNA polymerase)와 같은 역전사 효소일 수 있으며, 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수 아세포증 바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase; AMV RTase), 마우스 백혈병 바이러스-유래 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase; MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase; RAV-2 RTase)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 버퍼는 역전사 버퍼 및 PCR 버퍼를 모두 포함할 수 있으며, 상기 내열성 중합 효소는 EF Taq 중합 효소일 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 키트는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 양성대조구 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 서열번호 22의 염기서열은 본 발명에서 선택된 3개의 프라이머 세트(총 6개의 올리고뉴클레오 프라이머)가 각각 비특이적 반응 없이 각 프라이머 세트의 예측되는 증폭 산물 크기와 동일한 크기의 증폭산물을 생산할 수 있도록 프라이머 염기서열과 인위적인 염기서열을 추가하여 인공적으로 합성한 염기서열로(도 8), DNA 단편 또는 상기 염기서열을 포함하는 벡터의 형태 등으로 키트에 포함될 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한, 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 감자 황반 모자이크 바이러스 (Potato aucuba mosaic virus)를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 총 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물은 골든베리, 꽈리, 감자 등의 가지과 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, PAMV에 감염될 수 있는 식물이면 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 PAMV를 검출하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 감자 황반 모자이크 바이러스 (Potato aucuba mosaic virus; PAMV)를 검출하기 위한 프라이머 세트 설계

NCBI GenBank에서 활용가능한 20개의 PAMV 시퀀스(2020년 5월 기준)를 이용하여 서열 정렬을 수행하고(도 1 및 2), PAMV 특이적 검출을 위한 후보 프라이머를 설계하였다(표 1).

설계된 후보 프라이머 세트를 검증하기 위해서는 균주(타겟 바이러스 및 근연종)에 대한 특이성 테스트 및 검사품목에 대한 비특이적 산물 생성 여부 확인이 필요하였다. 본 발명에 사용된 근연종 바이러스는 CymMV (Cymbidium mosaic virus), PVX (Potato virus X), WClMV (White clover mosaic virus), PepMV (Pepino mosaic virus)이다. 상기 타겟 바이러스 및 근연종 바이러스는 모두 Agdia Inc.(USA)에서 구입하여 사용하였다. 검사품목 식물체로 감자, 골든베리 및 꽈리를 사용하였으며, 상기 식물체는 바이러스 무감염으로 판단되는 종자나 묘를 구입하여 실험에 사용하였다.

실시예 2. PAMV를 검출하기 위한 프라이머 세트의 검증

상기 실시예 1을 통해 설계한 후보 프라이머 세트의 검증 및 선발을 위해 PCR을 수행하였다. 총 RNA 시료는 RNeasy plant mini kit (QIAgen, Germany)를 사용하여 추출하였다. PCR은 RT-PCR Premix (PLUTOS, Korea; P사), AccuPower RT-PCR PreMix & Master Mix (Bioneer, Korea; B사), SuPrimeScript RT-PCR Premix (GeNet Bio, Korea; G사)를 이용하여 수행되었으며, 혼합물의 조성 및 반응 조건은 하기 표와 같다.

2-1. PAMV 종 특이성 확인

먼저, PAMV 양성 및 음성 시료를 이용한 후보 프라이머의 검증을 실시하였다. PAMV 감염 시료를 이용하여 15개 후보 프라이머 세트를 검증한 결과, 예상되는 산물 크기외에 비특이적 반응이 나타난 프라이머 세트 no. 3, 5, 6을 제외한 12개의 프라이머 세트 (no. 1, 2, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15)가 1차로 선발되었다(도 3).

2-2. 근연종 바이러스를 이용한 후보 프라이머 세트의 검증

1차로 선발된 12개의 프라이머 세트를 이용하여 4종의 근연 바이러스를 대상으로 비특이적 반응 여부를 확인한 결과, 프라이머 세트 no. 2, 4, 8, 9, 14에서 비특이적 반응이 확인되어 상기 프라이머 세트들을 제외한 7개 (no. 1, 7, 10, 11, 12, 13, 15)의 프라이머 세트가 2차로 선발되었다(도 4 및 도 5).

2-3. 검사대상 식물체를 이용한 후보 프라이머 세트의 검증

2차로 선발된 7개의 프라이머 세트를 이용하여 3종의 검사대상 식물체를 대상으로 프라이머 세트의 비특이적 반응 여부를 확인한 결과, 프라이머 세트 no. 7, 11, 12, 15에서 비특이적 반응이 확인되어 이를 제외한 3개 (no. 1, 10, 13)의 프라이머 세트가 최종적으로 선발되었다(도 6).

2-4. End-point 테스트를 통한 후보 프라이머 세트의 검출 한계 분석

최종 선발된 3개의 프라이머 세트의 검출 한계를 확인하기 위해, 바이러스 총 RNA 주형을 100, 10, 1, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 ng의 농도로 달리하여 민감도 분석을 수행하였다. 그 결과, 최종 선발된 프라이머 세트는 PCR premix의 종류에 따라 일부 민감도에 차이를 보였으나, 10^-2 ng의 RNA 농도까지 검출할 수 있음을 알 수 있었다(도 7). 특히, 프라이머 세트 no. 13의 경우 10^-3 ng의 RNA 농도까지 검출가능함을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해 본 발명의 프라이머 세트가 우수한 민감도를 가진 마커임을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 양성대조구 클론을 제작하기 위한 염기서열 설계 및 검증

본 발명자는 최종 선택된 프라이머 세트들의 PCR 검사 시 양성대조구로 사용될 수 있는 양성대조구 클론을 제작하였다. 상기 양성대조구 클론은, 본 발명에서 최종적으로 선택된 3개의 프라이머 세트(총 6개의 올리고뉴클레오 프라이머)가 각각 비특이적 반응 없이 각 프라이머 세트의 예측되는 증폭 산물 크기와 동일한 크기의 증폭산물을 생산할 수 있도록 프라이머 염기서열과 인위적인 염기서열을 추가하여 설계한 염기서열(서열번호 22, 도 8)이다. 본 발명자는 양성대조구 염기서열을 설계한 후, pUCIDT-AMP 벡터(IDT, 미국)에 클로닝된 형태로 준비하였다.

제작된 양성대조구 클론의 효율성을 확인하기 위해서, 1 ng 및 10^-1 ng의 양성대조구 클론을 주형으로 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 혼합물의 조성은 표 2에서 N25 프라이머를 제외한 구성과 동일하고, 반응 조건은 표 3에서 RT 반응을 제외한 구성과 동일하게 수행하였다. 그 결과, 도 9에 개시된 바와 같이, 본 발명에서 최종적으로 선택된 3개의 프라이머 세트는 모두 예상되는 크기의 PCR 산물을 증폭하는 것을 알 수 있었고, 이를 통해 제작된 양성대조구 클론이 PCR 검사 시 본 발명의 프라이머 세트에 대한 양성대조구로 효과적으로 기능할 수 있음을 알 수 있었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Specific primer set for detecting Potato aucuba mosaic virus and uses thereof <130> PN20429 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tccttaagga agcactcgtc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gtctgacagt ctacacttcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 accgtctcta tatcctaccg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtggaaagcg atgttccaag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gagaagcatg accgggaaat 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tcaccaccat tcgaaccaag 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gagcataatg cgactatctg g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cggatttgaa aggaccactg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cttgaagact cagctgagga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggaagtgtag actgtcagac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cggtaggata tagagacggt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggacttgaga gaactcagtc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ggacttgaga gaactcagtc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cttggaacat cgctttccac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gagccactcc tgaagaaatc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tggtttgtcc tggcttgact 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gctgtgaagt cgtttgtgtg 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ccagatagtc gcattatgct c 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cagtggtcct ttcaaatccg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tcctcagctg agtcttcaag 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 attgggccac agtagaacta 20 <210> 22 <211> 1169 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> positive control sequence <400> 22 gagaagcatg accgggaaat ccacgaacca cccgttgata tcacggccca tccgagcagg 60 cgattccaca agaatcgtgt tgagcgacca ctcgcagaaa atgtacactc aacgtagagc 120 tgcagcacat tccttaagga agcactcgtc tcgagcataa tgcgactatc tggaatttcc 180 cttggagctg agaccagatg gaacccttaa tagcctcgcc tatgaagtct ccaaaattgc 240 gtgcgcacct gtcaaacacg caatggccct gacggttatg tcggatggga tgttggtaga 300 tcagctcacg agagcttcac attgactcct gaggcaaatc aaacgggaat aagcaaggac 360 aaacaggtag cgcccggtaa cattgccgaa gatttctcct cacgaaccag atcccttaac 420 ggatgttgac aggatttgca agacctagtt gatgcgcagg gtacaggtgc caaatcgtct 480 gacagtctac acttccaagc aatcttacag tgggatcgcg aattgcagtt cccgattgta 540 gcgaaacctt aagatggacc gaagaatctt agttaccatt cctgcattcg aagcaaatgc 600 tcctgggacg tgcctattgg ctaaactacg cgaggatata gcttggcact ccaactggac 660 acccagggag ctgtgaatgg atccaatggg actgttatcc gaggacagtg gccaacgatg 720 acaatcattg ccactggagg cgaatgacca tactggtcag aagtcccgca gagcataatg 780 cgactatctg gtttaacgcc atgatctcga ggaggcaagc actttagtcg gatttgaaag 840 gaccactgaa ctcctcgacg ctaatcacta tggtactcgt catctactga cttctcagtc 900 aactgatttc cagacgctaa ggtcacatct cgtactccga ttcgaaccta gcaataccgc 960 atttggcaat ccgcttatac ttaactggga gttgtggtca gacaatgcca gatgacaggc 1020 attagccgtt gatcatggcc attcaaatct cggatcgtaa gcgcctatgg gcaattcaat 1080 gcatggcacg aatacatgca tcaaagccat cacaggataa tgcctcgata aatcggatca 1140 cgttaaagtc taatggtgtg gtgcatcga 1169

Claims (6)

1. 서열번호 1 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 19의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 감자 황반 모자이크 바이러스 (Potato aucuba mosaic virus)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 조성물.
2. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 감자 황반 모자이크 바이러스 (Potato aucuba mosaic virus)를 특이적으로 검출하기 위한 키트.
3. 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
4. 제2항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 양성대조구 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
5. 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 감자 황반 모자이크 바이러스 (Potato aucuba mosaic virus)를 특이적으로 검출하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.

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