KR101491810B1 - 콩모자이크괴저바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 콩모자이크괴저바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 BCMNV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, BCMNV 진단용 키트 및 RT-PCR을 이용한 BCMNV 진단 방법을 이용하면, 콩과 작물에서 BCMNV의 감염 여부를 항혈청을 이용한 진단법에 비해 1000배 이상 정확하고, 빠르게 확인할 수 있으므로, 검역 현장에서 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 콩모자이크괴저바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 3 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 BCMNV (Bean common mosaic necrosis virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 BCMNV 진단용 키트 및 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 BCMNV를 진단하는 방법에 관한 것이다.
농업적으로 중요한 작물의 대부분은 식물 바이러스 또는 비로이드 (viroid) 감염에 의해 수확량 감소 및 품질 저하가 나타나고, 이로 인해 심각한 경제적 손실이 발생하게 된다. 식물 바이러스에 의한 병은 곰팡이 또는 세균에 의한 병과는 다르게 농약을 살포하여 예방하거나 치료하는 것이 불가능하다. 따라서, 식물체나 종자의 바이러스 감염 여부에 대한 정밀하고 신속한 진단은 재배 작물의 바이러스 감염에 의한 피해를 사전에 방지하고, 바이러스 병 관리를 위한 선결요건이다.
콩모자이크괴저바이러스 (Bean common mosaic necrosis virus, BCMNV)는 BCMV (Bean common mosaic virus)에서 분류되었으며 (Mink et al ., Arch . Virol . 139:231-235, 1994), 현재 분류학적으로 바이러스 그룹 IV (+)센스 ssRNA 바이러스이며, 포티바이러스과 (Potyviridae) 포티바이러스속 (Potyvirus)으로 분류되고, 길이 720~770 nm × 너비 12~15 nm의 입자 크기를 갖는다. BCMNV 입자는 단백질 95%와 핵산 5%로 이루어져 있으며, 외피 단백질에는 적어도 8가지의 단백질 분해효소가 있어 기주 공격이나 기주에 대한 방어에 이용한다. 약 10 kb로 구성되어 있는 단일 가닥 RNA에는 외피 단백질을 코딩하는 유전자 (CP) 이외에도 P1, HcPro, P3, 6K1, Cl, 6K2, VPg, Nla 및 Nlb 유전자가 포함되어 있다. 식물 병원성 바이러스인 BCMNV에 감염된 식물체에서는 괴사, 황백화, 반점 형성 및 기형 증상이 일어나며, 이 때문에 아프리카, 유럽, 북아메리카 및 라틴아메리카 등에서는 작물의 수확량 감소 (약 35~98%)의 원인이 되기도 한다. BCMNV는 강낭콩 (Phaseolus vulgaris)을 주요 기주로 생활하며, 숙마 (양마, sunnhemp), 팥 및 녹두 등의 다른 콩과 작물도 기주로 삼는다. 또한, BCMNV는 우리나라의 검역 대상 병원체로서 수입되는 여러 가지 식물체로부터 이를 검출할 수 있는 진단법을 필요로 한다.
바이러스 진단법으로 과거에는 전자현미경과 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태적 특징으로 종을 진단하기는 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA 방법은 가장 일반적으로 사용되는 진단 방법이나 PCR을 이용한 진단보다 검출 감도가 약 1,000배 정도 낮으며, 항체와 검사 시료의 비특이적 반응으로 진단에 실패하는 경우가 종종 발생한다. BCMNV의 경우에도 바이러스 진단을 위해 ELISA를 주로 사용하고 있으나, 식물체 추출물과 항혈청의 비특이적 반응으로 인해 오진단하는 경우가 종종 있으며, 검사 시료에서 BCMNV의 감염률이 낮은 경우에는 진단에 실패할 가능성이 크다. 또한, 검역 현장에서는 하나의 검사 시료에 대해 다양한 병원체의 진단을 수행해야하므로 여러 가지 진단법을 사용할 경우 많은 노동력과 검사 비용이 소요된다.
현재 RNA 바이러스의 진단에는 높은 검출 감도와 편리성을 갖는 RT-PCR 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있다. PCR 방법을 이용하여 바이러스를 진단하는 경우에는, 특이적 반응의 강도가 낮아 감염 여부의 판별이 곤란하거나, 다른 핵산과의 비특이적 반응이 일어나는 것을 대비한 검사 시스템이 필요하다. 또한, 분리주 특이적 프라이머를 사용할 경우 진단에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이 프라이머의 개발이 요구된다.
따라서, 본 발명에서는 BCMNV 진단용 최적 프라이머 및 이에 부합하는 검정용 프라이머 (nested primer)와 이를 뒷받침할 수 있는 종 특이 프라이머 은행 및 양성 대조구를 제공하고자 한다. 본 발명의 BCMNV 진단용 프라이머는 지금까지 알려진 BCMNV 모든 계통들과 반응할 수 있게 개발되었으며, 양성 및 음성 반응의 검증을 위한 도구를 포함하고 있다.
한편, 한국등록특허 제0857043호에는 '콩모자이크바이러스 진단용 특이 프라이머'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1024116호에는 '동부연한얼룩바이러스 검출용 PCR 프라이머 쌍 및 이를 이용한 동부연한얼룩바이러스 검출 방법'이 개시되어 있다. 그러나, 본 발명에서와 같이 콩모자이크괴저바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 콩모자이크괴저바이러스 (Bean common mosaic necrosis virus; BCMNV)에 감염된 식물에서 BCMNV를 특이적으로 검출할 수 있는 최적 프라이머 세트, 검정용 (nested) PCR 프라이머 세트 및 PCR 반응시 양성 대조구로 이용할 수 있는 DNA 단편을 포함하는 플라스미드를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 3 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 BCMNV (Bean common mosaic necrosis virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 BCMNV 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 BCMNV를 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 BCMNV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, BCMNV 진단용 키트 및 RT-PCR을 이용한 BCMNV 진단 방법을 이용하면, 콩과 작물에서 BCMNV의 감염 여부를 항혈청을 이용한 진단법에 비해 1000배 이상 정확하고, 빠르게 확인할 수 있으므로, 검역 현장에서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 콩모자이크괴저바이러스 (BCMNV) 감염 증상이 나타난 식물체 사진이다.
도 2는 BCMNV 진단을 위해 설계한 프라이머 지도를 나타낸다. 프라이머 위치는 GenBank 등록번호 NC_004047을 기준으로 작성되었다.
도 3은 BCMNV 진단용 프라이머 조합 28가지 (표 3 참고)를 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸다 (1차 선발: 조합 3~7, 9, 10, 12, 14, 16 및 20~27 선발).
도 4는 1차 선발한 BCMNV 진단용 프라이머 조합으로 유연관계가 있는 다른 바이러스 (표 4 참고)에 대해 RT-PCR을 수행하여, BCMNV 진단용 프라이머를 2차 선발한 결과를 나타낸다 (조합 3~7, 14, 16, 20, 22, 23, 25, 26 및 27 선발). 각 레인 별 선발대상 바이러스는 다음과 같다. 레인 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171: BCMNV; 레인 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172: BCMV; 레인 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173: LMV; 레인 4, 14, 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174: PRSV; 레인 5, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105, 115, 125, 135, 145, 155, 165, 175: PepMoV; 레인 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 176: PVMV; 레인 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177: PVA; 레인 8, 18, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178: PVY; 레인 9, 19, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189: WMV2; 레인 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190: ZYMV.
도 5는 2차 선발한 BCMNV 진단용 프라이머 조합으로 기주 관련 바이러스 (표 4 참고)에 대해 RT-PCR을 수행하여, BCMNV 진단용 프라이머를 3차 선발한 결과를 나타낸다 (조합 3, 5, 6, 7, 14, 16, 20, 23, 26 및 27 선발). 각 레인 별 선발대상 바이러스는 다음과 같다. 레인 1, 6, 11, 16, 21, 26, 31, 36, 41, 46, 51, 56, 61: BCMNV; 레인 2, 7, 12, 17, 22, 27, 32, 37, 42, 47, 52, 57, 62: CLRV; 레인 3, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43, 48, 53, 58, 63: SBMV; 레인 4, 9, 14, 19, 24, 29, 34, 39, 44, 49, 54, 59, 64: TBRV; 레인 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65: TSV.
도 6은 3차 선발한 BCMNV 진단용 프라이머 조합에서 강낭콩 (기주)의 게놈 DNA에 대해 비특이적 반응이 나타난 프라이머를 제외하고, 최종적으로 BCMNV 진단용 프라이머 조합을 선발한 결과를 나타낸다 (조합 14, 16 및 26 선발). 각 레인 별 프라이머 조합은 다음과 같다. 레인 1: BCMNV-N30/BCMNV-C10 (1,072 bp); 레인 2: BCMNV-N50/BCMNV-C10 (827 bp); 레인 3: BCMNV-N60/BCMNV-C10 (687 bp); 레인 4: BCMNV-N10/BCMNV-C20 (567 bp); 레인 5: BCMNV-N30/BCMNV-C30 (339 bp); 레인 6: BCMNV-N10/BCMNV-C40 (359 bp); 레인 7: BCMNV-N81/BCMNV-C01 (820 bp); 레인 8: BCMNV-N81/BCMNV-C02 (647 bp); 레인 9: BCMNV-N81/BCMNV-C03 (485 bp); 레인 10: BCMNV-N82/BCMNV-C03 (290 bp); 레인 11: 양성 대조구; 레인 12: 음성 대조구.
도 7은 최종적으로 선발된 BCMNV 진단용 프라이머 조합의 end-point PCR 결과를 나타낸다. 각 레인 별 희석 배수는 다음과 같다. 레인 1~8: 순서대로 BCMNV 원액~10-7 희석액; 레인 9: 음성 대조구; 레인 10~17: 순서대로 BCMNV 원액~10-7 희석액; 레인 18: 음성 대조구; 레인 19~26: 순서대로 BCMNV 원액~10-7 희석액; 레인 27: 음성 대조구.
도 8은 최종적으로 선발된 BCMNV 진단용 프라이머 조합에 대한 네스티드 (nested) PCR 프라이머 조합 (표 5 참고)을 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸다. 각 레인 별 프라이머 조합은 다음과 같다. 레인 1: BCMNV-N40/BCMNV-C40 (129 bp); 레인 2: BCMNV-N20/BCMNV-C50 (176 bp); 레인 3: BCMNV-N30/BCMNV-C50 (132 bp); 레인 4: BCMNV-N20/BCMNV-C60 (137 bp); 레인 5: BCMNV-N82/BCMNV-C04 (207 bp); 레인 6: BCMNV-N82/BCMNV-C05 (189 bp).
도 9는 BCMNV 진단용 프라이머 조합 14 (BCMNV-N30 및 BCMNV-C30 프라이머)에 의해 증폭되는 339 bp의 BCMNV 염기서열을 나타낸다. 프라이머 결합 위치는 [_]로 표시하였다.
도 10은 BCMNV 진단용 프라이머 조합 16 (BCMNV-N10 및 BCMNV-C40 프라이머)에 의해 증폭되는 359 bp의 BCMNV 염기서열을 나타낸다. 프라이머 결합 위치는 [_]로 표시하였다.
도 11은 BCMNV-N30 및 BCMNV-C30 프라이머 위치 및 BCMNV-N10 및 BCMNV-C40 프라이머 위치를 모두 포함하는 DNA 단편 (양성 대조구)과 BCMNV 진단용 프라이머 조합 14 및 조합 16을 이용한 RT-PCR 결과를 나타낸다.
도 12는 BCMNV-N30 및 BCMNV-C30 프라이머 위치 및 BCMNV-N10 및 BCMNV-C40 프라이머 위치를 모두 포함하는 양성 대조구의 염기서열 (1,239 bp)을 나타낸다. BCMNV-N10 및 BCMNV-C10 프라이머의 결합 위치는 [_]로 표시하였다.
도 13은 BCMNV-N30 및 BCMNV-C30 프라이머 위치를 포함하며, 비특이적 염기서열을 삽입한 돌연변이-양성 대조구의 염기서열 (345 bp)을 나타낸다. BCMNV-N30 및 BCMNV-C30 프라이머의 결합 위치는 [_], 네스티드 PCR 프라이머인 BCMNV-N40 및 BCMNV-C40 프라이머의 결합 위치는 <_>, 염기서열 삽입 위치는 {_}로 표시하였다.
도 2는 BCMNV 진단을 위해 설계한 프라이머 지도를 나타낸다. 프라이머 위치는 GenBank 등록번호 NC_004047을 기준으로 작성되었다.
도 3은 BCMNV 진단용 프라이머 조합 28가지 (표 3 참고)를 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸다 (1차 선발: 조합 3~7, 9, 10, 12, 14, 16 및 20~27 선발).
도 4는 1차 선발한 BCMNV 진단용 프라이머 조합으로 유연관계가 있는 다른 바이러스 (표 4 참고)에 대해 RT-PCR을 수행하여, BCMNV 진단용 프라이머를 2차 선발한 결과를 나타낸다 (조합 3~7, 14, 16, 20, 22, 23, 25, 26 및 27 선발). 각 레인 별 선발대상 바이러스는 다음과 같다. 레인 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171: BCMNV; 레인 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172: BCMV; 레인 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173: LMV; 레인 4, 14, 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174: PRSV; 레인 5, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105, 115, 125, 135, 145, 155, 165, 175: PepMoV; 레인 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 176: PVMV; 레인 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177: PVA; 레인 8, 18, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178: PVY; 레인 9, 19, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189: WMV2; 레인 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190: ZYMV.
도 5는 2차 선발한 BCMNV 진단용 프라이머 조합으로 기주 관련 바이러스 (표 4 참고)에 대해 RT-PCR을 수행하여, BCMNV 진단용 프라이머를 3차 선발한 결과를 나타낸다 (조합 3, 5, 6, 7, 14, 16, 20, 23, 26 및 27 선발). 각 레인 별 선발대상 바이러스는 다음과 같다. 레인 1, 6, 11, 16, 21, 26, 31, 36, 41, 46, 51, 56, 61: BCMNV; 레인 2, 7, 12, 17, 22, 27, 32, 37, 42, 47, 52, 57, 62: CLRV; 레인 3, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43, 48, 53, 58, 63: SBMV; 레인 4, 9, 14, 19, 24, 29, 34, 39, 44, 49, 54, 59, 64: TBRV; 레인 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65: TSV.
도 6은 3차 선발한 BCMNV 진단용 프라이머 조합에서 강낭콩 (기주)의 게놈 DNA에 대해 비특이적 반응이 나타난 프라이머를 제외하고, 최종적으로 BCMNV 진단용 프라이머 조합을 선발한 결과를 나타낸다 (조합 14, 16 및 26 선발). 각 레인 별 프라이머 조합은 다음과 같다. 레인 1: BCMNV-N30/BCMNV-C10 (1,072 bp); 레인 2: BCMNV-N50/BCMNV-C10 (827 bp); 레인 3: BCMNV-N60/BCMNV-C10 (687 bp); 레인 4: BCMNV-N10/BCMNV-C20 (567 bp); 레인 5: BCMNV-N30/BCMNV-C30 (339 bp); 레인 6: BCMNV-N10/BCMNV-C40 (359 bp); 레인 7: BCMNV-N81/BCMNV-C01 (820 bp); 레인 8: BCMNV-N81/BCMNV-C02 (647 bp); 레인 9: BCMNV-N81/BCMNV-C03 (485 bp); 레인 10: BCMNV-N82/BCMNV-C03 (290 bp); 레인 11: 양성 대조구; 레인 12: 음성 대조구.
도 7은 최종적으로 선발된 BCMNV 진단용 프라이머 조합의 end-point PCR 결과를 나타낸다. 각 레인 별 희석 배수는 다음과 같다. 레인 1~8: 순서대로 BCMNV 원액~10-7 희석액; 레인 9: 음성 대조구; 레인 10~17: 순서대로 BCMNV 원액~10-7 희석액; 레인 18: 음성 대조구; 레인 19~26: 순서대로 BCMNV 원액~10-7 희석액; 레인 27: 음성 대조구.
도 8은 최종적으로 선발된 BCMNV 진단용 프라이머 조합에 대한 네스티드 (nested) PCR 프라이머 조합 (표 5 참고)을 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸다. 각 레인 별 프라이머 조합은 다음과 같다. 레인 1: BCMNV-N40/BCMNV-C40 (129 bp); 레인 2: BCMNV-N20/BCMNV-C50 (176 bp); 레인 3: BCMNV-N30/BCMNV-C50 (132 bp); 레인 4: BCMNV-N20/BCMNV-C60 (137 bp); 레인 5: BCMNV-N82/BCMNV-C04 (207 bp); 레인 6: BCMNV-N82/BCMNV-C05 (189 bp).
도 9는 BCMNV 진단용 프라이머 조합 14 (BCMNV-N30 및 BCMNV-C30 프라이머)에 의해 증폭되는 339 bp의 BCMNV 염기서열을 나타낸다. 프라이머 결합 위치는 [_]로 표시하였다.
도 10은 BCMNV 진단용 프라이머 조합 16 (BCMNV-N10 및 BCMNV-C40 프라이머)에 의해 증폭되는 359 bp의 BCMNV 염기서열을 나타낸다. 프라이머 결합 위치는 [_]로 표시하였다.
도 11은 BCMNV-N30 및 BCMNV-C30 프라이머 위치 및 BCMNV-N10 및 BCMNV-C40 프라이머 위치를 모두 포함하는 DNA 단편 (양성 대조구)과 BCMNV 진단용 프라이머 조합 14 및 조합 16을 이용한 RT-PCR 결과를 나타낸다.
도 12는 BCMNV-N30 및 BCMNV-C30 프라이머 위치 및 BCMNV-N10 및 BCMNV-C40 프라이머 위치를 모두 포함하는 양성 대조구의 염기서열 (1,239 bp)을 나타낸다. BCMNV-N10 및 BCMNV-C10 프라이머의 결합 위치는 [_]로 표시하였다.
도 13은 BCMNV-N30 및 BCMNV-C30 프라이머 위치를 포함하며, 비특이적 염기서열을 삽입한 돌연변이-양성 대조구의 염기서열 (345 bp)을 나타낸다. BCMNV-N30 및 BCMNV-C30 프라이머의 결합 위치는 [_], 네스티드 PCR 프라이머인 BCMNV-N40 및 BCMNV-C40 프라이머의 결합 위치는 <_>, 염기서열 삽입 위치는 {_}로 표시하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 BCMNV (Bean common mosaic necrosis virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 BCMNV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 3 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 (조합 14; 표 3 참고) 및 서열번호 1 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 (조합 16; 표 3 참고)를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 서열번호 3 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 서열번호 4 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 (네스티드 프라이머 (nested primer) 세트 1) 및 서열번호 2 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 (네스티드 프라이머 세트 2)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 서열번호 3 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 (조합 14) 및 서열번호 1 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 (조합 16)에 서열번호 4 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 (네스티드 프라이머 세트 1) 및 서열번호 2 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 (네스티드 프라이머 세트 2)를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 BCMNV 진단용 프라이머 세트는 BCMNV 진단용 프라이머 조합 14 (BCMNV-N30; 서열번호 3 및 BCMNV-C30; 서열번호 12)의 RT-PCR 산물에 대한 검정 기능을 가진 네스티드 프라이머 세트 (BCMNV-N40; 서열번호 4 및 BCMNV-C40; 서열번호 13) 및 BCMNV 진단용 프라이머 조합 16 (BCMNV-N10; 서열번호 1 및 BCMNV-C40; 서열번호 13)의 RT-PCR 산물에 대한 검정 기능을 가진 네스티드 프라이머 세트 (BCMNV-N20; 서열번호 2 및 BCMNV-C50; 서열번호 14)를 추가로 포함할 수 있다. 1차 RT-PCR 검사 결과의 검정이 필요할 경우, 즉 RT-PCR 산물이 BCMNV로부터 유래된 결과인지 확인하기 위하여 이 프라이머 조합에 대한 검정용 프라이머 (nested primer)를 이용하여 PCR 검사를 실시한다. 이때 RT-PCR 반응 결과가 BCMNV 유래에서 비롯되었다면 검정용 PCR에서 양성 반응을 나타낼 것이다 (도 8 참고).
상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1, 2, 3, 4, 12, 13 또는 14의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머 (18개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 3의 프라이머 (19개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 3의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도 (complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체 (analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 (alkylphosphorothioate) 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질 (intercalating agent)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, BCMNV 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 서열번호 21 및 22의 염기서열을 갖는 DNA 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 DNA 단편을 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 21 및 22의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 21 또는 22의 염기서열을 갖는 DNA 단편은 BCMNV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 또는 PCR 반응에 대한 양성 대조구의 기능을 가진 플라스미드로서 이용될 수 있다 (도 12 및 13 참고).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레아제 (ribonuclease) 저해제, 내열성 중합 효소 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DNA 폴리머라제는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 (RNA dependent DNA polymerase)와 같은 역전사 효소일 수 있으며, 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수 아세포증 바이러스-유래 역전사 효소 (avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase; AMV RTase), 마우스 백혈병 바이러스-유래 역전사 효소 (murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase; MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사 효소 (Rous-associated virus 2 reverse transcriptase; RAV-2 RTase)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 버퍼는 역전사 버퍼 및 PCR 버퍼를 모두 포함할 수 있으며, 상기 내열성 중합 효소는 EF Taq 중합 효소일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은
식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, BCMNV를 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 총 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 식물은 대두, 강낭콩 (Phaseolus vulgaris), 완두콩, 숙마 (양마, sunnhemp), 팥 및 녹두를 포함한 콩과 (Fabaceae) 식물일 수 있으며, 바람직하게는 강낭콩일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, BCMNV에 감염될 수 있는 식물이면 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 BCMNV를 진단하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기 (Geiger counter) 또는 액체섬광계수기 (liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
콩모자이크괴저바이러스
(
BCMNV
) 진단용
프라이머의
설계 및 조합
BCMNV에 감염된 식물체에서는 괴사, 황백화, 반점 및 기형 증상이 나타난다 (도 1). 이로 인한, 식물의 생산성 저하 및 품질 저하를 방지하기 위해, 본 발명에서는 BCMNV의 완전한 게놈 유전자를 이용하여 BCMNV 진단용 프라이머를 설계하였다.
BCMNV의 진단용 프라이머 설계를 위해, 미국 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information, NCBI)로부터 BCMNV의 4가지 계통 (strain) 및 분류학적으로 BCMNV와 유사한 포티바이러스과 (Potyviridae) 5종의 염기서열을 다운로드 하였다 (표 1).
| 바이러스 명칭 (계통 또는 분리주 ) | 두문자어 | GeneBank 등록번호 (길이, bp ) |
| Bean common mosaic necrosis virus (Michigan) | BCMNV | NC_004047 (9,612) |
| Bean common mosaic necrosis virus (Washington) | BCMNV | AY138897 (9,626) |
| Bean common mosaic necrosis virus (Michigan) | BCMNV | AY282577 (9,642) |
| Bean common mosaic necrosis virus (Kimberly) | BCMNV | AY864314 (9,893) |
| Bean common mosaic virus | BCMV | NC_003397 (9,992) |
| Bean common mosaic virus (Blackeye) | BCMV | AY575773 (9,992) |
| Potato virus Y | PVY | NC_001616 (9,704) |
| Soybean mosaic virus | SMV | NC_002634 (9,588) |
| Watermelon Moroccan mosaic virus | WMV | NC_006262 (10,035) |
다운로드한 9종의 염기서열은 'FASTA' 포맷 (format)으로 정렬한 뒤, 서열 정렬 프로그램인 DNAMAN package (Lynnon Biosoft)를 사용하여 다중 정렬 (multiple alignment)을 수행하였다. 그 후 BCMNV의 종 특이적인 서열을 탐색하였고, 약 10 Kb의 서열 중 332~1,570 bp 부분 및 8,557~9,376 bp 부분을 대상으로 진단용 프라이머를 설계하였다 (도 2).
설계한 프라이머는 정방향 프라이머 (upstream) 9가지와 역방향 프라이머 (downstream) 11가지의 총 20가지로 (표 2), 이를 조합하여 PCR로 증폭 가능한 28가지 조합을 선발하였고, 각각의 RT-PCR 산물의 예상 크기는 표 3에 나타내었다.
| 프라이머 명칭 | 염기서열 | 서열번호 | 길이 ( bp ) | 위치* | |
| 정방향 | BCMNV-N10 | GCGAAGAGATTTGCTGAT | 1 | 18 | 332-349 |
| BCMNV-N20 | AAGCAGAAGAAGGGAGGT | 2 | 18 | 455-472 | |
| BCMNV-N30 | TAAGCAAGCAGAGGAACGG | 3 | 19 | 499-517 | |
| BCMNV-N40 | AAGTGGTGCTTACGGAGA | 4 | 18 | 562-579 | |
| BCMNV-N50 | TTGTTGCTGAGACAGGTG | 5 | 18 | 744-761 | |
| BCMNV-N60 | GAGATGTCATACTGGCACC | 6 | 19 | 884-902 | |
| BCMNV-N81 | TGAGGTGTATGAATCCGTG | 7 | 19 | 8,557-8,575 | |
| BCMNV-N82 | GATTCTAAACTTGGACCACCTA | 8 | 22 | 8,752-8,773 | |
| BCMNV-N83 | ATGACCAGCAAATGGGAG | 9 | 18 | 8,874-8,893 | |
| 역방향 | BCMNV-C10 | ATCTTCTTGCGTGGCTGA | 10 | 18 | 1,553-1,570 |
| BCMNV-C20 | CCAGTATGACATCTCACGG | 11 | 19 | 880-898 | |
| BCMNV-C30 | ATGACCAGCCCATACCTAC | 12 | 19 | 819-837 | |
| BCMNV-C40 | TTTACCTGCCTAACAGCC | 13 | 18 | 673-690 | |
| BCMNV-C50 | TCAGCAACTTTTCGGTCA | 14 | 18 | 613-630 | |
| BCMNV-C60 | ACATAAGCCTTGTCTCCG | 15 | 18 | 574-591 | |
| BCMNV-C01 | ACTCCTTTACTGCCCAGA | 16 | 18 | 9,376-9,393 | |
| BCMNV-C02 | TGGCTCTGTCTGAGGTTT | 17 | 18 | 9,203-9,220 | |
| BCMNV-C03 | TAACTTGTCGCAGCGTAGG | 18 | 19 | 9,041-9,060 | |
| BCMNV-C04 | CACACTCCATTCACATCG | 19 | 18 | 8,941-8,958 | |
| BCMNV-C05 | GGAGATGTCCCATTATCG | 20 | 18 | 8,923-8,940 | |
* GenBank 등록번호 NC_004047을 기준으로 작성
| 조합 | 정방향 ( Upstream ) | 역방향 ( Downstream ) | PCR 산물 크기 ( bp ) |
| 1 | BCMNV-N10 | BCMNV-C10 | 1,239 |
| 2 | BCMNV-N20 | BCMNV-C10 | 1,116 |
| 3 | BCMNV-N30 | BCMNV-C10 | 1,072 |
| 4 | BCMNV-N40 | BCMNV-C10 | 1,009 |
| 5 | BCMNV-N50 | BCMNV-C10 | 827 |
| 6 | BCMNV-N60 | BCMNV-C10 | 687 |
| 7 | BCMNV-N10 | BCMNV-C20 | 567 |
| 8 | BCMNV-N20 | BCMNV-C20 | 444 |
| 9 | BCMNV-N30 | BCMNV-C20 | 400 |
| 10 | BCMNV-N40 | BCMNV-C20 | 337 |
| 11 | BCMNV-N50 | BCMNV-C20 | 155 |
| 12 | BCMNV-N10 | BCMNV-C30 | 506 |
| 13 | BCMNV-N20 | BCMNV-C30 | 383 |
| 14 | BCMNV-N30 | BCMNV-C30 | 339 |
| 15 | BCMNV-N40 | BCMNV-C30 | 276 |
| 16 | BCMNV-N10 | BCMNV-C40 | 359 |
| 17 | BCMNV-N20 | BCMNV-C40 | 236 |
| 18 | BCMNV-N30 | BCMNV-C40 | 192 |
| 19 | BCMNV-N40 | BCMNV-C40 | 129 |
| 20 | BCMNV-N81 | BCMNV-C01 | 820 |
| 21 | BCMNV-N82 | BCMNV-C01 | 625 |
| 22 | BCMNV-N83 | BCMNV-C01 | 503 |
| 23 | BCMNV-N81 | BCMNV-C02 | 647 |
| 24 | BCMNV-N82 | BCMNV-C02 | 452 |
| 25 | BCMNV-N83 | BCMNV-C02 | 330 |
| 26 | BCMNV-N81 | BCMNV-C03 | 485 |
| 27 | BCMNV-N82 | BCMNV-C03 | 290 |
| 28 | BCMNV-N83 | BCMNV-C03 | 168 |
실시예
2.
BCMNV
진단용 최적
프라이머
세트 선발 및 진단용
프라이머
은행 구축
BCMNV의 진단용 최적 프라이머 세트의 선발을 위해 설계한 28가지 프라이머 조합으로 1~4차까지의 선발 과정을 진행하였다.
우선 선발 대상 바이러스와 특이적인 반응 여부를 확인한 1차 선발에서 28가지 조합 중 18가지 조합 (표 3의 조합 3~7, 9, 10, 12, 14, 16 및 20~27)을 선발하였다 (도 3). 2차 선발 대상인 유연관계 바이러스 및 3차 선발 대상인 기주 관련 바이러스의 목록은 표 4에 정리하였다. 2차 선발에서 18가지 조합 중 비특이적 반응이 일어나지 않은 13가지의 조합 (표 3의 조합 3~7, 14, 16, 20, 22, 23, 25, 26 및 27)을 선발하였으며 (도 4), 3차 선발에서 13가지 조합 중 10가지 조합 (표 3의 조합 3, 5, 6, 7, 14, 16, 20, 23, 26 및 27)을 선발하였다 (도 5). 4차 선발에서 기주 (강낭콩)의 게놈 DNA에 대한 비특이적인 반응이 나타난 2가지 조합 및 밴드의 끌림 현상이 발생한 조합을 선발 대상에서 제외하고, 깔끔한 결과를 나타낸 3가지 조합 (표 3의 조합 14, 16 및 26)을 선발하였다 (도 6).
| 구분 | 학명 | 두문자어 |
| 2차 선발대상 (9종) |
Bean common mosaic virus | BCMV |
| Lettuce mosaic virus | LMV | |
| Papaya ringspot virus | PRSV | |
| Pepper mottle virus | PepMoV | |
| Pepper veinal mottle virus | PVMV | |
| Potato virus A | PVA | |
| Potato virus Y | PVY | |
| Watermelon mosaic virus 2 | WMV2 | |
| Zucchini yellow mosaic virus | ZYMV | |
| 3차 선발대상 (4종) |
Cherry leaf roll virus | CLRV |
| Southern bean mosaic virus | SBMV | |
| Tomato black ring virus | TBRV | |
| Tobacco streak virus | TSV |
1~4차 선발 후, 최종적으로 선발된 BCMNV 바이러스 진단용 프라이머 조합 14, 16 및 26에 대해 end-point PCR (희석 한계 실험)을 실시한 결과, 각각 10-5, 10-7 및 10-3의 민감도를 보였다 (도 7).
선발된 조합들에 대해서, 검정 시스템인 네스티드 프라이머 (nested primer) 조합을 설계하였으며 (표 5), 이때 주형으로 사용되는 RT-PCR 산물은 각각 1/100로 희석하여 사용하였다. 네스티드 PCR 결과, 모든 조합에서 밴드가 확인되었으며, 일부에서는 비특이적인 밴드도 나타났다 (도 8). 검정용 프라이머인 네스티드 프라이머는 밴드의 밝기와 두께, 비특이적인 밴드의 유무, 크기 및 선발된 진단용 PCR 프라이머 조합 산물과의 크기 차이를 고려하여 최종 선발하였다.
| 프라이머 조합 번호 | 정방향 | 역방향 | 길이 ( bp ) |
| 조합 14 | BCMNV-N40 | BCMNV-C40 | 129 |
| 조합 16 | BCMNV-N20 | BCMNV-C50 | 176 |
| BCMNV-N30 | BCMNV-C50 | 132 | |
| BCMNV-N20 | BCMNV-C60 | 137 | |
| 조합 26 | BCMNV-N82 | BCMNV-C04 | 207 |
| BCMNV-N82 | BCMNV-C05 | 189 |
실험 결과, 조합 14 (BCMNV-N30 및 BCMNV-C30)와 조합 16 (BCMNV-N10 및 BCMNV-C40)을 BCMNV 진단용 최적 프라이머 세트로 선발하였고, 검정 시스템인 네스티드 PCR 프라이머도 각각 한 세트씩 총 두 세트 (BCMNV-N40 및 BCMNV-C40, BCMNV-N20 및 BCMNV-C50)를 선발하였다. BCMNV를 검사하기 위해 최종적으로 선발한 진단용 프라이머 세트, 네스티드 프라이머 세트 및 양성 대조구의 크기를 표 6에 정리하였으며, 프라이머 정보는 표 7에 기재하였다.
| 세트 | 최종 선발 프라이머 | 네스티드 프라이머 |
양성
대조구
( bp ) |
||||
| 정방향 | 역방향 | 길이 ( bp ) | 정방향 | 역방향 | 길이 ( bp ) | ||
| 1 | BCMNV-N30 | BCMNV-C30 | 339 | BCMNV-N40 | BCMNV-C40 | 129 | 1,239 |
| 2 | BCMNV-N10 | BCMNV-C40 | 359 | BCMNV-N20 | BCMNV-C50 | 176 | |
| 프라이머 | 염기서열 | 서열번호 | 프라이머 길이 ( bp ) | 증폭 산물 길이 ( bp ) | |
| 세트 1 (조합 14) |
BCMNV-N30 | TAAGCAAGCAGAGGAACGG | 3 | 19 | 339 |
| BCMNV-C30 | ATGACCAGCCCATACCTAC | 12 | 19 | ||
| 세트 2 (조합 16) |
BCMNV-N10 | GCGAAGAGATTTGCTGAT | 1 | 18 | 359 |
| BCMNV-C40 | TTTACCTGCCTAACAGCC | 13 | 18 | ||
| 세트 1 (nested) |
BCMNV-N40 | AAGTGGTGCTTACGGAGA | 4 | 18 | 129 |
| BCMNV-C40 | TTTACCTGCCTAACAGCC | 13 | 18 | ||
| 세트 2 (nested) |
BCMNV-N20 | AAGCAGAAGAAGGGAGGT | 2 | 18 | 176 |
| BCMNV-C50 | TCAGCAACTTTTCGGTCA | 14 | 18 | ||
실시예
3.
BCMNV
의 진단 및 검사
바이러스 검사 현장에서 식물체로부터 BCMNV를 진단할 경우, 조합 14 (BCMNV-N30 및 BCMNV-C30)와 조합 16 (BCMNV-N10 및 BCMNV-C40)의 프라이머 세트를 사용하여 1회 (one-step) 또는 2회 (two-step)의 RT-PCR을 수행하면, 도 9 (BCMNV-N30 및 BCMNV-C30; 339 bp) 및 도 10 (BCMNV-N10 및 BCMNV-C40; 359 bp)에 표시된 위치에 프라이머가 결합하여 밴드를 형성할 것이다. 이때, 양성 대조구로 사용할 수 있도록 진단용 프라이머 세트가 설계된 전체 영역을 포함하도록 플라스미드 (서열번호 21)를 제작하였다 (도 11 및 12).
또한, 진단 시 양성 대조구의 오염으로 인한 거짓 양성 반응이 나타날 경우를 대비하여 플라스미드 서열의 일부를 변형한 돌연변이-양성 대조구 (mutation positive control) (서열번호 22)를 제작했다 (도 13). 돌연변이-양성 대조구를 사용할 때에는, 조합 14의 프라이머 세트 (BCMNV-N30 및 BCMNV-C30) 및 네스티드 프라이머 세트 1 (BCMNV-N40 및 BCMNV-C40)을 사용해야 한다. 돌연변이-양성 대조구를 양성 대조구로 이용하면, 검사 후에 양성 반응이 나타난 시료의 염기서열을 분석할 때, 그것이 진짜 바이러스에 감염된 시료인지, 양성 대조구로부터 오염된 것인지 판단할 수 있다. 즉, 진짜 바이러스에 감염된 시료에서 나온 밴드는 인위적으로 삽입한 도 13의 6 bp 서열 (CTCGAG)이 존재하지 않을 것이나, 양성 대조구로부터 오염된 시료에서 나온 밴드는 인위적으로 삽입한 도 13의 6 bp 서열 (CTCGAG)이 존재할 것이므로, 이러한 서열분석 결과를 통해 바이러스 감염 또는 오염 여부를 정확하게 진단할 수 있다. BCMNV 바이러스 종 내에는 다양한 계통 (strain)이 있으므로, 염기서열의 일부가 치환되어 염기서열 확인 시 산물의 크기에 차이가 발생할 수 있다.
<110> REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency)
<120> Primer set for diagnosing Bean commom mosaic necrosis virus and
uses thereof
<130> PN13156
<160> 22
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 1
gcgaagagat ttgctgat 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
aagcagaaga agggaggt 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 3
taagcaagca gaggaacgg 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
aagtggtgct tacggaga 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 5
ttgttgctga gacaggtg 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 6
gagatgtcat actggcacc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 7
tgaggtgtat gaatccgtg 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 8
gattctaaac ttggaccacc ta 22
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 9
atgaccagca aatgggag 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 10
atcttcttgc gtggctga 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 11
ccagtatgac atctcacgg 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 12
atgaccagcc catacctac 19
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 13
tttacctgcc taacagcc 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 14
tcagcaactt ttcggtca 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 15
acataagcct tgtctccg 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 16
actcctttac tgcccaga 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 17
tggctctgtc tgaggttt 18
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 18
taacttgtcg cagcgtagg 19
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 19
cacactccat tcacatcg 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 20
ggagatgtcc cattatcg 18
<210> 21
<211> 1239
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCMNV positive control
<400> 21
gcgaagagat ttgctgataa tgccatcaag gcatatgata gccagctgaa ggccttcgat 60
gaacttttga agaaaaactc tgatcttcag aagagattgt ttattgggca gaatagccca 120
attaagcaga aaaagggagg cgcatgtttc gtgcgtagtc tttcatttaa gcaagcagag 180
gaacggcatg ctaagtacct caagctgcaa gaagaagagc accaattttt aagtggtgct 240
tacggagaca aggcttatgt tggcagtgta caaggtacac ttgaccaaaa agttgctgag 300
aaggtgagtt tcaaatcacc ttactacaag agaacctgca aggctgttag gcaggtaaaa 360
gttttgaaga aagctgttgg ctcgggaaaa gttttggacc aagttcttga aattgttgct 420
gagacaggtg tcccagtaac ttttgttggc aagggtgcaa acaaaaccct tcgagcacaa 480
tatgtgcgta ggtatgggct ggtcatacca aaaatctttt tgtgtcatga gagtggacga 540
aaagttcacc gtgagatgtc atactggcac cacaaagaga cccttcagta tctgtgcaaa 600
catggaaagt atggcgcact taatgaaaac gcgctgtgta agggagacag tggcttactc 660
ttcgatcaac gcacagcttt tgtgaagaga gtcacatatc taccacattt cattgtgcgc 720
ggtcggcaag aggggcagct agtctgtgca actgaatatc ttgacaatgt acacacaatt 780
gaacattata cgcacaaacc ggaggagcag tttttcaaag ggtggaagca agtatttgac 840
aagatggcgc cccatacttt tgaacacgac tgtacaattg attacagtaa tgaacagtgt 900
ggcgaagtgg cagcaaccat atgtcaaaca ttgtttcctg ttaggaagct ttcttgcaac 960
aagtgcagac atcgaatcaa ggatttaagc tgggaagagt ttaagcaatt catcttagca 1020
catttaggat gctgcgcaaa attatgggaa gagcaaaaga atttgcctgg ccttgagaag 1080
atacactcac ttgtcgtgca agctacaagt gagaacatga tttttgaaac ttcaatggaa 1140
atagtgcggc tgacacaaaa ttatacaagt acccatatgt tgcaaataca agatatcaac 1200
aaagcactaa tgaaaggaag ttcagccacg caagaagat 1239
<210> 22
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCMNV mutation positive control
<400> 22
taagcaagca gaggaacggc atgctaagta cctcaagctg caagaagaag agcaccaatt 60
tttaagtggt gcttacggag acaaggctta tgttggcagt gtacactcga gaggtacact 120
tgaccaaaaa gttgctgaga aggtgagttt caaatcacct tactacaaga gaacctgcaa 180
ggctgttagg caggtaaaag ttttgaagaa agctgttggc tcgggaaaag ttttggacca 240
agttcttgaa attgttgctg agacaggtgt cccagtaact tttgttggca agggtgcaaa 300
caaaaccctt cgagcacaat atgtgcgtag gtatgggctg gtcat 345
Claims (9)
- 서열번호 3 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 BCMNV (Bean common mosaic necrosis virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 서열번호 3 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 BCMNV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 서열번호 4 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 2 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 BCMNV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, BCMNV 진단용 키트.
- 제4항에 있어서, 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 DNA 단편 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 DNA 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 DNA 단편을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 BCMNV 진단용 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 BCMNV 진단용 키트.
- 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, BCMNV를 진단하는 방법. - 제7항에 있어서, 상기 식물은 콩과 (Fabaceae) 식물인 것을 특징으로 하는 BCMNV를 진단하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 BCMNV를 진단하는 방법.
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| KR20070083260A (ko) * | 2006-02-03 | 2007-08-24 | 한국생명공학연구원 | 콩모자이크바이러스 진단용 특이 프라이머 |
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