KR101124602B1 - 토마토덤불위축바이러스 진단용 프라이머 조합 및 이의 용도 - Google Patents

토마토덤불위축바이러스 진단용 프라이머 조합 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 2 내지 13으로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 조합을 포함하는 TBSV 진단용 프라이머 조합, 상기 프라이머 조합을 포함하는 TBSV 진단용 키트, 및 상기 프라이머 조합을 이용하여 TBSV를 종 특이적으로 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 피시알 검사 시스템은 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 검역현장 및 임상진단에서 식물체로부터 TBSV의 검사에 이용할 수 있을 것이다.
진단법, 토마토덤불위축바이러스, RT-PCR, 토마토, 고추, 사과, Nested PCR, 양성대조구, 진단시스템, 식물검역

Description

토마토덤불위축바이러스 진단용 프라이머 조합 및 이의 용도{Primer combination for diagnosing Tomato bushy stunt virus and uses thereof}
본 발명은 가지과 작물 등에 큰 피해를 주고 있는 토마토덤불위축바이러스(Tomato bushy stunt virus, TBSV)를 진단하기 위한 피시알(PCR) 검사시스템에 관한 것이다. 피시알 검사시스템은 TBSV 진단용 최적 프라이머쌍 및 이에 부합하는 검정용 프라이머쌍(nested primer)과 이를 뒷받침할 수 있는 종 특이 프라이머 은행 및 양성대조구를 포함하고 있다.
바이러스 진단법으로 과거에는 전자현미경과 혈청학적 방법(ELISA)을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태적 특징으로 종을 진단하기는 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA 방법은 가장 일반적으로 사용하여온 진단 방법이나 피시알 진단법보다 검출감도가 약 1000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 진단에 실패하는 경우가 종종 발생한다.
현재 RNA 바이러스의 진단에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법을 가장 일반적으로 사용하고 있다. 병원체의 피시알 진단을 위해서는 종 특이 프라이머의 개발이 가장 중요하다. TBSV를 진단하기 위한 특이 프라이머는 특허 출원된 바 없다.
TBSV는 자연상태에서 주로 가지과 작물에 발생하고 있으며, 전염수단은 즙액에 의한 접촉전염, 접목전염, 종자전염 등이 알려져 있다. TBSV은 검역대상 병원체로서 수입되는 토마토, 고추, 사과 등의 식물체로부터 이를 검출할 수 있는 진단법을 필요로 한다. 지금까지 TBSV를 진단하기 위하여 주로 ELISA 방법을 사용하고 있으나, 식물체 추출물과 항혈청의 비특이적 반응으로 오진단하는 경우가 종종 있다. 또한 검사할 종자에서 TBSV의 감염율이 낮을 경우 ELISA 진단법으로는 검사에 실패할 가능성이 높다. 그리하여 이런 종자에서 바이러스를 검출하기 위해서는 일반적으로 ELISA 진단법보다 검출감도가 1000배 정도 높은 피시알 진단법이 필요하다. 검역현장에서는 하나의 검사시료에 대하여 다양한 병원체의 진단을 수행하여야 됨으로 여러 가지 진단법을 사용할 경우 많은 노동력과 검사비용이 소요된다. 그래서 각각의 병원체에 대하여 동일한 검사법의 개발이 필요하다. 피시알 검사법으로 진단할 때, 특이적 반응의 강도가 낮아 판별이 곤란할 경우, 또는 다른 핵산과의 비특이적 반응을 일으킬 경우를 대비하여 병원체별 진단용 프라이머 은행의 구축과 피시알 양성 및 음성 반응을 검정할 수 있는 시스템을 필요로 한다. 한편, 분리주 특이적 프라이머를 진단에 사용할 경우 검사에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이 프라이머의 개발이 요구된다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, TBSV 종(species) 내에는 약간씩 다른 염기서열을 가지고 있는 계통(strain) 또는 분리주(isolate)들이 존재한다. 그리하여 분리주 특이적인 프라이머를 진단에 사용할 경우는 진단에 실패할 위험이 있다. 다시 말해서 바이러스 진단용 프라이머는 바이러스 각각에 대하여 종 특이적으로 작동하여야 한다. 본 발명에서의 프라이머는 종 특이적으로 작동하도록 설계하였다. 즉, 종 내에서 지금까지 알려진 염기서열을 수집하여 종의 모든 계통과 분리주가 가지고 있는 공통 염기서열을 탐색하였다. 그리고 이 공통 염기서열 중에서 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열을 프라이머 설계 대상에서 제외시킴으로써 종 특이적 서열을 선발하였다. 이러한 종 특이적 염기서열로부터 프라이머로 최적의 조건을 가지는 서열을 종 특이적 프라이머로 설계하였다. 설계한 프라이머들은 조합별로 실제적인 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 검출력이 우수한 조합을 최종적으로 선발하였다. 그리고 최종 선발된 프라이머 조합에 대하여 검정용 프라이머(nested primer)를 함께 개발하였다. 또한 TBSV에 대한 다양한 진단용 프라이머 조합을 확보하여 피시알 양성반응 및 음성반응을 검정할 수 있는 프라이머 은행을 구축하였다. 그리고 TBSV의 프라이머 설계 영역을 클로닝한 플라스미드를 제조하여 양성대조구를 확보하였으며, 염기서열을 결정하여 양성반응을 확인할 수 있게 하였다. 아울러 피시알 반응조건을 모든 바이 러스 및 프라이머 조합에서 동일하게 개발하여 검역현장에서 검사효율을 높일 수 있게 하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2 내지 13으로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 조합을 포함하는 TBSV 진단용 프라이머 조합을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 조합을 포함하는 TBSV 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 조합을 이용하여 TBSV를 종 특이적으로 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 토마토덤불위축바이러스(TBSV) 피시알 검사 시스템은 식물체 종자와 조직 등으로부터 TBSV을 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상 검출한계를 가지고 진단할 수 있다. 피시알 검사 시스템에 포함된 TBSV 진단용 프라이머는 지금까지 알려진 TBSV 모든 계통들과 반응할 수 있게 개발되었으며, 또한 양성 및 음성 반응의 검증을 위한 도구를 포함하고 있다. 본 발명의 검사 시스템은 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 검역현장에서 TBSV의 검사에 이용할 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 내지 13으로 표시 된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 조합을 포함하는 TBSV 진단용 프라이머 조합을 제공한다.
본 발명의 TBSV 진단용 프라이머 조합에서, 정방향 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되고, 역방향 프라이머는 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 다만, 본 발명의 프라이머 조합에서, 정방향 프라이머는 역방향 프라이머보다는 5'쪽에 위치해야 한다.
본 발명의 TBSV 진단용 프라이머 조합은 바람직하게는 서열번호 3 및 10의 프라이머 조합(조합 13); 및 서열번호 3 및 11의 프라이머 조합(조합 9)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 TBSV 진단용 프라이머 조합은 더욱 바람직하게는 서열번호 3 및 10의 프라이머 조합(조합 13); 및 서열번호 3 및 11의 프라이머 조합(조합 9)을 포함할 수 있다. 2개의 프라이머 조합을 동시에 이용하면 TBSV를 더욱 정확하게 진단할 수 있다.
본 발명의 TBSV 진단용 프라이머 조합은 또한 서열번호 3 및 12의 프라이머 조합; 및 서열번호 3 및 13의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 TBSV 진단용 프라이머 조합은 TBSV 진단용 프라이머 조합 9의 RT-PCR 산물에 대한 검증기능을 가진 프라이머 TBS-C40/N25 조합과 TBS-C35/N25 조합을 추가로 포함할 수 있다. 1차 RT-PCR 검사 결과 의 검정이 필요할 경우, 즉 RT-PCR 산물이 TBSV로부터 유래된 결과인지 확인하기 위하여 이 프라이머 조합에 대한 검정용 프라이머(nested primer)를 이용하여 PCR 검사를 실시한다. 이때 RT-PCR 반응 결과가 TBSV 유래에서 비롯되었다면 검정용 PCR에서 양성반응을 나타낼 것이다 (도 4 참고).
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 2 내지 서열번호 13의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 프라이머(19개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 3의 프라이머(23개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클 레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 조합; 및 서열번호 14의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 포함하는, TBSV 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 RT-PCR 에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 역전사효소, 리보뉴클레아제 저해제, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등일 수 있으며, 반응 완충액은 역전사 완충액 및 PCR 완충액 양자를 모두 포함하며, 내열성 중합효소는 EF Taq 중합효소 등을 이용할 수 있으며, 역전사효소는 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사효소 (Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 키트에 포함되는 서열번호 14의 염기서열을 갖는 DNA 단편은 TBSV 진단용 프라이머 조합을 이용한 RT-PCR 또는 PCR 반응에 대한 양성대조구의 기능을 가진 플라스미드로서 이용될 수 있다 (도 5 참고).
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
식물 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 조합을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, TBSV를 종 특이적으로 진단하는 방법을 제공한다.
식물 시료에서 전체 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 프라이머 조합을 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있 다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 식물은 토마토, 고추 등의 가지과 식물류 또는 사과 등의 과수류일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 TBSV에 감염될 수 있는 식물이면 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: TBSV 진단용 프라이머의 설계 및 조합
TBSV는 한 가닥 RNA로 구성된 직경 약 30nm의 구형 바이러스이다. TBSV의 핵산은 약 4.8kb의 하나의 RNA로 구성되어 있다. 분류학적으로 톰부스비리데(Tombusviridae) 톰부스바이러스(Tombusvirus) 속(genus)에 속한다. TBSV는 주로 즙액, 종자, 접목에 의해 전염된다. 자연상태에서 대부분의 기주는 가지 작물과 일부 과수류와 관련이 있다. 진단용 프라이머의 설계는 게놈 중에서 subgenomic RNA가 만들어지는 영역을 대상으로 이루어졌다.
TBSV 공통 염기서열 탐색은 지금까지 알려진 6가지 TBSV 분리주의 염기서열(표 1)을 다중 비교하여 이루어졌다. 이렇게 선발된 공통 염기서열은 TBSV과 분류학적으로 유사한 톰부스바이러스 5종의 바이러스 염기서열(표 2)과 비교하여 종 특이적인 서열을 탐색하였다. 이러한 종 특이적 염기서열들 중에서 프라이머 조건을 충족시키는 진단용 프라이머 13가지를 설계하였다(표 3). 설계한 프라이머의 위치는 도 1과 같다. 이들 프라이머를 이용하여 30개의 프라이머 조합을 만들었으며, RT-PCR 예상산물은 표 4와 같다.
표 1. 공통 염기서열 분석에 사용한 TBSV 분리주 염기서열
분리주 또는 계통 Genbank accession no. 크기(bp)
TBSV AY579432 4766
TBSV-cp AJ312281 1386
TBSV-pepper U80935 4776
TBSV-ch M21958 4776
TBSV-ORF3 AJ271328 1167
TBSV-statice AJ249740 4770
표 2. 종 특이적 염기서열 분석에 이용한 톰부스바이러스(Tombusvirus) 염기서열
바이러스 Genbank accession no. 크기(bp)
AMCV X62493 4789
CNV M25720 1053
GALV AY830918 4731
CIRV X85215 4760
CymRSV X15511 4733
표 3. TBSV 종 공통 염기서열로부터 설계된 진단용 프라이머
프 라 이 머 서 열 서열번호 길이 위치a
정방향 TBS-N10 TGGCGATGACAACGAGAAATAACAA 1 25 2,645-2,669
TBS-N20 GGCGGTGTCCAGGCAACTA 2 19 2,892-2,910
TBS-N25 AAATTTACCGGAAGGACATCTGG 3 23 2,926-2,948
TBS-N30 GCTGCGCATACCCACTGACAAA 4 22 3,276-3,297
TBS-N38 GTTGAGTACACGACGGCTTGACCT 5 24 3,459-3,482
TBS-N40 TACACGACGGCTTGACCTTACC 6 22 3,465-3,486
역방향 TBS-C10 TCCAGTTGTTGTGAATGTTACG 7 22 3,726-3,747
TBS-C15 CAGGTAGAGAGGATACCGTGCAATT 8 25 3,696-3,721
TBS-C20 TGCCCTAAAAGTGTGCGTCAAGA 9 23 3,545-3,567
TBS-C30 GGCCAAAGTTCCGGTAAGGTC 10 21 3,478-3,498
TBS-C25 CAAAGTTCCGGTAAGGTCAAGCC 11 23 3,473-3,495
TBS-C35 AGAACACCAAAGTTCGCCAACT 12 22 3,224-3,245
TBS-C40 CGCTACACGCCCTACTTCAG 13 20 3,155-3,174
a 프라이머의 위치는 Genbank accession no. AY579432를 기준으로 작성되었음.
표 4. TBSV 진단용 프라이머 조합과 RT-PCR 예상 산물
조합 역방향 위치 정방향 위치 산물(bp)
1 TBS-C40 3,155-3,174 TBS-N10 2,645-2,669 530
2 TBS-N20 2,892-2,910 283
3 TBS-N25 2,926-,2,948 249
4 TBS-C35 3,224-3,245 TBS-N10 2,645-2,669 601
5 TBS-N20 2,892-2,910 354
6 TBS-N25 2,926-,2,948 320
7 TBS-C25 3,473-3,495 TBS-N10 2,645-2,669 851
8 TBS-N20 2,892-2,910 604
9 TBS-N25 2,926-,2,948 570
10 TBS-N30 3,276-3,297 220
11 TBS-C30 3,478-3,498 TBS-N10 2,645-2,669 854
12 TBS-N20 2,892-2,910 607
13 TBS-N25 2,926-,2,948 573
14 TBS-N30 3,276-3,297 223
15 TBS-C20 3,545-3,567 TBS-N10 2,645-2,669 923
16 TBS-N20 2,892-2,910 676
17 TBS-N25 2,926-,2,948 642
18 TBS-N30 3,276-3,297 292
19 TBS-C15 3,696-3,721 TBS-N10 2,645-2,669 1,077
20 TBS-N20 2,892-2,910 830
21 TBS-N25 2,926-,2,948 796
22 TBS-N30 3,276-3,297 446
23 TBS-N38 3,459-3,482 263
24 TBS-N40 3,465-3,486 257
25 TBS-C10 3,726-3,747 TBS-N10 2,645-2,669 1,103
26 TBS-N20 2,892-2,910 856
27 TBS-N25 2,926-,2,948 822
28 TBS-N30 3,276-3,297 472
29 TBS-N38 3,459-3,482 289
30 TBS-N40 3,465-3,486 283
a 프라이머의 위치는 Genbank accession no. AY579432를 기준으로 작성되었음.
실시예 2: TBSV 진단용 프라이머 은행 구축 및 최적 프라이머 조합의 선발
설계한 TBSV 프라이머들은 30가지로 조합하여(표 4), TBSV 및 여러 가지 관련 바이러스와의 RT-PCR 검정을 통하여 진단에 가장 효과적인 프라이머 조합을 선발하였다. 최적 진단용 프라이머 조합의 선발은 2가지 단계로 이루어졌다. 첫 번째는 TBSV 감염식물체와의 RT-PCR을 통한 선발이며, 두 번째는 TBSV의 기주와 관련된 바이러스와의 RT-PCR 분석을 통한 선발이다.
본 발명에서 사용한 전체 RNA 분리 및 RT-PCR 방법은 다음과 같다.
전체 RNA 분리: 상업적으로 시판되는 total RNA 분리 키트(페놀을 이용한 방법(Promega), TRIzol(Invitrogen Co.), easy-spin TM Total RNA Kit(iNtRON Co.)를 이용하여 분리하였다.
RT-PCR: 역전사(Reverse transcription) 반응은 분리한 전체 RNA 0.5 ㎕, 12.5 pmole 다운스트림 프라이머(downstream primer), 5배 역전사 완충액(250 mM Tris-HCl, 150 mM KCl, 40 mM MgCl2, 5 mM DTT, pH 8.5) 1 ㎕, 10 mM dNTP 0.5 ㎕, 10 U RNase inhibitor, 그리고 2 U AMV 역전사효소를 첨가한 반응액 5 ㎕를 42℃에서 1 시간 항온 처리하여 실시한 다음 94℃에서 10 분간 변성시켰다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)은 역전사반응액 5 ㎕에 12.5 pmole 업스트림프라이머(upstream primer), 1.25 U Taq DNA polymerase, 10배 중합효소연쇄반응 완충액(100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, pH 8.3) 2 ㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 25 ㎕로 만들었다. 이 반응액을 95℃ 45 초, 55℃ 60 초, 72℃ 60 초로 40 회 증폭시켰으며 마지막에는 72℃에서 7 분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 0.5X TBE 완충액과 1.5 % 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 염색하여 확인하였다.
TBSV 감염식물체와의 RT-PCR 검정에서 반응강도가 뛰어나고 진단에 장해가 되는 비특이적 반응을 보이지 않는 8가지(조합 3, 6, 9, 12, 13, 18, 23, 24) 프라이머 조합을 선발하였다(도 2).
위에서 선발된 8가지 프라이머 조합 중에서 조합 6, 9, 13을 이용하여 TBSV 기주식물과 관련된 16가지 바이러스와의 RT-PCR 분석으로 2가지(조합 9, 13) 프라이머 조합을 최종적으로 선발하였다(도 4). 기주 관련 바이러스와의 비특이적 반응 분석에 이용된 16가지 바이러스는 다음과 같다: Alfalfa mosaic virus (AMV), Arracacha B virus (AVB), Carnation mottle virus (CarMV), Cherry leaf roll virus (CLRV), Cowpea mild mottle virus (CPMMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Pepper mottle virus (PepMoV), Pepper veinal mottle virus (PVMV), Potato Y virus (PVY), Ribgrass mosaic virus (RMV), Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV), Tobacco necrosis virus (TNV), Tobacco streak virus (TSV), Tomato black ring virus (TBRV), Tomato mosaic virus (ToMV), Tomato spotted wilt virus (TSWV).
이러한 결과들을 바탕으로 하여 종자 또는 식물체로부터 TBSV을 진단할 경우, 우선적으로 최적 진단용 프라이머로 선발된 프라이머 조합 9, 13을 이용하여 RT-PCR를 수행한다. 이 진단 결과가 미흡할 경우 TBSV 진단용 프라이머 은행의 다른 프라이머의 조합을 이용하여 검증이 가능할 것이다.
실시예 3: TBSV의 진단 및 검증의 예
검사현장에서 TBSV 진단용 최적 프라이머로 조합 9를 이용하여 1차적인 진단 을 실시한다. 1차 RT-PCR 검사 결과의 검정이 필요할 경우, 즉 RT-PCR 산물이 TBSV으로부터 유래된 결과인지 확인하기 위하여 이 프라이머 조합에 대한 검정용 프라이머(nested primer)를 이용하여 PCR 검사를 실시한다. 이때 RT-PCR 반응 결과가 TBSV 유래에서 비롯되었다면 검정용 PCR에서 양성반응을 나타낸다(도 4). 부가적으로 이러한 본 발명의 TBSV 프라이머 은행으로부터 유래된 PCR 산물을 쉽게 확인할 수 있도록 프라이머가 설계된 전체 영역을 포함하는 양성대조구를 제조하였다. 이 양성대조구는 PCR 검사시 양성대조구로 이용가능하며(도 5), 또한 확인인 필요한 PCR 산물의 염기서열을 쉽게 비교할 수 있도록 양성대조구 플라스미드의 삽입된 영역의 염기서열을 결정하여 제공하였다(도 6).
본 발명의 진단법을 실시할 경우 토마토, 고추, 사과 등의 종자 또는 식물체로부터 TBSV 감염여부를 정밀하게 진단할 수 있다. 또한 식물 바이러스에 대한 RT-PCR 진단키트의 산업화가 가능하다. 본 발명을 실시함으로써 국내 박과 작물에서 TBSV의 피해를 최소화할 수 있을 것이며, 국경 검역현장에서 손쉽게 활용할 수 있어 외국으로부터 TBSV에 감염된 박과 식물 종자의 유입을 효과적으로 차단할 수 있을 것이다.
도 1은 TBSV 프라이머 위치를 나타낸다. 위치는 Genbank accession no. AY579432를 기준으로 작성되었다.
도 2는 30가지 프라이머 조합의 TBSV과의 특이성을 검정한 것이다. RT-PCR 주형으로 TBSV에 감염된 토마토 잎 조직으로부터 추출된 전체 RNA를 사용하였으며, 1~30 프라이머 조합은 표 4를 참조한다.
도 3은 선발된 TBSV 진단용 프라이머 조합과 기주 관련 바이러스의 RT-PCR 분석 결과이다. 1:TBSV, 2:AMV, 3:AVB, 4:CarMV, 5:CLRV, 6:CPMMV, 7:CMV, 8:PepMoV, 9:PVMV, 10:PVY, 11:RMV, 12:TMGMV, 13:TNV, 14:TSV, 15:TBRV, 16:ToMV, 17:TSWV.
도 4는 TBSV 진단용 최적 프라이머 조합 및 검정용 프라이머 조합의 (RT)PCR 분석 결과이다.
M : size marker
1 : 최적 진단용 프라이머 조합9 (570bp)
2 : 조합 9에 대한 검정용 프라이머 조합 (TBS-C40/N25) (249bp)
3 : 조합 9에 대한 검정용 프라이머 조합 (TBS-C35/N25) (320bp)
도 5는 TBSV 양성대조구로부터 유래한 진단용 프라이머 조합의 PCR 산물을 나타낸다.
M : size marker
1 : 양성대조구에 삽입된 TBSV DNA 단편(1,077bp)
2 : TBS-C25/N25 (570bp)
도 6은 양성대조구에 삽입된 TBSV 염기서열(1,077bp)을 나타낸다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer combination for diagnosing Tomato bushy stunt virus and uses thereof <130> PN08261 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBS-N10 primer <400> 1 tggcgatgac aacgagaaat aacaa 25 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBS-N20 primer <400> 2 ggcggtgtcc aggcaacta 19 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBS-N25 primer <400> 3 aaatttaccg gaaggacatc tgg 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBS-N30 primer <400> 4 gctgcgcata cccactgaca aa 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBS-N38 primer <400> 5 gttgagtaca cgacggcttg acct 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBS-N40 primer <400> 6 tacacgacgg cttgacctta cc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBS-C10 primer <400> 7 tccagttgtt gtgaatgtta cg 22 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBS-C15 primer <400> 8 caggtagaga ggataccgtg caatt 25 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBS-C20 primer <400> 9 tgccctaaaa gtgtgcgtca aga 23 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBS-C30 primer <400> 10 ggccaaagtt ccggtaaggt c 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBS-C25 primer <400> 11 caaagttccg gtaaggtcaa gcc 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBS-C35 primer <400> 12 agaacaccaa agttcgccaa ct 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBS-C40 primer <400> 13 cgctacacgc cctacttcag 20 <210> 14 <211> 1077 <212> DNA <213> Tomato bushy stunt virus <400> 14 tggcgatgac aacgagaaat aacaacaatg tgctcgctat aagcaagaaa cagttggggg 60 tcctagcagc atctgctgct gtgggggctc tgcgtaatca tattagtgag agtagcccgg 120 cactgctgca accggcagtg agtttgggaa agaaggcttt gaataaggtg aggaatcgga 180 ggaaacaggg aaatcagcag atcattactc atgtaggcgg cgtcgggggt tcaatcatgg 240 cccctgtggc agtgtccagg cagctagtag gtagtaagcc gaaatttacc ggaaggacat 300 ctggatctat cacagttacg caccgcgagt atcttacaca agtaaacaat tcttcaggat 360 ttgtagtaaa tgggggtatt gtcggcaatt tgttacaact caacccgtca aatggaacac 420 tgttctcatg gttgcctgcc atagcatcca attttgatca gtactcattc aacagcgttg 480 tgttacatta tgtcccccta tgcggtacta ctgaagttgg gcgtgtggcg ctatactttg 540 acaaggactc acaagatcct gaacctgctg atagagtgga gttggcgaac ttcggtgttc 600 taaaggagac agccccttgg gctgaggcaa tgctgcgcat acccactgac aaagtaaaga 660 gatactgtaa tgacagtgct acagttgatc agaaacttat agatttggga cagcttggta 720 ttgctactta cggaggggca ggtacaaacg ctgtagggga tgtgtttatc tcctatagtg 780 ttacgttgta ctttcctcaa cccaccaaca ccctgttaag tacacgacgg cttgacctca 840 ccggatcttt ggctgatgct acgggacctg ggtaccttgt actgacaaga acgcccacgg 900 tcttaacgca cacatttagg gcaactggca cttttaacct ctccggaggg ttgaggtgtt 960 taaccagtct cactctcgga gcgacggggg ctgtggtcat taatgacata cttgcaattg 1020 ataatgtcgg tacggctagc gcctacttcc tcaattgcac ggtatcctct ctacctg 1077

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 서열번호 3 및 10의 프라이머 조합; 및 서열번호 3 및 11의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 TBSV 종 특이적 진단용 프라이머 조합.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 3 및 10의 프라이머 조합; 및 서열번호 3 및 11의 프라이머 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 TBSV 종 특이적 진단용 프라이머 조합.
  4. 제2항에 있어서, 서열번호 3 및 12의 프라이머 조합; 및 서열번호 3 및 13의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 TBSV 종 특이적 진단용 프라이머 조합.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 조합; 및 서열번호 14의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 포함하는, TBSV 종 특이적 진단용 키트.
  6. 식물 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 조합을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, TBSV를 종 특이적으로 진단하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물은 가지과 식물류 또는 과수류인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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