KR101174708B1 - 레스베리윤문바이러스 진단용 프라이머 조합 및 이의 용도 - Google Patents

레스베리윤문바이러스 진단용 프라이머 조합 및 이의 용도

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 41로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 조합을 포함하는 RpRSV 진단용 프라이머 조합, 상기 프라이머 조합을 포함하는 RpRSV 진단용 키트, 및 상기 프라이머 조합을 이용하여 RpRSV를 종 특이적으로 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 피시알 검사 시스템은 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 검역현장 및 임상진단에서 식물체로부터 RpRSV의 검사에 이용할 수 있을 것이다.
진단법, 레스베리윤문바이러스, RT-PCR, Nested PCR, 양성대조구, 진단시스템, 식물검역

Description

레스베리윤문바이러스 진단용 프라이머 조합 및 이의 용도{Primer combination for diagnosing Raspberry ringspot virus and uses thereof}
본 발명은 레스베리, 딸기 등에 발생하는 레스베리윤문바이러스(Raspberry ringspot virus, RpRSV)를 진단하기 위한 피시알(PCR) 검사시스템에 관한 것이다. 피시알 검사시스템은 RpRSV 진단용 최적 프라이머쌍 및 이에 부합하는 검정용 프라이머쌍(nested primer)과 이를 뒷받침할 수 있는 종 특이 프라이머 은행 및 양성대조구를 포함하고 있다.
바이러스 진단법으로 과거에는 전자현미경과 혈청학적 방법(ELISA)을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태적 특징으로 종을 진단하기는 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA 방법은 가장 일반적으로 사용하여온 진단 방법이나 피시알 진단법보다 검출감도가 약 1000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 진단에 실패하는 경우가 종종 발생한다.
현재 RNA 바이러스의 진단에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법을 가장 일반적으로 사용하고 있다. 병원체의 피시알 진단을 위해서는 종 특이 프라이머의 개발이 가장 중요하다. RpRSV를 진단하기 위한 특이 프라이머는 특허 출원된 바 없다.
RpRSV는 자연상태에서 주로 레스베리, 딸기, 체리, 포도 등에 발생하고 있으며, 즙액, 선충, 종자 등에 의해 전염된다. RpRSV는 검역대상 병원체로서 수입되는 식물체로부터 이를 검출할 수 있는 진단법을 필요로 한다. 지금까지 RpRSV를 진단하기 위하여 주로 ELISA 방법을 사용하고 있으나, 식물체 추출물과 항혈청의 비특이적 반응으로 오진단하는 경우가 종종 있다. 또한 검사할 종자에서 RpRSV의 감염율이 낮을 경우 ELISA 진단법으로는 검사에 실패할 가능성이 높다. 그리하여 이런 종자에서 바이러스를 검출하기 위해서는 일반적으로 ELISA 진단법보다 검출감도가 1000배 정도 높은 피시알 진단법이 필요하다. 검역현장에서는 하나의 검사시료에 대하여 다양한 병원체의 진단을 수행하여야 됨으로 여러 가지 진단법을 사용할 경우 많은 노동력과 검사비용이 소요된다. 그래서 각각의 병원체에 대하여 동일한 검사법의 개발이 필요하다. 피시알 검사법으로 진단할 때, 특이적 반응의 강도가 낮아 판별이 곤란할 경우, 또는 다른 핵산과의 비특이적 반응을 일으킬 경우를 대비하여 병원체별 진단용 프라이머 은행의 구축과 피시알 양성 및 음성 반응을 검정할 수 있는 시스템을 필요로 한다. 한편, 분리주 특이적 프라이머를 진단에 사용할 경우 검사에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이 프라이머의 개발이 요구된다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, RpRSV 종(species) 내에는 약간씩 다른 염기서열을 가지고 있는 계통(strain) 또는 분리주(isolate)들이 존재한다. 그리하여 분리주 특이적인 프라이머를 진단에 사용할 경우는 진단에 실패할 위험이 있다. 다시 말해서 바이러스 진단용 프라이머는 바이러스 각각에 대하여 종 특이적으로 작동하여야 한다. 본 발명의 프라이머는 종 특이적으로 작동하도록 설계하였다. 즉, 종 내에서 지금까지 알려진 염기서열을 수집하여 종의 모든 계통과 분리주가 가지고 있는 공통 염기서열을 탐색하였다. 그리고 이 공통 염기서열 중에서 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열을 프라이머 설계 대상에서 제외시킴으로써 종 특이적 서열을 선발하였다. 이러한 종 특이적 염기서열로부터 프라이머로 최적의 조건을 가지는 서열을 종 특이적 프라이머로 설계하였다. 설계한 프라이머들은 조합별로 실제적인 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 검출력이 우수한 조합을 최종적으로 선발하였다. 그리고 최종 선발된 프라이머 조합에 대하여 검정용 프라이머(nested primer)를 함께 개발하였다. 또한 RpRSV에 대한 다양한 진단용 프라이머 조합을 확보하여 피시알 양성반응 및 음성반응을 검정할 수 있는 프라이머 은행을 구축하였다. 그리고 RpRSV의 프라이머 설계 영역을 클로닝한 플라스미드를 제조하여 양성대조구를 확보하였으며, 염기서열을 결정하여 양성반응을 확인할 수 있게 하였다. 아울러 피시알 반응조건을 모든 바이러스 및 프라이머 조합에서 동일하게 개발하여 검역현장에서 검사효율을 높일 수 있게 하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 41로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 조합을 포함하는 RpRSV 진단용 프라이머 조합을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 조합을 포함하는 RpRSV 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 조합을 이용하여 RpRSV를 종 특이적으로 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 레스베리윤문바이러스(RpRSV) 피시알 검사 시스템은 식물체 종자와 조직 등으로부터 RpRSV를 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상 검출한계를 가지고 진단할 수 있다. 피시알 검사 시스템에 포함된 RpRSV 진단용 프라이머는 지금까지 알려진 RpRSV 모든 계통들과 반응할 수 있게 개발되었으며, 또한 양성 및 음성 반응의 검증을 위한 도구를 포함하고 있다. 본 발명의 검사 시스템은 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 검역현장에서 RpRSV의 검사에 이용할 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 41로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 조합을 포함하는 RpRSV 진단용 프라이머 조합을 제공한다.
본 발명의 RpRSV 진단용 프라이머 조합에서, 정방향 프라이머는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되고, 역방향 프라이머는 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 39 및 서열번호 41의 염기서열로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 다만, 본 발명의 프라이머 조합에서, 정방향 프라이머는 역방향 프라이머보다는 5'쪽에 위치해야 한다.
본 발명의 RpRSV 진단용 프라이머 조합은 바람직하게는 서열번호 12 및 28의 프라이머 조합(조합 52); 서열번호 11 및 28의 프라이머 조합(조합 53); 및 서열번호 8 및 31의 프라이머 조합(조합 84)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 RpRSV 진단용 프라이머 조합은 더욱 바람직하게는 서열번호 12 및 28의 프라이머 조합; 서열번호 11 및 28의 프라이머 조합; 및 서열번호 8 및 31의 프라이머 조합을 포함할 수 있다. 3개의 프라이머 조합을 동시에 이용하면 RpRSV를 더욱 정확하게 진단할 수 있다.
본 발명의 RpRSV 진단용 프라이머 조합은 또한 서열번호 14 및 30의 프라이 머 조합; 서열번호 15 및 30의 프라이머 조합; 서열번호 14 및 31의 프라이머 조합; 서열번호 12 및 32의 프라이머 조합; 서열번호 12 및 33의 프라이머 조합; 서열번호 12 및 34의 프라이머 조합; 및 서열번호 11 및 34의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 RpRSV 진단용 프라이머 조합은 RpRSV 진단용 프라이머 조합 52의 RT-PCR 산물에 대한 검증기능을 가진 프라이머 조합(RpRS-C18/N39, RpRS-C18/N40, RpRS-C19/N39), RpRSV 진단용 프라이머 조합 53의 RT-PCR 산물에 대한 검증기능을 가진 프라이머 조합(RpRS-C18/N39, RpRS-C20/N37, RpRS-C30/N37), RpRSV 진단용 프라이머 조합 84의 RT-PCR 산물에 대한 검증기능을 가진 프라이머 조합(RpRS-C20/N37, RpRS-C32/N37, RpRS-C32/N35)을 추가로 포함할 수 있다. 1차 RT-PCR 검사 결과의 검정이 필요할 경우, 즉 RT-PCR 산물이 RpRSV로부터 유래된 결과인지 확인하기 위하여 이 프라이머 조합에 대한 검정용 프라이머(nested primer)를 이용하여 PCR 검사를 실시한다. 이때 RT-PCR 반응 결과가 RpRSV 유래에서 비롯되었다면 검정용 PCR에서 양성반응을 나타낼 것이다 (도 5 참고).
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 서열번호 41의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(22개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리 고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 2의 프라이머(21개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 조합; 및 서열번호 43의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 포함하는, RpRSV 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 RT-PCR 에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 역전사효소, 리보뉴클레아제 저해제, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등일 수 있으며, 반응 완충액은 역전사 완충액 및 PCR 완충액 양자를 모두 포함하며, 내열성 중합효소는 EF Taq 중합효소 등을 이용할 수 있으며, 역전사효소는 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사효소 (Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 키트에 포함되는 서열번호 43의 염기서열을 갖는 DNA 단편은 RpRSV 진단용 프라이머 조합을 이용한 RT-PCR 또는 PCR 반응에 대한 양성대조구의 기능을 가진 플라스미드로서 이용될 수 있다 (도 6 참고).
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
식물 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 조합을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, RpRSV를 종 특이적으로 진단하 는 방법을 제공한다.
식물 시료에서 전체 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 프라이머 조합을 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 식물은 레스베리, 딸기, 포도 또는 체리일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 RpRSV에 감염될 수 있는 식물이면 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: RpRSV 진단용 프라이머의 설계 및 조합
RpRSV는 한가닥 RNA로 구성된 직경 약 30nm의 구형 바이러스이다. RpRSV의 게놈은 전체 약 12.7kb이며, 두 가지로 구성된다. RNA 1은 약 8.5kb, RNA 2는 약 4.2kb이다. 분류학적으로 코모비리데(Comoviridae) 네포바이러스(Nepovirus) 속(genus)에 속한다. RpRSV는 주로 즙액, 선충, 종자에 의해 전염된다. 실험적 기주범위는 넓은 편이며, 자연상태에서는 레스베리, 딸기, 체리, 포도 등에 발생하고 있다. 진단용 프라이머의 설계는 외피단백질이 코드된 RNA 2를 대상으로 이루어졌다.
RpRSV 공통 염기서열 탐색은 지금까지 알려진 12가지 RpRSV 분리주의 염기서열(표 1)을 다중 비교하여 이루어졌다. 이렇게 선발된 공통 염기서열은 RpRSV와 분류학적으로 유사한 코모비리데(Comoviridae) 9종의 바이러스 염기서열(표 2)과 비교하여 종 특이적인 서열을 탐색하였다. 이러한 종 특이적 염기서열들 중에서 프라이머 조건을 충족시키는 진단용 프라이머 42가지를 설계하였다(표 3). 설계한 프라이머의 위치는 도 1과 같다. 이들 프라이머를 이용하여 149개의 프라이머 조합을 만들었으며, RT-PCR 예상산물은 표 4와 같다.
표 1. 공통 염기서열 분석에 사용한 RpRSV 분리주 염기서열
분리주 또는 계통 Genbank ac. no. 크기(bp) 분석 게놈
RpRSV-Tarvit AF226159 + AF116191 1075
1542		 RNA2
RpRSV-Shephe AF226158 +AF116190 1075
1542		 RNA2
RpRSV-Orr AF226157 + AF116189 1075
1542		 RNA2
RpRSV-Cherry NC_005267 3914 RNA2
RpRSV-cherry AY303788 3914 RNA2
RpRSV S46011 3928 RNA2
RpRSV-Grapevine AY310445 3912 RNA2
RpRSV-Mx AF224697 + AF111114 1075
1542		 RNA2
RpRSV-Lloyd AF224696 + AF110795 1075
1542		 RNA2
RpRSV-Himalaya AF110476 1542 RNA2
RpRSV-Cherry AY303788 3914 RNA2
RpRSV-RAC815 DQ004850 3113 RNA2
표 2. 종 특이적 염기서열 분석에 이용한 Bromoviridae 바이러스 염기서열
바이러스 Genbank ac. no. 크기(bp) 분석 게놈
ArMV NC_006056 3820 RNA2
GFLV-F13 X16907 3774 RNA2
TRSV AY363727 3929 RNA2
CNSV AB073148 4667 RNA2
GCMV X15163 4441 RNA2
OLRSV-Olive-Italy AJ277435 3969 RNA2
TBRV-MJ AY157994 4633 RNA2
BLMV U20621 3082 RNA2
ToRSV NC_003839 7271 RNA2
표 3. RpRSV 종 공통 염기서열로부터 설계된 진단용 프라이머
프 라 이 머 서 열(5'-3') 서열번호 길이 위치a
정방향 RpRS-N10 GAGAATTCCCCGAGGCTGTTAT 1 22 220241
RpRS-N15 CCCCAGGTTCGGAGGAGTTAC 2 21 374-394
RpRS-N20 AGACTCCTTCGCGAACGGCTACACG 3 25 453477
RpRS-N22 CCCGGTAGCCAATAAGGAGAACATC 4 25 476-500
RpRS-N24 GCTTTTCTTGAGGCTCCCACACC 5 23 567-589
RpRS-N26 CTGGCCTAAAGATGATTGGTT 6 21 620-640
RpRS-N28 TCTGATTCCCGCTTGTATGATGAC 7 24 836-859
RpRS-N30 TTCCCGCTTGTATGATGACTGACCA 8 25 841865
RpRS-N31 GGGTGATAGGCAAGCCGACAAGGA 9 24 881-905
RpRS-N33 CGACAAGGAAGAGCGGCAGGATT 10 23 896-918
RpRS-N35 GGCCAATGATCCCAATAAAGTT 11 22 1,022-1,043
RpRS-N37 CAAAGAGTGCGCTGTTCCATA 12 21 1,051-1,071
RpRS-N38 CAACTTACCACGCATGTCCGAGAAT 13 25 1,238-1,262
RpRS-N39 GCTGAGGCTGGGTGGAATAATG 14 22 1,278-1,299
RpRS-N40 ATGCGGATATTTGTGGCGTGGAT 15 23 1,2971,319
RpRS-N42 CTGAATCTTCCGCTGCTGAGTT 16 22 1,458-1,479
RpRS-N45 TGAAGCAGACCGCATTTGAGC 17 21 1,615-1,635
RpRS-N47 TTGTGTTGCGTCCCAGGGTATCGTG 18 25 1,700-1,724
RpRS-N50 GTATGCTGCAGACCTGGGAGAAG 19 23 1,717-1,915
RpRS-N52 TCGCCGTCTGATTTATGGAG 20 20 1,878-1,897
RpRS-N55 AGTAGGCCCTCTGTGGATGG 21 20 1,896-1,915
RpRS-N58 TAATGTGCCTGGTTGTGCCTATGAG 22 25 1,964-1,988
역방향 RpRS-C08 CAACAAGTGCAATGGATCTACCTCA 23 25 1,985-2,009
RpRS-C09 TAGGCACAACCAGGCACATTATC 24 23 1,962-1,984
RpRS-C10 GGCCGCACAACCTCCCCAGATT 25 22 1,8221,843
RpRS-C12 GGGGAACAGGAGGCAAGACCA 26 21 1,774-1,794
RpRS-C14 ATCCTCCCTTGAAAGAATATGCACC 27 25 1,747-1,771
RpRS-C15 GGTGCATATTCTTTCAAGGGAGGAT 28 25 1,699-1,723
RpRS-C17 TCTTTGCTCAGGGATTCTTGGTC 29 23 1,641-1,663
RpRS-C18 GCGAAGAAAAGCTCAACATAG 30 21 1,579-1,599
RpRS-C19 AAAGGTAAACTCAGCAGCGGAAGAT 31 25 1,461-1,485
RpRS-C20 GGGCATATCAGAACACGCACCATC 32 24 1,3801,403
RpRS-C30 TCCGCATTATTCCACCCAGCCTCAC 33 25 1,2791,303
RpRS-C32 CGCATTATTCCACCCAGCCTCAGC 34 24 1,278-1,301
RpRS-C42 AAGGCGGACTGTATATTTCTCAA 35 23 1,168-1,190
RpRS-C50 ATAATCCTGCCGCTCTTCCTTGTCG 36 25 896920
RpRS-C52 GGTAGTCTGATTCCCGCTTGTATGA 37 25 831-865
RpRS-C55 GTTTAGGGACGCCAAGCAAGG 38 21 638-658
RpRS-C57 TAATACGACCACTCTCCCACTCAGG 39 25 588-612
RpRS-C59 CAGCTCCTCTTGGTTGATGC 40 20 538-557
RpRS-C60 CAGGCGCATCATAATACATACAATC 41 25 513-537
RpRS-C62 GATGTTCTCCTTATTGGCTACC 42 22 479-500
a 위치는 Genbank ac. no. AY303788을 기준으로 작성되었음.
표 4. RpRSV 진단용 프라이머 조합과 RT-PCR 예상 산물
조합 역방향 위치 정방향 위치 산물(bp)
1 RpRS-C08 1,985-2,009 RpRS-N50 1,717-1,915 293
2 RpRS-N47 1,700-1,724 310
3 RpRS-N45 1,615-1,635 395
4 RpRS-N42 1,458-1,479 552
5 RpRS-N40 1,297-1,319 713
6 RpRS-N39 1,278-1,299 732
7 RpRS-N38 1,238-1,262 772
8 RpRS-N37 1,051-1,071 959
9 RpRS-N35 1,022-1,043 988
10 RpRS-C09 1,962-1,984 RpRS-N50 1,717-1,915 268
11 RpRS-N47 1,700-1,724 285
12 RpRS-N45 1,615-1,635 370
13 RpRS-N42 1,458-1,479 527
14 RpRS-N40 1,297-1,319 688
15 RpRS-N39 1,278-1,299 707
16 RpRS-N38 1,238-1,262 747
17 RpRS-N37 1,051-1,071 934
18 RpRS-N35 1,022-1,043 963
(계속)
조합 역방향 위치 정방향 위치 산물(bp)
19 RpRS-C10 1,822-1,843 RpRS-N45 1,615-1,635 229
20 RpRS-N42 1,458-1,479 386
21 RpRS-N40 1,297-1,319 547
22 RpRS-N39 1,278-1,299 566
23 RpRS-N38 1,238-1,262 606
24 RpRS-N37 1,051-1,071 793
25 RpRS-N35 1,022-1,043 822
26 RpRS-N33 896-918 948
27 RpRS-N31 881-905 963
28 RpRS-C12 1,774-1,794 RpRS-N42 1,458-1,479 337
29 RpRS-N40 1,297-1,319 498
30 RpRS-N39 1,278-1,299 517
31 RpRS-N38 1,238-1,262 557
32 RpRS-N37 1,051-1,071 744
33 RpRS-N35 1,022-1,043 773
34 RpRS-N33 896-918 899
35 RpRS-N31 881-905 914
36 RpRS-N30 841-865 954
37 RpRS-N28 836-859 959
38 RpRS-C14 1,747-1,7711 RpRS-N42 1,458-1,479 314
39 RpRS-N40 1,297-1,319 475
40 RpRS-N39 1,278-1,299 494
41 RpRS-N38 1,238-1,262 534
42 RpRS-N37 1,051-1,071 721
43 RpRS-N35 1,022-1,043 750
44 RpRS-N33 896-918 876
45 RpRS-N31 881-905 891
46 RpRS-N30 841-865 931
47 RpRS-N28 836-859 936
(계속)
조합 역방향 위치 정방향 위치 산물(bp)
48 RpRS-C15 1,699-1,723 RpRS-N42 1,458-1,479 266
49 RpRS-N40 1,297-1,319 427
50 RpRS-N39 1,278-1,299 446
51 RpRS-N38 1,238-1,262 486
52 RpRS-N37 1,051-1,071 673
53 RpRS-N35 1,022-1,043 702
54 RpRS-N33 896-918 828
55 RpRS-N31 881-905 843
56 RpRS-N30 841-865 883
57 RpRS-N28 836-859 888
58 RpRS-C17 1,641-1,663 RpRS-N42 1,458-1,479 206
59 RpRS-N40 1,297-1,319 367
60 RpRS-N39 1,278-1,299 386
61 RpRS-N38 1,238-1,262 426
62 RpRS-N37 1,051-1,071 613
63 RpRS-N35 1,022-1,043 642
64 RpRS-N33 896-918 768
65 RpRS-N31 881-905 783
66 RpRS-N30 841-865 823
67 RpRS-N28 836-859 828
68 RpRS-C18 1,579-1,599 RpRS-N40 1,297-1,319 303
69 RpRS-N39 1,278-1,299 322
70 RpRS-N38 1,238-1,262 362
71 RpRS-N37 1,051-1,071 549
72 RpRS-N35 1,022-1,043 578
73 RpRS-N33 896-918 704
74 RpRS-N31 881-905 719
75 RpRS-N30 841-865 759
76 RpRS-N28 836-859 764
77 RpRS-N26 620-640 980
(계속)
조합 역방향 위치 정방향 위치 산물(bp)
78 RpRS-C19 1,461-1,485 RpRS-N39 1,278-1,299 208
79 RpRS-N38 1,238-1,262 248
80 RpRS-N37 1,051-1,071 435
81 RpRS-N35 1,022-1,043 464
82 RpRS-N33 896-918 590
83 RpRS-N31 881-905 605
84 RpRS-N30 841-865 645
85 RpRS-N28 836-859 650
86 RpRS-N26 620-640 866
87 RpRS-N24 567-589 919
88 RpRS-C20 1,380-1,403 RpRS-N37 1,051-1,071 353
89 RpRS-N35 1,022-1,043 382
90 RpRS-N33 896-918 508
91 RpRS-N31 881-905 523
92 RpRS-N30 841-865 563
93 RpRS-N28 836-859 568
94 RpRS-N26 620-640 784
95 RpRS-N24 567-589 837
96 RpRS-N22 476-500 928
97 RpRS-N20 453-477 951
98 RpRS-C30 1,279-1,303 RpRS-N37 1,051-1,071 253
99 RpRS-N35 1,022-1,043 282
100 RpRS-N33 896-918 408
101 RpRS-N31 881-905 423
102 RpRS-N30 841-865 463
103 RpRS-N28 836-859 468
104 RpRS-N26 620-640 684
105 RpRS-N24 567-589 737
106 RpRS-N22 476-500 828
107 RpRS-N20 453-477 851
108 RpRS-N15 374-394 930
(계속)
조합 역방향 위치 정방향 위치 산물(bp)
109 RpRS-C32 1,278-1,3011 RpRS-N37 1,051-1,071 251
110 RpRS-N35 1,022-1,043 280
111 RpRS-N33 896-918 406
112 RpRS-N31 881-905 421
113 RpRS-N30 841-865 461
114 RpRS-N28 836-859 466
115 RpRS-N26 620-640 682
116 RpRS-N24 567-589 735
117 RpRS-N22 476-500 826
118 RpRS-N20 453-477 849
119 RpRS-N15 374-394 928
120 RpRS-C42 1,168-1,190 RpRS-N33 896-918 295
121 RpRS-N31 881-905 310
122 RpRS-N30 841-865 350
123 RpRS-N28 836-859 355
124 RpRS-N26 620-640 571
125 RpRS-N24 567-589 624
126 RpRS-N22 476-500 715
127 RpRS-N20 453-477 738
128 RpRS-N15 374-394 817
129 RpRS-N10 220-241 971
130 RpRS-C50 896-920 RpRS-N26 620-640 301
131 RpRS-N24 567-589 354
132 RpRS-N22 476-500 445
133 RpRS-N20 453-477 468
134 RpRS-N15 374-394 547
135 RpRS-N10 220-241 701
(계속)
조합 역방향 위치 정방향 위치 산물(bp)
136 RpRS-C52 831-865 RpRS-N26 620-640 246
137 RpRS-N24 567-589 299
138 RpRS-N22 476-500 390
139 RpRS-N20 453-477 413
140 RpRS-N15 374-394 492
141 RpRS-N10 220-241 646
142 RpRS-C55 638-658 RpRS-N20 453-477 206
143 RpRS-N15 374-394 285
144 RpRS-N10 220-241 439
145 RpRS-C57 588-612 RpRS-N15 374-394 239
146 RpRS-N10 220-241 393
147 RpRS-C59 538-557 RpRS-N10 220-241 338
148 RpRS-C60 513-537 RpRS-N10 220-241 318
149 RpRS-C62 479-500 RpRS-N10 220-241 281
실시예 2: RpRSV 진단용 프라이머 은행 구축 및 최적 프라이머 조합의 선발
설계한 RpRSV 프라이머들은 149가지로 조합하여(표 4), RpRSV 및 여러 가지 관련 바이러스와의 RT-PCR 검정을 통하여 진단에 가장 효과적인 프라이머 조합을 선발하였다. 최적 진단용 프라이머 조합의 선발은 3가지 단계로 이루어졌다. 첫 번째는 RpRSV 감염 식물체와의 RT-PCR을 통한 선발이며, 두 번째는 분류학적 유사성이 있는 코모비리데 바이러스와의 비특이적 반응 분석이며, 세 번째는 RpRSV의 기주와 관련된 바이러스와의 RT-PCR 분석을 통한 선발이다.
본 발명에서 사용한 전체 RNA 분리 및 RT-PCR 방법은 다음과 같다.
전체 RNA 분리: 상업적으로 시판되는 total RNA 분리 키트(페놀을 이용한 방법(Promega), TRIzol(Invitrogen Co.), easy-spin TM Total RNA Kit(iNtRON Co.)를 이용하여 분리하였다.
RT-PCR: 역전사(Reverse transcription) 반응은 분리한 전체 RNA 0.5 ㎕, 12.5 pmole 다운스트림 프라이머(downstream primer), 5배 역전사 완충액(250 mM Tris-HCl, 150 mM KCl, 40 mM MgCl2, 5 mM DTT, pH 8.5) 1 ㎕, 10 mM dNTP 0.5 ㎕, 10 U RNase inhibitor, 그리고 2 U AMV 역전사효소를 첨가한 반응액 5 ㎕를 42℃에서 1 시간 항온 처리하여 실시한 다음 94℃에서 10 분간 변성시켰다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)은 역전사반응액 5 ㎕에 12.5 pmole 업스트림프라이머(upstream primer), 1.25 U Taq DNA polymerase, 10배 중합효소연쇄반응 완충액(100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, pH 8.3) 2 ㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 25 ㎕로 만들었다. 이 반응액을 95℃ 45 초, 55℃ 60 초, 72℃ 60 초로 40회 증폭시켰으며 마지막에는 72℃에서 7 분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 0.5X TBE 완충액과 1.5 % 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 염색하여 확인하였다.
RpRSV 감염 식물체와의 RT-PCR 검정에서 반응강도가 뛰어나고 진단에 장해가 되는 비특이적 반응을 보이지 않는 34가지 프라이머 조합 (조합 1, 10, 19, 20, 22, 29, 30, 33, 52, 53, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 88, 93, 98, 99, 100, 109, 110, 111, 120, 121, 122, 123, 131, 132, 134, 145, 146, 148)을 선발하였다(도 2).
위에서 선발된 프라이머 조합 중에서 조합 33, 52, 53, 84, 134 조합은 분류학적으로 유사한 바이러스인 코모비리데 7가지 바이러스와의 비특이적 반응 분석을 통하여 3가지(조합 52, 53, 84) 프라이머 조합을 선발하였다(도 3). 비특이적 반응 분석에는 Comoviridae에 속하는 Broad bean wilt virus 2 (BBWV2), Tomato ringspot virus (ToRSV), Tomato black ring virus (TBSV), Arabis mosaic virus (ArMV), Cherry leaf roll virus (CLRV), Tomato black ring virus (TBSV), Grapevine fanleaf virus (GFLV)를 이용하였다.
분류학적 유사바이러스와의 분석에서 선발된 3가지 조합은 RpRSV 기주와 관련된 18가지 바이러스와의 RT-PCR 분석 결과 3가지(조합 52, 53, 84) 프라이머 조합을 최종적으로 선발하였다(도 4). 기주 관련 바이러스와의 비특이적 반응 분석에 이용된 18가지 바이러스는 다음과 같다: Alfalfa mosaic virus (AMV), Arabis mosaic virus (ArMV), Southern bean mosaic virus (SBMV), Bean yellow mosaic virus (BYMV), Cowpea chlorotic mottle virus (CCMV), Cowpea mild mottle virus (CPMMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Cymbidium ringspot virus (CymRSV), Lettuce mosaic virus (LMV), Pepper veinal mottle virus (PVMV), Prune dwarf virus (PDV), Ribgrass mosaic virus (RMV), Tobacco mosaic virus (TMV), Tobacco necrosis virus (TNV), Tobacco streak virus (TSV), Tomato mosaic virus (ToMV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Turnip mosaic virus (TuMV).
이러한 결과들을 바탕으로 하여 종자 또는 식물체로부터 RpRSV를 진단할 경우, 우선적으로 최적 진단용 프라이머로 선발된 프라이머 조합 52, 53, 84을 이용하여 RT-PCR를 수행한다. 이 진단 결과가 미흡할 경우 RpRSV 진단용 프라이머 은행의 다른 프라이머의 조합을 이용하여 검증이 가능할 것이다.
실시예 3: RpRSV의 진단 및 검증의 예
검사현장에서 RpRSV 진단용 최적 프라이머로 조합 52, 조합 53, 조합 84를 이용하여 1차적인 진단을 실시한다. 1차 RT-PCR 검사 결과의 검정이 필요할 경우, 즉 RT-PCR 산물이 RpRSV로부터 유래된 결과인지 확인하기 위하여 이 프라이머 조합에 대한 검정용 프라이머(nested primer)를 이용하여 PCR 검사를 실시한다. 이때 RT-PCR 반응 결과가 RpRSV 유래에서 비롯되었다면 검정용 PCR에서 양성반응을 나타낸다 (도 5). 부가적으로 이러한 본 발명의 RpRSV 프라이머 은행으로부터 유래된 PCR 산물을 쉽게 확인할 수 있도록 프라이머가 설계된 전체 영역을 포함하는 양성 대조구를 제조하였다. 이 양성대조구는 PCR 검사시 양성대조구로 이용가능하며(도 6), 또한 확인이 필요한 PCR 산물의 염기서열을 쉽게 비교할 수 있도록 양성대조구 플라스미드의 삽입된 영역의 염기서열을 결정하여 제공하였다(도 7).
본 발명의 진단법을 실시할 경우 레스베리, 딸기, 포도, 체리 등의 식물체로부터 RpRSV 감염여부를 정밀하게 진단할 수 있다. 또한 식물 바이러스에 대한 RT-PCR 진단키트의 산업화가 가능하다. 본 발명을 실시함으로써 국내 RpRSV의 피해를 최소화할 수 있을 것이며, 국경 검역현장에서 손쉽게 활용할 수 있어 외국으로부터 RpRSV에 감염된 식물체 및 종자의 유입을 효과적으로 차단할 수 있을 것이다.
도 1은 RpRSV 프라이머 위치를 나타낸다. 위치는 Genbank accession no. AY303788을 기준으로 작성되었다.
도 2는 149 가지 프라이머 조합의 RpRSV와의 특이성을 검정한 것이다. RT-PCR 주형으로 RpRSV에 감염된 명아주 잎 조직으로부터 추출된 전체 RNA를 사용하였으며, 1~149 프라이머 조합은 표 4를 참조한다.
도 3은 선발된 RpRSV 진단용 프라이머 조합과 Tobamovirus 바이러스의 RT-PCR 분석 결과이다. 1:RpRSV, 2:BBWV2, 3:TRSV, 4:ToRSV, 5:ArMV, 6:CLRV, 7:GFLV, 8:TBSV.
도 4는 선발된 RpRSV 진단용 프라이머 조합과 기주 관련 바이러스의 RT-PCR 분석 결과이다. 1:RpRSV, 2:AMV, 3:ArMV, 4:SBMV, 5:BYMV, 6:CCMV, 7:CPMMV, 8:CMV, 9:CymRSV, 10:LMV, 11:PVMV, 12:PDV, 13:RMV, 14:TMV, 15:TNV, 16:TSV, 17:ToMV, 18:TSWV, 19:TuMV.
도 5는 RpRSV 진단용 최적 프라이머 조합 및 검정용 프라이머 조합의 (RT)PCR 분석 결과이다.
M : size marker
1 : 최적 진단용 프라이머 조합 52 (673bp)
2 : 조합 52에 대한 검정용 프라이머 조합 (RpRS-C18/N39) (322bp)
3 : 조합 52에 대한 검정용 프라이머 조합 (RpRS-C18/N40) (303bp)
4 : 조합 52에 대한 검정용 프라이머 조합 (RpRS-C19/N39) (208bp)
5 : 최적 진단용 프라이머 조합 53 (702bp)
6 : 조합 53에 대한 검정용 프라이머 조합 (RpRS-C18/N39) (322bp)
7 : 조합 53에 대한 검정용 프라이머 조합 (RpRS-C20/N37) (353bp)
8 : 조합 53에 대한 검정용 프라이머 조합 (RpRS-C30/N37) (253bp)
9 : 최적 진단용 프라이머 조합 84 (645bp)
10 : 조합 84에 대한 검정용 프라이머 조합 (RpRS-C20/N37) (353bp)
11 : 조합 84에 대한 검정용 프라이머 조합 (RpRS-C32/N37) (251bp)
12 : 조합 84에 대한 검정용 프라이머 조합 (RpRS-C32/N35) (280bp)
도 6은 RpRSV 양성대조구로부터 유래한 진단용 프라이머 조합의 PCR 산물이다.
M : size marker
1 : 양성대조구에 삽입된 RpRSV DNA 단편(1,768bp)
2 : 진단용 프라이머 조합 52 (673bp)
3 : 진단용 프라이머 조합 53 (702bp)
4 : 진단용 프라이머 조합 84 (645bp)
도 7은 양성대조구에 삽입된 RpRSV 염기서열(1,768bp)을 나타낸다.
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tctgattccc gcttgtatga tgac 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N30 primer <400> 8 ttcccgcttg tatgatgact gacca 25 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N31 primer <400> 9 gggtgatagg caagccgaca agga 24 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N33 primer <400> 10 cgacaaggaa gagcggcagg att 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N35 primer <400> 11 ggccaatgat cccaataaag tt 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N37 primer <400> 12 caaagagtgc gctgttccat a 21 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N38 primer <400> 13 caacttacca cgcatgtccg agaat 25 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N39 primer <400> 14 gctgaggctg ggtggaataa tg 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N40 primer <400> 15 atgcggatat ttgtggcgtg gat 23 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N42 primer <400> 16 ctgaatcttc cgctgctgag tt 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N45 primer <400> 17 tgaagcagac cgcatttgag c 21 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N47 primer <400> 18 ttgtgttgcg tcccagggta tcgtg 25 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N50 primer <400> 19 gtatgctgca gacctgggag aag 23 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N52 primer <400> 20 tcgccgtctg atttatggag 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N55 primer <400> 21 agtaggccct ctgtggatgg 20 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-N58 primer <400> 22 taatgtgcct ggttgtgcct atgag 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C08 primer <400> 23 caacaagtgc aatggatcta cctca 25 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C09 primer <400> 24 taggcacaac caggcacatt atc 23 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C10 primer <400> 25 ggccgcacaa cctccccaga tt 22 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C12 primer <400> 26 ggggaacagg aggcaagacc a 21 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C14 primer <400> 27 atcctccctt gaaagaatat gcacc 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C15 primer <400> 28 ggtgcatatt ctttcaaggg aggat 25 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C17 primer <400> 29 tctttgctca gggattcttg gtc 23 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C18 primer <400> 30 gcgaagaaaa gctcaacata g 21 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C19 primer <400> 31 aaaggtaaac tcagcagcgg aagat 25 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C20 primer <400> 32 gggcatatca gaacacgcac catc 24 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C30 primer <400> 33 tccgcattat tccacccagc ctcac 25 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C32 primer <400> 34 cgcattattc cacccagcct cagc 24 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C42 primer <400> 35 aaggcggact gtatatttct caa 23 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C50 primer <400> 36 ataatcctgc cgctcttcct tgtcg 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C52 primer <400> 37 ggtagtctga ttcccgcttg tatga 25 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C55 primer <400> 38 gtttagggac gccaagcaag g 21 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C57 primer <400> 39 taatacgacc actctcccac tcagg 25 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C59 primer <400> 40 cagctcctct tggttgatgc 20 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C60 primer <400> 41 caggcgcatc ataatacata caatc 25 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RpRS-C62 primer <400> 42 gatgttctcc ttattggcta cc 22 <210> 43 <211> 1768 <212> DNA <213> Raspberry ringspot virus <400> 43 gagaattccc cgaggctgtt attaacacct ttcagcgcct gcaaatagcg ctgattggtg 60 acattaagag atgtcccctc tcttcccccc tcttccccga gctttccaag ctcgatgccc 120 actcccagca tcatctgctg gcttccttcg aacttccaaa gttcggagga gttactccta 180 gcgtcatgga acagctccat gatgcggagt ccgaattggc tgaggccaag gcaagactcc 240 ttcgcgaacg gctacacgcg gtagccaaca aagaaaacat cccctatctt ggggattgta 300 tgttctatga tgcacctggc atcagtcagg aggagctgct tcaggcagct tttcttgaag 360 ctcccacacc tgagtgggaa agtgaacgaa ttaggccttt gtggcctaag gacgaatggt 420 ttagggacgc ccaacaaggt ccctaccctg aggattatgg tagtattccc ctgggtgata 480 tagacacact gtgtctggct tttgatgctc ttgtggagga acattggatg cctatctacc 540 tgatgatatc cacgtttgcc acgtttcagc agtatggtac tcacccacta ttgctggaat 600 gtgtgcaatc tgcaggtagt ctgattcctg cgtgcatgat gactgaccat cacctacaac 660 caacgggtga taggcaggcc gacaaggaag agcggcagga ttatgcggac agccaggact 720 ctattcagag catgggtgat ttctggaagg aattctattc aaaggattct ggaaagaaaa 780 tccctgactc ccacaagtca aggctggcta atgatcccaa caaagttggt tttacgaaga 840 gtgcgctttt ccataagcag cccctggcgc attcattagc tcaaacttgg gctaacttta 900 ggggtaccca ggataaggcg gacctggtca aagtgaccat ggacatgaat attgagaaat 960 atactgtccg tcttcccgat gcagttcgta ctacggcagg accactatac attgagtgga 1020 ttaatctgcc acgaatgtct gaaaattctg cacgtaaact agcagaagct gggtggaaca 1080 atgcagatat ttgtggggtg gatcttgcca tgaagtcgca tgttgcagtt ggcacgccag 1140 tccgtgttat catctctttg gtagatggtg catgctctga tatgcccacg gcaacgatgt 1200 gcgcttttga ggtgaacttg gcaacacaga acaaccggtc actaaatctt ccgctgctta 1260 gtttaccctt ctcacaactg ctcgccgatt tgcatgattt ccaacatcgt gtcaagatcg 1320 cttgccaatt tcgggacccg gaaggattca atgtgggtac tcccatgttg agtttttcct 1380 cgctcgaatt ttctgagctg aagcaaaccg ctttcgagcg gaaatcttta ctcagagatt 1440 cctggtctga aatagaaaag cgtgcttgcc atggtggagg acgttgtatc gcctcccagg 1500 gtattgtgca gacctgggag aaggagatta atcctccttt aaaagaatat gcacccttgg 1560 ttttacctcc cgttccccag cccagaagga actttattgg ccaacaatct ggggaggttg 1620 tcaaaccatg gcttccaaag tcccgctcca tgcgatttaa atcgcccact gatttatgga 1680 gcaggccctc tgtagatggg ggttcaacat ctaccgtggt tacaggaact gaacacttgc 1740 gttgcgataa tgtgcctggt tgtgccta 1768

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 서열번호 12 및 28의 프라이머 조합; 서열번호 11 및 28의 프라이머 조합; 및 서열번호 8 및 31의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 RpRSV 종 특이적 진단용 프라이머 조합.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 12 및 28의 프라이머 조합; 서열번호 11 및 28의 프라이머 조합; 및 서열번호 8 및 31의 프라이머 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 RpRSV 종 특이적 진단용 프라이머 조합.
  4. 제2항에 있어서, 서열번호 14 및 30의 프라이머 조합; 서열번호 15 및 30의 프라이머 조합; 서열번호 14 및 31의 프라이머 조합; 서열번호 12 및 32의 프라이머 조합; 서열번호 12 및 33의 프라이머 조합; 서열번호 12 및 34의 프라이머 조합; 및 서열번호 11 및 34의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 RpRSV 종 특이적 진단용 프라이머 조합.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 조합; 및 서열번호 43의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 포함하는, RpRSV 종 특이적 진단용 키트.
  6. 식물 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 조합을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, RpRSV를 종 특이적으로 진단하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물은 레스베리, 딸기, 포도 또는 체리인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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