KR100994420B1 - 마늘 바이러스 다중 진단용 특이 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

마늘 바이러스 다중 진단용 특이 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 13으로 표시된 프라이머 중에서 선택된 프라이머 세트를 포함하는 GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 진단법은 지금까지 사용된 진단 방법에서 불가능하던 마늘에 발생하는 모든 바이러스(13종)을 가장 경제적이고 간편한 방법으로 진단하며, 동시에 최고의 검출한계를 가지고 있다. 이 진단법은 마늘 바이러스 무병주 생산에 사용될 수 있다.
마늘, 바이러스, 진단법, 다중진단, multiplex RT-PCR, GLV, LYSV, GCLV, OYDV, Allexivirus

Description

마늘 바이러스 다중 진단용 특이 프라이머 및 이의 용도{Specific primers for multiple detection of the viruses in garlic, and uses thereof}
본 발명은 마늘에 발생하는 바이러스 13종을 진단할 수 있는 종(species) 및 속(genus) 특이 프라이머에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마늘잠재바이러스(Garlic latent virus, GLV), 리크황화줄무늬바이러스(Leek yellow stripe virus, LYSV), 마늘일반잠재바이러스(Garlic common latent virus, GCLV), 양파황화위축바이러스(Onion yellow dwarf virus, OYDV), 알렉시바이러스(Allexivirus) 9종(Garlic virus X, Garlic virus A, Garlic virus B, Garlic virus C, Garlic virus D, Garlic virus E, Shallot virus X, Garlic mite-borne mosaic virus, Garlic mite-borne filamentous virus)을 종(specie) 또는 속(genus) 특이적으로 진단할 수 있는 프라이머와 이들의 조합으로 이루어진 동시 진단용 프라이머 세트에 관한 것이다.
마늘 바이러스의 진단법으로는 과거 전자현미경과 혈청학적 방법(ELISA)이 주로 이용되었다. 그러나 마늘에 존재하는 사상형 바이러스는 형태적으로 구분이 어려운 많은 종이 존재하기 때문에 전자현미경 방법으로는 종의 진단은 불가능하였 다.
한편, 혈청학적 방법은 마늘 바이러스의 진단에 유용하게 사용되어 왔으나, 마늘은 자연상태에서 많은 바이러스에 복합 감염되어 있어 하나 또는 몇 가지의 항혈청으로는 마늘 바이러스를 정확히 진단하기 어렵다. 또한 바이러스 항혈청 제작은 순수분리된 마늘 바이러스와 바이러스에 감염되지 않은 마늘의 확보가 매우 어려운 문제점이 있다. 그리고 마늘에 발생하는 일부 바이러스는 분류학적으로 유사성으로 인한 비특이적 반응이 존재하여 혈청학적 방법으로 종을 구분하기 힘들며, 검출한계 또한 분자생물학적 방법에 비해 1000배 가량 떨어진다.
분자생물학적 진단법 중에서 가장 일반적으로 사용되고 있는 RT-PCR 방법은 종 특이적 프라이머의 사용이 가장 중요하다. 그러나 논문에 발표된 상당수의 프라이머들은 특정 유전자의 클로링용으로 제작되었거나 개별 바이러스에 대한 단편적인 진단이 가능한 프라이머이기 때문에 마늘 바이러스 전체의 다중진단에 사용하기는 어렵다. 바이러스의 종 및 속 특이적 진단을 위해서는 종 또는 속 내 존재하는 많은 변이주들을 모두 검출할 수 있어야 한다. 일반적으로 이질성 프라이머(degenerated primer)을 이용하여 이러한 문제점을 해결하고 있으나 알렉시바이러스(Allexivirus) 속과 같은 경우 변이의 폭이 매우 크기 때문에 한 종유의 이질성 프라이머로는 모든 변이종을 진단하기 불가능하다. 또한 마늘 바이러스 전체를 동시에 다중 진단할 수 있는 프라이머의 조합은 개발된 바 없다 (Tsuneyoshi et al., 1998. Arch Virol 143: 1093-1107; Chen et al., 2001. Arch Virol 146: 1841-1853; Chen et al. 2004. Arch Virol 149:435-445).
한국특허등록 제10-0578000호에는 마늘의 양파 황색 위축 바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 양파 황색 위축 바이러스 진단방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 프라이머 세트와는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 자연상태의 대부분의 마늘은 형태적으로 구분하기 어려운 사상형 바이러스들에 복합감염되어 있기 때문에 전자현미경과 혈청학적 방법으로는 감염된 모든 바이러스를 진단하기는 불가능하다. 또한, 마늘에 발생하는 바이러스는 분류학적으로 많은 이명이 존재하기 때문에 분자생물학적 방법에 의한 명확한 종의 구분이 이루어져야 정확히 진단할 수 있다. 한편, 종 또는 속내 분리주(isolate) 사이에는 상당한 변이가 존재하기 때문에 이러한 변이를 극복할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 13으로 표시된 프라이머 중에서 선택된 프라이머 세트를 포함하는 GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 종 및 속 특이적으로 개발된 프라이머 조합은 지금까지 알려진 모든 마늘 바이러스(마늘잠재바이러스, 리크황화줄무늬바이러스, 마늘일반 잠재바이러스, 양파황화위축바이러스, 알렉시바이러스)를 검출할 수 있으며, 두 조합의 RT-PCR 반응으로 바이러스 각각에 대한 진단뿐만 아니라 모든 조합의 복합감염의 경우도 특이적으로 진단이 가능하다. 여기서 발명된 다중진단법의 사용은 진단에 따른 비용과 노동력을 60% 줄일 수 있으며, 아울러 Allium 작물에서 새로운 바이러스병의 신속한 검출도 용이하다. 아울러 진단용 특이 프라이머를 이용한 RT-PCR 진단은 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상 검출한계를 가지고 있으며, 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 마늘 무병주 생산을 통한 차별화된 품질의 마늘 생산으로 새로운 마늘 시장을 개척할 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 13으로 표시된 프라이머 중에서 선택된 프라이머 세트를 포함하는 GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트로 이루어진 GLV(마늘잠재바이러스), LYSV(리크황화줄무늬바이러스) 및 GCLV(마늘일반잠재바이러스)를 동시 진단하기 위한 프라이머 조합 1; 및
서열번호 7 및 서열번호 8과 9의 프라이머 세트, 및 서열번호 10 및 11의 프라이머 세트; 또는 서열번호 7 및 서열번호 8과 9의 프라이머 세트, 및 서열번호 12 및 13의 프라이머 세트로 이루어진 OYDV(양파황화위축바이러스) 및 알렉시바이 러스를 동시 진단하기 위한 프라이머 조합 2; 를 포함할 수 있다.
본 발명의 GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트로 이루어진 GLV(마늘잠재바이러스), LYSV(리크황화줄무늬바이러스) 및 GCLV(마늘일반잠재바이러스)를 동시 진단하기 위한 프라이머 조합 1; 및
서열번호 7 및 서열번호 8과 9의 프라이머 세트, 서열번호 10 및 11의 프라이머 세트 및 서열번호 12 및 13의 프라이머 세트로 이루어진 OYDV(양파황화위축바이러스) 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 프라이머 조합 2; 를 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 진단할 수 있는 알렉시바이러스는 Garlic virus X(GVX), Garlic virus A(GVA), Garlic virus B(GVB), Garlic virus C(GVC), Garlic virus D(GVD), Garlic virus E(GVE), Shallot virus X(SHX), Garlic mite-borne mosaic virus(GMbMV) 및 Garlic mite-borne filamentous virus(GMbFV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 프라이머 세트는 상기 9개 바이러스를 동시에 진단할 수 있다.
본 발명의 GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 프라이머 세트는 크게 조합 1 및 조합 2의 프라이머 세트로 이루어지며, 조합 1의 프라이머 세트는 GLV(마늘잠재바이러스), LYSV(리크황화줄무늬바이러스) 및 GCLV(마늘일반잠재바이러스)를 동시 진단하기 위한 프라이머 조합이며, 조합 2의 프라이머 세트는 OYDV(양파황화위축바이러스) 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 프라이머 조합이다.
조합 1의 프라이머 세트에는 GLV(마늘잠재바이러스)를 진단하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; LYSV(리크황화줄무늬바이러스)를 진단하기 위한 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 및 GCLV(마늘일반잠재바이러스)를 진단하기 위한 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 프라이머 세트를 포함하는 GLV(마늘잠재바이러스), LYSV(리크황화줄무늬바이러스) 및 GCLV(마늘일반잠재바이러스)로 이루어진 군에서 선택되는 2 이상의 바이러스를 동시 진단하기 위한 프라이머 조합도 포함될 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트를 포함하는 GLV(마늘잠재바이러스) 및 LYSV(리크황화줄무늬바이러스)를 동시 진단하기 위한 프라이머 조합도 포함될 수 있는 것이다. 그러나, 조합 1의 프라이머 세트는 GLV(마늘잠재바이러스), LYSV(리크황화줄무늬바이러스) 및 GCLV(마늘일반잠재바이러스)를 동시 진단하기 위해 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트로 이루어진 것이 바람직하다.
조합 2의 프라이머 세트는 크게 2종류로 이루어지는데, 첫째는 알렉시바이러스를 진단하기 위한 서열번호 7 및 서열번호 8과 9의 프라이머 세트, 및 OYDV(양파황화위축바이러스)를 진단하기 위한 서열번호 10 및 11의 프라이머 세트로 이루어지며, 둘째는 알렉시바이러스를 진단하기 위한 서열번호 7 및 서열번호 8과 9의 프라이머 세트, 및 OYDV(양파황화위축바이러스)를 진단하기 위한 서열번호 12 및 13 의 프라이머 세트로 이루어진다. 조합 2의 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 7 및 서열번호 8과 9의 프라이머 세트, 서열번호 10 및 11의 프라이머 세트 및 서열번호 12 및 13의 프라이머 세트로 이루어질 수 있다. 3개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 OYDV(양파황화위축바이러스) 및 알렉시바이러스를 더욱 정확하게 진단할 수 있다.
본 발명의 서열번호 7 및 서열번호 8과 9의 프라이머 세트에서, 정방향 프라이머는 서열번호 7의 프라이머이며, 역방향 프라이머는 서열번호 8과 9의 프라이머 혼합물이다. 알렉시바이러스를 진단하기 위해서는 역방향 프라이머로서 서열번호 8 또는 서열번호 9의 프라이머를 각각 이용하는 것보다는 서열번호 8과 9의 프라이머 혼합물을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 서열번호 13의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머 (25개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 2의 프라이머(25개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서는 마늘에 발생하는 바이러스들에 대한 모든 유전정보를 수집하여 외피단백질 유전자의 염기서열을 이용하여 분류체계를 확립하였다. 이 분류체계를 기초로 국내 마늘에 발생하고 있는 바이러스 4종(GCLV, LYSV, OYDV, SLV) 및 1속(9종: GarV-A, GarV-B, GarV-C, GarV-D, GarV-E, GarMbMV, GarMbFV, ShV-X, GarV-X)에 대하여 종 및 속 특이적 진단용 프라이머를 각각 개발하였다. 또한 개발된 프라이머들은 마늘에 발생하는 바이러스의 효과적인 진단을 위하여 2가지 종류의 다중 진단용 프라이머 조합으로 개발하였다. 한편 종 또는 속내의 변이를 극복하기 위하여 종 특이적 염기서열을 탐색하고, 이질성 프라이머(degenerated primer)를 혼합하는 기법을 사용하였다.
마늘에 발생하는 식물 바이러스에 대한 많은 연구가 수행되었으나 이들 바이러스들의 분류학적 체계가 정립되어 있지 않아서 바이러스를 진단하는데 어려움이 있다. 이를 위해서 이들의 외피단백질 염기서열 분석을 통해 계통분석(도 1)하여, 마늘에 발생하는 주요 바이러스의 분류체계를 확립하고, 이들 바이러스의 진단체계를 확립하고자 하였다. 알렉시바이러스 속의 경우 아직까지 종에 대한 분류학적 체계가 명확하지 않기 때문에 알렉시바이러스 속을 한번에 진단할 수 있는 속 특이적 프라이머를 설계하였다. 그 방법으로는 보고된 모든 알렉시바이러스 속 분리주들의 염기서열을 분류하여 두개의 분류군으로 나누어, 같은 위치에서 두 분류군에 대한 이질성 프라이머를 선발하여 혼합함으로서 기존에 보고된 속 특이적 프라이머보다도 더욱 정밀한 진단이 가능하도록 하였다.
바이러스 종(species) 내에는 약간씩 다른 염기서열을 가지고 있는 계통 또는 분리주들이 존재한다. 그리하여 분리주 특이적인 프라이머를 진단에 사용할 경우는 진단에 실패할 위험이 있다. 다시 말해서 바이러스 진단용 프라이머는 바이러스 각각에 대하여 종 특이적으로 작동하여야 한다. 본 발명에서의 프라이머는 종, 속 특이적으로 작동하도록 설계하였다. 즉, GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스 종, 속 내에서 지금까지 알려진 염기서열을 수집하여 종의 모든 계통과 분리주가 가지고 있는 공통 염기서열을 탐색하였다. 그리고 이 공통 염기서열 중에서 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열을 프라이머 설계 대상에서 제외시킴으로써 종 특이적 서열을 선발하였다. 이러한 종 특이적 염기서열로부터 프라이머로 최적의 조건을 가지는 서열을 종 특이적 프라이머로 설계하였다. 설계한 프라이머들은 조합별로 실제적인 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 민감도가 우수한 조합을 최종 선발하였다.
국내 재배되고 있는 마늘에는 4종, 1속의 바이러스(GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 Allexivirus)가 대부분의 병을 일으키고 있다. 이들 바이러스의 효과적인 진단을 위하여 다중 진단 조합 1(3종; GLV, LYSV, GCLV)과 조합 2(OYDV, Allexivirus)를 개발하였다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시 작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 세트; 및 RT-PCR 에 필요한 시약을 포함하는, GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 RT-PCR 에 필요한 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 역전사효소, 리보뉴클레아제 저해제, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등일 수 있으며, 반응 완충액은 역전사 완충액 및 PCR 완충액 양자를 모두 포함하며, 내열성 중합효소는 EF Taq 중합효소 등을 이용할 수 있으며, 역전사효소는 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사효소 (Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
마늘 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하는 방법을 제공한다.
마늘 시료에서 전체 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 서열의 증폭은 조합 1과 조합 2를 별도의 튜브에서 RT-PCR을 수행하는 것이 바람직하다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발 하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 마늘 발생 4종, 1속 바이러스 동시 진단법 개발
마늘에 발생하는 바이러스병의 대부분을 차지하는 GLV(SLV), LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스에 대한 동시 진단법을 개발하기 위하여 개별 바이러스에 대한 종, 속 특이적 프라이머를 조합하여 동시 진단용 프라이머 조합을 설계하였다. GLV(SLV), LYSV, GCLV, OYDV, 및 알렉시바이러스는 선발한 종 특이적 프라이머를 이용하였다(표 1, 2, 3, 4, 5).
표 1. 1차 선발된 GLV(SLV) 종 특이적 프라이머 조합
조합 정방향 프라이머 역방향 프라이머 산물 크기(bp)
2 GL-N10 GL-C30 559
3 GL-N10 GL-C20 703
6 GL-N20 GL-C40 417
12 GL-N25 GL-C10 244
15 GL-N30 GL-C10 203
표 2. 1차 선발된 LYSV 종 특이적 프라이머 조합
조합 정방향 프라이머 역방향 프라이머 산물 크기 (bp)
5 LYS-N10 LYS-C15 316
7 LYS-N20 LYS-C10 247
표 3. 1차 선발된 GCLV 종 특이적 프라이머 조합
조합 정방향 프라이머 역방향 프라이머 산물 크기 (bp)
13 GCL-N30 GCL-C60 231
15 GCL-N30 GCL-C40 481
16 GCL-N30 GCL-C30 503
20 GCL-N40 GCL-C40 395
21 GCL-N40 GCL-C30 417
표 4. 1차 선발된 OYDV 종 특이적 프라이머 조합
조합 정방향 프라이머 역방향 프라이머 산물 크기 (bp)
15 OYD-N25 OYD-C08 204
16 OYD-N25 OYD-C06 602
26 OYD-N30 OYD-C06 569
31 OYD-N40 OYD-C06 468
36 OYD-N50 OYD-C06 439
47 OYD-N70 OYD-C05 518
48 OYD-N70 OYD-C04 572
표 5. 1차 선발된 알렉시바이러스 종 특이적 프라이머 조합
조합 정방향 프라이머 역방향 프라이머 산물 크기 (bp)
7 Al-N20 Al-C40 203
13 Al-N30 Al-C30 281
14 Al-N30 Al-C21 344
15 Al-N30 Al-C20-2 347
16 Al-N30 Al-C20-1 347
즉, 동시 진단용 프라이머 조합Ⅰ (조합 1에 해당함) 설계에 사용된 프라이머 쌍은 GLV(SLV) 5쌍, LYSV 2쌍, GCLV 5쌍, 그리고 동시 진단용 프라이머 조합 Ⅱ, Ⅲ (조합 Ⅱ, Ⅲ은 조합 2에 해당함) 설계에 사용된 프라이머 쌍은 OYDV 7쌍, 알렉시바이러스 5쌍이다. 이들 프라이머 쌍은 RT-PCR 산물의 크기로 조합Ⅰ(3종; GLV(SLV), LYSV 및 GCLV) 바이러스를 쉽게 구별할 수 있도록 14가지 동시 진단용 프라이머 조합을 설계하였다(표 6).
표 6. 조합Ⅰ(3종 바이러스) 진단용 프라이머 쌍으로 설계한 동시 진단용 프라이머 14가지 조합
조합 역방향 프라이머 정방향 프라이머 산물 크기(bp)
LYSV GLV GCLV LYSV GLV GCLV LYSV GLV GCLV
1 C15 C40 C60 N10 N10 N30 316 517 231
2 C15 C40 C40 N10 N10 N40 316 517 395
3 C15 C40 C60 N10 N20 N30 316 417 231
4 C15 C40 C40 N10 N20 N30 316 417 481
5 C15 C40 C30 N10 N20 N30 316 417 503
6 C15 C10 C30 N10 N20 N30 316 244 481
7 C15 C10 C30 N10 N20 N30 316 244 503
8 C15 C10 C40 N10 N20 N40 316 244 395
9 C15 C10 C40 N10 N30 N30 316 204 481
10 C15 C10 C30 N10 N30 N30 316 204 503
11 C15 C10 C40 N10 N30 N40 316 204 395
12 C10 C40 C40 N20 N10 N40 247 517 395
13 C10 C40 C40 N20 N20 N30 247 417 481
14 C10 C40 C30 N20 N20 N30 247 417 503
또한, 조합Ⅱ, Ⅲ(1종, 1속; OYDV 및 Allexivirus) 바이러스를 쉽게 구별할 수 있도록 20가지 동시 진단용 프라이머 조합을 설계하였다(표 7).
표 7. 조합Ⅱ, Ⅲ(1종, 1속 바이러스) 진단용 프라이머 쌍으로 설계한 동시 진단용 프라이머 20가지 조합
No. 역방향 프라이머 정방향 프라이머 산물 크기(bp)
Allexivirus OYDV Allexivirus OYDV Allexivirus OYDV
1 Al-C40 OYD-C06 Al-N20 OYD-N25 203 602
2 Al-C40 OYD-C06 Al-N20 OYD-N30 203 569
3 Al-C40 OYD-C04 Al-N20 OYD-N70 203 572
4 Al-C40 OYD-C03 Al-N20 OYD-N70 203 590
5 Al-C30 OYD-C06 Al-N30 OYD-N25 281 602
6 Al-C30 OYD-C06 Al-N30 OYD-N30 281 569
7 Al-C30 OYD-C04 Al-N30 OYD-N70 281 572
8 Al-C30 OYD-C03 Al-N30 OYD-N70 281 590
9 Al-C21 OYD-C06 Al-N30 OYD-N25 344 602
10 Al-C21 OYD-C06 Al-N30 OYD-N30 344 569
11 Al-C21 OYD-C04 Al-N30 OYD-N70 344 572
12 Al-C21 OYD-C03 Al-N30 OYD-N70 344 590
13 Al-C20 OYD-C06 Al-N30 OYD-N25 347 602
14 Al-C20 OYD-C06 Al-N30 OYD-N30 347 569
15 Al-C20 OYD-C04 Al-N30 OYD-N70 347 572
16 Al-C20 OYD-C03 Al-N30 OYD-N70 347 590
17 Al-C20 OYD-C06 Al-N30 OYD-N25 347 602
18 Al-C20 OYD-C06 Al-N30 OYD-N30 347 569
19 Al-C20 OYD-C04 Al-N30 OYD-N70 347 572
20 Al-C20 OYD-C03 Al-N30 OYD-N70 347 590
이들 34가지 조합은 4종, 1속 바이러스 단독감염 및 모든 복합감염 경우와 RT-PCR 선발 과정을 거쳤다 (도 2, 3, 4).
종 및 속 특이적 프라이머 선발에 사용한 마늘바이러스는 자연 감염된 마늘에서 모자이크 병징을 나타내는 잎을 채취하여 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR 주형(template)으로 사용하였다. 본 발명에서 사용한 전체 RNA 분리 및 RT-PCR 방법은 다음과 같다.
전체 RNA 분리: 전체 RNA는 페놀을 이용하여 바이러스 감염된 잎 조직 50 ㎎에서 분리하였다. 분리된 전체 RNA는 최종적으로 75% 에탄올로 3회 세척한 후 건조한 다음 증류수 50 ㎕에 녹인 다음 RT-PCR 분석에 사용하였다.
RT-PCR: 역전사(Reverse transcription) 반응은 분리한 전체 RNA 0.5 ㎕, 12.5 pmole 역방향 프라이머(reverse primer), 5배 역전사 완충액(250 mM Tris-HCl, 150 mM KCl, 40 mM MgCl2, 5 mM DTT, pH 8.5) 1 ㎕, 10 mM dNTP 0.5 ㎕, 10 U RNase 저해제, 그리고 2 U AMV 역전사효소를 첨가한 반응액 5 ㎕를 42℃에서 1 시간 항온 처리하여 실시한 다음 94℃에서 10 분간 변성시켰다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)은 역전사 반응액 5 ㎕에 12.5 pmole 정방향 프라이머(forward primer), 1.25 U Taq DNA 중합효소, 10배 중합효소연쇄반응 완충액(100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, pH 8.3) 2 ㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 25 ㎕로 만들었다. 이 반응액을 95℃ 45 초, 50℃ 60 초, 72℃ 60 초로 40회 증폭시켰으며, 마지막에는 72℃에서 7 분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 0.5X TBE 완충액과 1.5 % 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 후 에티디움 브로마 이드로 염색하여 확인하였다.
선발된 동시 진단용 프라이머 조합의 최종 확인을 위하여 도 4에서 레인 7, 10, 13의 direct sequencing을 실시하여 진단한 바이러스와 일치하는지 염기서열을 비교 확인하였다(표 8).
표 8. 발명된 동시 진단용 프라이머 조합의 정확성 확인을 위한 RT-PCR 산물의 염기서열과 기존 보고된 염기서열과의 비교
대상
바이러스 		프라이머 산물
크기
(bp) 		비교대상
상동성
조
합
Ⅰ		 GLV GL-C10 203 Z68502(GLV)
GL-N30 90%(189/208)
LYSV LYS-C15 316 AJ409307
(LYSV)
LYS-N10 95%(298/312)
GCLV GCL-C40 481 AB004804
(GCLV)
GCL-N30 96%(465/483)
조
합
Ⅱ		 Allexivirus AL-C30 281 AJ551516
(Alleixivirus)
GVX
AL-N30
92%(210/226)
OYDV OYD-C06 602 AJ292223
(OYDV)
OYD-N25 88%(491/555)
조
합
Ⅲ		 Allexivirus AL-C30 281 AJ551516
(Alleixivirus)
GVX
AL-N30
91%(252/274)
OYDV OYD-C06 569 AJ292223
(OYDV)
OYD-N30 87%(468/533)
최종적으로 3종, 1종, 1속 바이러스 단독 및 복합감염에 대하여 우수한 진단 효과를 나타내는 세 가지의 동시 진단용 프라이머 조합Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ을 개발하였다(표 9).
표 9. 최종 선발된 마늘 발생 4종, 1속 바이러스 동시 진단용 프라이머 조합
대상바이러스 산물크기
(bp) 		프라이머 염기서열
GLV 203 GL-C10 CGTTCACGCTAGACAATTCAGACAT (서열번호 1)
GL-N30 TATGGCTAACGAAGAAGAAGAACTC (서열번호 2)
LYSV 316 LYS-C15 ATCAAATTCAGGCTGCTTATACAC (서열번호 3)
LYS-N10 CGCATATGCAGTGATGTTTCGGTT (서열번호 4)
GCLV 481 GCL-C40 AGCACTCCTAGAACAACCATTA (서열번호 5)
GCL-N30 GCACCAGTGGTTTGGAATGA (서열번호 6)
Allexivirus 281 AL-C30 GGCTTATTYTGWCTAGYYTTACG (서열번호 8)
GGYTTATTKTSTTRTRATYTACG (서열번호 9)
AL-N30 CAYTCHATGAAYGCBAARATGTC (서열번호 7)
OYDV 602 OYD-C06 ACTGAAATGCGCCATTATYTGYCTA (서열번호 10)
OYD-N25 CACCNTAYATAGCRGARACAGCTCT (서열번호 11)
569 OYD-C06 ACTGAAATGCGCCATTATYTGYCTA (서열번호 12)
OYD-N30 TGTTTACCAATATTGATGCGAGTG (서열번호 13)
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 마늘바이러스의 동시진단용 프라이머 조합 I은 GLV, LYSV, 및 GCLV의 단독 또는 복합 감염을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있다는 것을 알 수 있으며, 프라이머 조합 II 및 III은 OYDV 및 알렉시바이러스의 단독 또는 복합 감염을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있다는 것을 알 수 있다. 따라서, 프라이머 조합 I 및 II 또는 프라이머 조합 I 및 III을 이용하면 GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스의 단독 또는 복합 감염을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 2: 개발된 진단법을 이용한 관행재배 마늘과 주아재배 마늘의 바이러스 발생생태 구명
관행재배 마늘과 주아재배 마늘의 바이러스 발생 생태를 구명하기 위하여 개발된 진단법을 사용하여 마늘 재배 유형별로 채집된 시료에서 감염된 바이러스를 분석하였다. 관행 재배되는 마늘에서는 100% 바이러스 감염율을 나타내었으나, 바이러스 병징이 약할수록 바이러스 감염 정도는 낮았다(표 10).
표 10. 마늘 재배 유형별 바이러스 복합감염 양상
구분 병원성 시료수 검출
시료수(%)		 검출바이러스
GLV LYSV GCLV OYDV Allexi
관행재배 3-5 8 8(100) 8(100) 8(100) 6(75) 7(88) 2(26)
1-2 9 9(100) 6(67) 6(67) 2(22) 5(56) 9(100)
주아
재배		 2년차 1 9 2(22.2) 0 1 1 1 1
3년차 1-2 6 5(83.3) 3 4 0 0 5
병징을 거의 보이지 않는 주아재배 마늘에서는 관행재배 마늘과 비교하여 상당히 낮은 바이러스 감염률을 보였으며, 재배 년차가 1년 경과할 때 바이러스 감염정도는 약 20%에서 80%로 급격히 증가하였다. 재배 유형에 따른 복합감염 분석에서 관행재배의 경우는 약 3~4종의 바이러스에 감염되어 있는 반면, 주아재배의 경우는 1년차에서 평균 약 0.7개의 바이러스에만 감염되어 있었다. 병원성과 관련하여 특히 GCLV가 큰 영향을 미치는 것으로 추측된다. 본 발명의 결과로 볼 때, 농가에서 재배되고 있는 대부분의 마늘은 바이러스병에 만연되어 있는 것으로 확인되었으며, 마늘에서 감염된 바이러스의 수 그리고 종류는 병징과 밀접한 관련이 있는 것으로 판단된다. 최고 품질의 마늘 생산을 위한 무병종구의 개발과 바이러스병 방제 대책 수립을 위하여 본 발명에서 조사된 바이러스 발생생태 자료와 개발된 동시 다중진단법은 매우 유용하게 사용될 것으로 생각된다.
실시예 3: 개발된 진단법을 이용한 국내 유전자원 마늘의 바이러스 발생 생태 규명
유전자원 마늘의 바이러스 발생 생태 규명을 위하여 개발된 진단법을 사용하여 마늘 genotype별로 채집된 시료(표 11)에서 감염된 바이러스를 분석하였다.
표 11. 마늘 유전자원 수집
Figure 112008070377433-pat00001
55개 한지형 마늘과 17개 난지형 마늘 모두 100% 감염율을 나타내었으며, 개체당 평균 2.3개의 감염 바이러스수를 나타내었다(표 12).
표 12. 마늘 유전자원의 바이러스 복합감염 양상
구분 단독(%) 복합(%) 계
2종 3종 4종 5종
한지형 12(21.8) 24(43.6) 10(18.2) 6(10.9) 3(5.5) 55
난지형 4(23.5) 8(47.1) 2(11.8) 2(11.8) 1(5.9) 17
계 16(22.2) 32(44.4) 12(16.7) 8(11.1) 4(5.6) 72
본 발명의 진단법을 실시할 경우 마늘 바이러스에 대한 RT-PCR 진단키트의 산업화가 우선적으로 가능하며, 또한 이 진단법을 이용하여 바이러스에 감염되지 않은 무병마늘을 생산할 수 있어 그 경제적, 사회적 파급효과는 매우 클 것으로 예 상된다.
도 1은 외피단백질 유전자 염기서열을 이용한 마늘에 발생하는 바이러스들의 분류학적 체계 확립을 보여준다. 붉은색으로 표시된 분리주는 국내 분리주이다.
도 2는 14가지 동시 진단용 프라이머 조합 1(조합 Ⅰ)의 RT-PCR 선발 결과를 보여준다. 레인 1 내지 14는 표 6에 기재된 프라이머 조합 1 내지 14를 각각 나타낸다.
도 3은 선발된 동시 진단용 프라이머 조합 2(조합 II 와 III)의 RT-PCR 선발 결과를 보여준다. 레인 1 내지 20은 표 7에 기재된 프라이머 조합 1 내지 20을 각각 나타낸다.
도 4는 최종 선발된 동시 진단용 프라이머 조합 I, II, III을 이용한 마늘 바이러스 RT-PCR 진단 예를 보여준다.
레인 1; GLV, 레인 2; LYSV, 레인 3; GCLV, 레인 4; GLV＋LYSV, 레인 5; GLV＋GCLV, 레인 6; LYSV＋GCLV, 레인 7; GLV＋LYSV+GCLV, 레인 8; Allexivirus, 레인 9; OYDV, 레인 10; Allexivirus＋OYDV, 레인 11; Allexivirus, 레인 12; OYDV, 레인 13; Allexivirus＋OYDV
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Specific primers for multiple detection of the viruses in garlic, and uses thereof <130> PN08151F <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GL-C10 primer <400> 1 cgttcacgct agacaattca gacat 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GL-N30 primer <400> 2 tatggctaac gaagaagaag aactc 25 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LYS-C15 primer <400> 3 atcaaattca ggctgcttat acac 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LYS-N10 primer <400> 4 cgcatatgca gtgatgtttc ggtt 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL-C40 primer <400> 5 agcactccta gaacaaccat ta 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL-N30 primer <400> 6 gcaccagtgg tttggaatga 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AL-N30 primer <400> 7 caytchatga aygcbaarat gtc 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AL-C30 primer <400> 8 ggcttattyt gwctagyytt acg 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AL-C30 primer <400> 9 ggyttattkt sttrtratyt acg 23 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OYD-C06 primer <400> 10 actgaaatgc gccattatyt gycta 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OYD-N25 primer <400> 11 caccntayat agcrgaraca gctct 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OYD-C06 primer <400> 12 actgaaatgc gccattatyt gycta 25 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OYD-N30 primer <400> 13 tgtttaccaa tattgatgcg agtg 24

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트로 이루어진 GLV(마늘잠재바이러스), LYSV(리크황화줄무늬바이러스) 및 GCLV(마늘일반잠재바이러스)를 동시 진단하기 위한 프라이머 조합 1; 및
    서열번호 7 및 서열번호 8과 9의 프라이머 세트, 및 서열번호 10 및 11의 프라이머 세트; 또는 서열번호 7 및 서열번호 8과 9의 프라이머 세트, 및 서열번호 12 및 13의 프라이머 세트로 이루어진 OYDV(양파황화위축바이러스) 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 프라이머 조합 2;
    를 포함하는 GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트로 이루어진 GLV(마늘잠재바이러스), LYSV(리크황화줄무늬바이러스) 및 GCLV(마늘일반잠재바이러스)를 동시 진단하기 위한 프라이머 조합 1; 및
    서열번호 7 및 서열번호 8과 9의 프라이머 세트, 서열번호 10 및 11의 프라이머 세트 및 서열번호 12 및 13의 프라이머 세트로 이루어진 OYDV(양파황화위축바이러스) 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 프라이머 조합 2;
    를 포함하는 GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 알렉시바이러스는 Garlic virus X, Garlic virus A, Garlic virus B, Garlic virus C, Garlic virus D, Garlic virus E, Shallot virus X, Garlic mite-borne mosaic virus 및 Garlic mite-borne filamentous virus로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트; 및 RT-PCR 에 필요한 시약을 포함하는, GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하기 위한 키트.
  5. 마늘 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 알렉시바이러스를 동시 진단하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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