KR101093237B1 - 마늘일반잠재바이러스의 진단용 특이 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

마늘일반잠재바이러스의 진단용 특이 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 4로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 GCLV 진단용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 GCLV 진단용 키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 GCLV를 종 특이적으로 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 진단법은 지금까지 사용된 진단 방법에서 불가능하던 마늘에 발생하는 GCLV를 가장 경제적이고 간편한 방법으로 진단하며, 동시에 최고의 검출한계를 가지고 있다. 이 진단법은 마늘 바이러스 무병주 생산에 사용될 수 있다.
마늘, 바이러스, 진단법, RT-PCR, GCLV

Description

마늘일반잠재바이러스의 진단용 특이 프라이머 및 이의 용도{Specific primers for detection of Garlic common latent virus, and uses thereof}
본 발명은 마늘에 발생하는 바이러스 GCLV를 진단할 수 있는 종(species) 특이 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마늘일반잠재바이러스(Garlic common latent virus, GCLV)를 종(specie) 특이적으로 진단할 수 있는 프라이머와 이들의 조합으로 이루어진 프라이머 세트에 관한 것이다.
마늘 바이러스의 진단법으로는 과거 전자현미경과 혈청학적 방법(ELISA)이 주로 이용되었다. 그러나 마늘에 존재하는 사상형 바이러스는 형태적으로 구분이 어려운 많은 종이 존재하기 때문에 전자현미경 방법으로는 종의 진단은 불가능하였다.
한편, 혈청학적 방법은 마늘 바이러스의 진단에 유용하게 사용되어 왔으나, 마늘은 자연상태에서 많은 바이러스에 복합 감염되어 있어 하나 또는 몇 가지의 항혈청으로는 마늘 바이러스를 정확히 진단하기 어렵다. 또한 바이러스 항혈청 제작은 순수분리된 마늘 바이러스와 바이러스에 감염되지 않은 마늘의 확보가 매우 어려운 문제점이 있다. 그리고 마늘에 발생하는 일부 바이러스는 분류학적으로 유사 성으로 인한 비특이적 반응이 존재하여 혈청학적 방법으로 종을 구분하기 힘들며, 검출한계 또한 분자생물학적 방법에 비해 1000배 가량 떨어진다.
분자생물학적 진단법 중에서 가장 일반적으로 사용되고 있는 RT-PCR 방법은 종 특이적 프라이머의 사용이 가장 중요하다. 그러나 논문에 발표된 상당수의 프라이머들은 분류학적 체계가 확립되지 않은 상태에서 선발된 프라이머이기 때문에 모든 마늘일반잠재바이러스 계통들의 진단에 사용하기는 어렵다 (Tsuneyoshi et al., 1998. Arch Virol 143: 1093-1107; Chen et al., 2001. Arch Virol 146: 1841-1853; Chen et al. 2004. Arch Virol 149:435-445).
한국특허등록 제10-0578000호에는 마늘의 양파 황색 위축 바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 양파 황색 위축 바이러스 진단방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 프라이머 세트와는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 자연상태의 대부분의 마늘은 형태적으로 구분하기 어려운 사상형 바이러스들에 복합감염되어 있기 때문에 전자현미경과 혈청학적 방법으로는 감염된 모든 바이러스를 진단하기는 불가능하다. 또한, 마늘에 발생하는 바이러스는 분류학적으로 많은 이명이 존재하기 때문에 분자생물학적 방법에 의한 명확한 종의 구분이 이루어져야 정확히 진단할 수 있다. 한편, 종 또는 속내 분리주(isolate) 사이에는 상당한 변이가 존재하기 때문에 이러한 변이를 극복할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 GCLV 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 GCLV 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 GCLV를 종 특이적으로 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 마늘일반잠재바이러스(GCLV) 진단용 특이 프라이머를 사용한 RT-PCR 진단은 지금까지 알려진 마늘일반잠재바이러스(GCLV) 모든 계통들과 반응할 수 있으며, 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상 검출한계를 가지고 있다. 또한, 식물바이러스 RT-PCR 진단 키트의 산업화와 마늘 무병주 생산을 통한 차별화된 품질의 마늘 생산으로 새로운 마늘 시장을 개척할 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 GCLV 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 GCLV 진단용 프라이머 세트에서, 정방향 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 4의 프라이머로 이루어진 군에서 선택되고, 역방향 프라이머는 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 다만, 본 발명의 프라이머 세트에서, 정방향 프라이머는 역방향 프라이머보다는 5'쪽에 위치해야 한다.
본 발명의 GCLV 진단용 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 1 및 3의 프라이머 세트; 및 서열번호 4 및 3의 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 GCLV 진단용 프라이머 세트는 더욱 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 1 및 3의 프라이머 세트; 및 서열번호 4 및 3의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
3개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 GCLV를 더욱 정확하게 진단할 수 있다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머 (20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 2의 프라이머(22개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서는 마늘에 발생하는 바이러스들에 대한 모든 유전정보를 수집하여 외피단백질 유전자의 염기서열을 이용하여 분류체계를 확립하였다. 이 분류체계를 기초로 국내 마늘에 발생하고 있는 마늘일반잠재바이러스 종 특이적 진단용 프라이머를 개발하였다.
마늘에 발생하는 식물 바이러스에 대한 많은 연구가 수행되었으나 이들 바이러스들의 분류학적 체계가 정립되어 있지 않아서 바이러스를 진단하는데 어려움이 있다. 이를 위해서 이들의 외피단백질 염기서열 분석을 통해 계통분석하여(도 1) 마늘에 발생하는 주요 바이러스의 분류체계를 확립하고, 이들 바이러스의 진단체계를 확립하고자 하였다.
바이러스 종(species) 내에는 약간씩 다른 염기서열을 가지고 있는 계통 또는 분리주들이 존재한다. 그리하여 분리주 특이적인 프라이머를 진단에 사용할 경 우는 진단에 실패할 위험이 있다. 다시 말해서 바이러스 진단용 프라이머는 바이러스 각각에 대하여 종 특이적으로 작동하여야 한다. 본 발명에서의 프라이머는 종 특이적으로 작동하도록 설계하였다. 즉, 종 내에서 지금까지 알려진 염기서열을 수집하여 종의 모든 계통과 분리주가 가지고 있는 공통 염기서열을 탐색하였다. 그리고, 이 공통 염기서열 중에서 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열을 프라이머 설계 대상에서 제외시킴으로써 종 특이적 서열을 선발하였다. 이러한 종 특이적 염기서열로부터 프라이머로 최적의 조건을 가지는 서열을 종 특이적 프라이머로 설계하였다. 설계한 프라이머들은 조합별로 실제적인 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 민감도가 우수한 조합을 최종 선발하였다.
국내 재배되고 있는 마늘에는 4종, 1속의 바이러스(GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 Allexivirus)가 대부분의 병을 일으키고 있다. 이들 중 마늘일반잠재바이러스(GCLV)에 대하여 종특이적 진단 프라이머를 개발하였다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클 레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 세트; 및 RT-PCR 에 필요한 시약을 포함하는, GCLV 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 RT-PCR 에 필요한 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 역전사효소, 리보뉴클레아제 저해제, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등일 수 있으며, 반응 완충액은 역전사 완충액 및 PCR 완충액 양자를 모두 포함하며, 내열성 중합효소는 EF Taq 중합효소 등을 이용할 수 있으며, 역전사효소는 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사효소 (Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
마늘 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, GCLV를 종 특이적으로 진단하는 방법을 제공한다.
마늘 시료에서 전체 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: GCLV 진단용 프라이머의 설계와 선발 및 특이성 확인
GCLV 공통 염기서열 탐색은 지금까지 알려진 7가지 GCLV 분리주의 염기서열 (표 1)을 다중 비교하여 이루어졌다.
표 1. 공통 염기서열 분석에 사용한 GCLV 분리주 염기서열
분리주명 유전자 출처 유전자 크기(bp)
K2 DQ520092 960
- AF538951 927
GHAV AB004805 1441
PCM27 AB001804 1441
GF-1 AB004566 1441
- AF228416 960
- X81138 1771
이렇게 선발된 공통 염기서열은 GCLV와 분류학적으로 유사한 카라비리데(Carlaviridae) 8종의 바이러스 염기서열 (표 2)과 비교하여 종 특이적인 서열을 탐색하였다.
표 2. 종 특이적 염기서열 탐색에 사용된 8종 카라바이러스 유전자
카라바이러스 유전자 출처 유전자 크기(bp)
Shallot latent virus AB004457 1379
Garlic latent virus Z68502 8353
Hop latent virus NC002552 8612
Potato virus M NC001361 8533
Potato virus S NC007289 8478
Blueberry scorch virus L25658 8512
Lily symptomless virus AJ516059 8394
Poplar mosaic virus X65102 8737
이러한 종 특이적 염기서열들 중에서 프라이머 조건을 충족시키는 부분에서 12가지의 GCLV 진단용 프라이머를 설계하였다 (표 3).
표 3. 설계한 GCLV 진단용 프라이머
프라이머 염기서열 길이 위치 a
GCL-N10 GCTGCGCGTTTACCCCTGAAT (서열번호 5) 21 290 - 310
GCL-N20 CGCTTTAACAAGCTCAAGAAGT (서열번호 6) 22 601 - 622
GCL-N30 GCACCAGTGGTTTGGAATGA (서열번호 1) 20 1027 - 1046
GCL-N40 TGCTGCCTTTGATACTTTCGATTA (서열번호 4) 24 1113 - 1136
GCL-N50 TTGATAGGAATAGGCGTAATGG (서열번호 7) 22 1235 - 1256
GCL-N60 ACTGACGTCGCGATTGGTATTAT (서열번호 8) 23 1400-1422
GCL-C60 GCCATTACGCCTATTCCTATC (서열번호 9) 21 1237 - 1257
GCL-C50 GGCGCTGCAATTTCCTCACCTC (서열번호 10) 22 1439 - 1460
GCL-C40 AGCACTCCTAGAACAACCATTA (서열번호 2) 22 1486 - 1507
GCL-C30 GATACTTAGCTCGTCTTTTA (서열번호 3) 20 1510 - 1529
GCL-C20 TGGCCCTGACACTCTACAATACAC (서열번호 11) 24 1668 - 1691
GCL-C10 CAATATGGCCCTGACACTCTAC (서열번호 12) 22 1675 - 1696
a 프라이머 위치는 GCLV(X81138)를 기준으로 함
설계한 프라이머의 위치는 도 2와 같다. 설계한 GCLV 프라이머들은 30가지로 조합하여 (표 4), RT-PCR을 수행하였다 (도 3).
표 4. GCLV 프라이머 조합과 RT-PCR 산물
조합 프라이머 산물 크기(bp)
1 GCL-N10 GCL-C60 968
2 GCL-N10 GCL-C50 1171
3 GCL-N10 GCL-C40 1218
4 GCL-N10 GCL-C30 1240
5 GCL-N10 GCL-C20 1401
6 GCL-N10 GCL-C10 1407
7 GCL-N20 GCL-C60 657
8 GCL-N20 GCL-C50 860
9 GCL-N20 GCL-C40 907
10 GCL-N20 GCL-C30 929
11 GCL-N20 GCL-C20 1091
12 GCL-N20 GCL-C10 1096
13 GCL-N30 GCL-C60 231
14 GCL-N30 GCL-C50 434
15 GCL-N30 GCL-C40 481
16 GCL-N30 GCL-C30 503
17 GCL-N30 GCL-C20 665
18 GCL-N30 GCL-C10 670
19 GCL-N40 GCL-C50 348
20 GCL-N40 GCL-C40 395
21 GCL-N40 GCL-C30 417
22 GCL-N40 GCL-C20 579
23 GCL-N40 GCL-C10 584
24 GCL-N50 GCL-C50 226
25 GCL-N50 GCL-C40 273
26 GCL-N50 GCL-C30 295
27 GCL-N50 GCL-C20 457
28 GCL-N50 GCL-C10 462
29 GCL-N60 GCL-C20 292
30 GCL-N60 GCL-C10 297
종 특이적 프라이머 선발에 사용한 GCLV는 자연 감염된 마늘에서 모자이크 병징을 나타내는 잎을 채취하여 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR 주형(template)으로 사용하였다. 본 발명에서 사용한 전체 RNA 분리 및 RT-PCR 방법은 다음과 같다.
전체 RNA 분리: 전체 RNA는 페놀을 이용하여 바이러스 감염된 잎 조직 50 ㎎에서 분리하였다. 분리된 전체 RNA는 최종적으로 75% 에탄올로 3회 세척한 후 건조한 다음 증류수 50 ㎕에 녹인 다음 RT-PCR 분석에 사용하였다.
RT-PCR: 역전사(Reverse transcription) 반응은 분리한 전체 RNA 0.5 ㎕, 12.5 pmole 역방향 프라이머(reverse primer), 5배 역전사 완충액(250 mM Tris- HCl, 150 mM KCl, 40 mM MgCl2, 5 mM DTT, pH 8.5) 1 ㎕, 10 mM dNTP 0.5 ㎕, 10 U RNase 저해제, 그리고 2 U AMV 역전사효소를 첨가한 반응액 5 ㎕를 42℃에서 1 시간 항온 처리하여 실시한 다음 94℃에서 10 분간 변성시켰다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)은 역전사 반응액 5 ㎕에 12.5 pmole 정방향 프라이머(forward primer), 1.25 U Taq DNA 중합효소, 10배 중합효소연쇄반응 완충액(100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, pH 8.3) 2 ㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 25 ㎕로 만들었다. 이 반응액을 95℃ 45 초, 55℃ 60 초, 72℃ 60 초로 40회 증폭시켰으며, 마지막에는 72℃에서 7 분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 0.5X TBE 완충액과 1.5 % 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 염색하여 확인하였다.
1차 선발된 프라이머 쌍을 다른 카라바이러스(Carlavirus)와 마늘에 발생하는 바이러스들과의 RT-PCR을 수행하여 (도 4), 최종적으로 4가지 진단용 프라이머와 이를 이용한 3가지 프라이머 쌍을 선발하였다 (표 5).
표 5. 최종 선발된 GCLV 종 특이적 프라이머 조합
조합 정방향 프라이머 역방향 프라이머 산물 크기 (bp)
15 GCL-N30 GCL-C40 481
16 GCL-N30 GCL-C30 503
21 GCL-N40 GCL-C30 417
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 3종의 프라이머 세트는 GCLV를 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 진단법을 실시할 경우, 마늘 바이러스에 대한 RT-PCR 진단 키트의 산업화가 우선적으로 가능하며, 또한 이 진단법을 이용하여 바이러스에 감염되지 않은 무병마늘을 생산할 수 있어 그 경제적·사회적 파급효과는 매우 클 것으로 예상된다.
도 1은 외피단백질 유전자 염기서열을 이용한 마늘에 발생하는 바이러스들의 분류학적 체계 확립을 보여준다. 붉은색으로 표시된 분리주는 국내 분리주이다.
도 2는 설계한 GCLV 프라이머 위치를 보여준다.
도 3은 GCLV와 조합한 30가지 프라이머 쌍의 RT-PCR 결과를 보여준다. 레인 1 내지 30은 표 4에 기재된 GCLV 프라이머 조합 1 내지 30을 각각 나타낸다.
도 4는 최종 선발된 마늘일반잠재바이러스(GCLV) 프라이머 조합의 다른 카라바이러스(Carlavirus), 마늘 발생 바이러스와의 RT-PCR 결과를 보여준다.
A : GLV (Garlic latent virus, 마늘잠재바이러스)
B : LYSV (Leek yellow stripe virus, 리크황화줄무늬바이러스)
C : OYDV (Onion yellow dwarf virus, 양파황화위축바이러스)
D : Allexivurs (알렉시바이러스)
PepMOV (Pepper mottle virus, 고추모틀바이러스)
TBRV (Tomato black ring virus, 토마토흑색윤점바이러스)
PVY (Potato virus Y, 포테이토바이러스Y)
CPMMV (Cowpea mild mottle virus, 동부마일드모틀바이러스)
PopMV (Poplar mosaic virus, 포플러모자이크바이러스)
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Specific primers for detection of Garlic common latent virus, and uses thereof <130> PN08151C <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL-N30 primer <400> 1 gcaccagtgg tttggaatga 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL-C40 primer <400> 2 agcactccta gaacaaccat ta 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL-C30 primer <400> 3 gatacttagc tcgtctttta 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL-N40 primer <400> 4 tgctgccttt gatactttcg atta 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL-N10 primer <400> 5 gctgcgcgtt tacccctgaa t 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL-N20 primer <400> 6 cgctttaaca agctcaagaa gt 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL-N50 primer <400> 7 ttgataggaa taggcgtaat gg 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL-N60 primer <400> 8 actgacgtcg cgattggtat tat 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL-C60 primer <400> 9 gccattacgc ctattcctat c 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL-C50 primer <400> 10 ggcgctgcaa tttcctcacc tc 22 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL-C20 primer <400> 11 tggccctgac actctacaat acac 24 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCL-C10 primer <400> 12 caatatggcc ctgacactct ac 22

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 및 서열번호 4 및 3의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 GCLV(Garlic common latent virus) 종 특이적 진단용 프라이머 세트.
  4. 제3항에 따른 프라이머 세트; 및 RT-PCR 에 필요한 시약을 포함하는, GCLV(Garlic common latent virus) 종 특이적 진단용 키트.
  5. 마늘 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 제3항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, GCLV(Garlic common latent virus)를 종 특이적으로 진단하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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