KR20100082964A - 체리잎말림바이러스 진단용 프라이머 조합 및 이의 용도 - Google Patents

체리잎말림바이러스 진단용 프라이머 조합 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 22로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 조합을 포함하는 CLRV 진단용 프라이머 조합, 상기 프라이머 조합을 포함하는 CLRV 진단용 키트, 및 상기 프라이머 조합을 이용하여 CLRV를 종 특이적으로 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 피시알 검사 시스템은 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 검역현장 및 임상진단에서 식물체로부터 CLRV의 검사에 이용할 수 있을 것이다.
진단법, 체리잎말림바이러스, RT-PCR, 목본식물, Nested PCR, 양성대조구, 진단시스템, 식물검역

Description

체리잎말림바이러스 진단용 프라이머 조합 및 이의 용도{Primer combination for diagnosing Cherry leaf roll virus and uses thereof}
본 발명은 체리 등의 목본식물에 큰 피해를 주고 있는 체리잎말림바이러스(Cherry leaf roll virus, CLRV)를 진단하기 위한 피시알(PCR) 검사시스템에 관한 것이다. 피시알 검사시스템은 CLRV 진단용 최적 프라이머쌍 및 이에 부합하는 검정용 프라이머쌍(nested primer)과 이를 뒷받침할 수 있는 종 특이 프라이머 은행 및 양성대조구를 포함하고 있다.
바이러스 진단법으로 과거에는 전자현미경과 혈청학적 방법(ELISA)을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태적 특징으로 종을 진단하기는 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA 방법은 가장 일반적으로 사용하여온 진단 방법이나 피시알 진단법보다 검출감도가 약 1000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 진단에 실패하는 경우가 종종 발생한다.
현재 RNA 바이러스의 진단에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법을 가장 일반적으로 사용하고 있다. 병원체의 피시알 진단을 위해서는 종 특이 프라이머의 개발이 가장 중요하다. CLRV를 진단하기 위한 특이 프라이머는 특허 출원된 바 없다.
CLRV는 자연상태에서 주로 체리, 베리류, 완두 등의 목본식물에 발생하고 있으며, 전염은 즙액, 접목, 종자, 선충 등으로 이루어진다. CLRV는 검역대상 병원체로서 수입되는 식물체로부터 이를 검출할 수 있는 진단법을 필요로 한다. 지금까지 CLRV를 진단하기 위하여 주로 ELISA 방법을 사용하고 있으나, 식물체 추출물과 항혈청의 비특이적 반응으로 오진단하는 경우가 종종 있다. 또한 검사할 종자에서 CLRV의 감염율이 낮을 경우 ELISA 진단법으로는 검사에 실패할 가능성이 높다. 그리하여 이런 종자에서 바이러스를 검출하기 위해서는 일반적으로 ELISA 진단법보다 검출감도가 1000배 정도 높은 피시알 진단법이 필요하다. 검역현장에서는 하나의 검사시료에 대하여 다양한 병원체의 진단을 수행하여야 됨으로 여러 가지 진단법을 사용할 경우 많은 노동력과 검사 비용이 소요된다. 그래서 각각의 병원체에 대하여 동일한 검사법의 개발이 필요하다. 피시알 검사법으로 진단할 때, 특이적 반응의 강도가 낮아 판별이 곤란할 경우, 또는 다른 핵산과의 비특이적 반응을 일으킬 경우를 대비하여 병원체별 진단용 프라이머 은행의 구축과 피시알 양성 및 음성 반응을 검정할 수 있는 시스템을 필요로 한다. 한편, 분리주 특이적 프라이머를 진단에 사용할 경우 검사에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이 프라이머의 개발이 요구된다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, CLRV 종(species) 내에는 약간씩 다른 염기서열을 가지고 있는 계통(strain) 또는 분리주(isolate)들이 존재한다. 그리하여 분리주 특이적인 프라이머를 진단에 사용할 경우는 진단에 실패할 위험이 있다. 다시 말해서 바이러스 진단용 프라이머는 바이러스 각각에 대하여 종 특이적으로 작동하여야 한다. 본 발명에서의 프라이머는 종 특이적으로 작동하도록 설계하였다. 즉, 종 내에서 지금까지 알려진 염기서열을 수집하여 종의 모든 계통과 분리주가 가지고 있는 공통 염기서열을 탐색하였다. 그리고 이 공통 염기서열 중에서 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열을 프라이머 설계 대상에서 제외시킴으로써 종 특이적 서열을 선발하였다. 이러한 종 특이적 염기서열로부터 프라이머로 최적의 조건을 가지는 서열을 종 특이적 프라이머로 설계하였다. 설계한 프라이머들은 조합별로 실제적인 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 검출력이 우수한 조합을 최종적으로 선발하였다. 그리고 최종 선발된 프라이머 조합에 대하여 검정용 프라이머(nested primer)를 함께 개발하였다. 또한 CLRV에 대한 다양한 진단용 프라이머 조합을 확보하여 피시알 양성반응 및 음성반응을 검정할 수 있는 프라이머 은행을 구축하였다. 그리고 CLRV의 프라이머 설계 영역을 클로닝한 플라스미드를 제조하여 양성대조구를 확보하였으며, 염기서열을 결정하여 양성반응을 확인할 수 있게 하였다. 아울러 피시알 반응조건을 모든 바이 러스 및 프라이머 조합에서 동일하게 개발하여 검역현장에서 검사효율을 높일 수 있게 하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 22로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 조합을 포함하는 CLRV 진단용 프라이머 조합을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 조합을 포함하는 CLRV 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 조합을 이용하여 CLRV를 종 특이적으로 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 체리잎말림바이러스(CLRV) 피시알 검사 시스템은 식물체 종자와 조직 등으로부터 CLRV를 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상 검출한계를 가지고 진단할 수 있다. 피시알 검사 시스템에 포함된 CLRV 진단용 프라이머는 지금까지 알려진 CLRV 모든 계통들과 반응할 수 있게 개발되었으며, 또한 양성 및 음성 반응의 검증을 위한 도구를 포함하고 있다. 본 발명의 검사 시스템은 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 검역현장에서 CLRV의 검사에 이용할 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 22로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 조합을 포함하는 CLRV 진단용 프라이머 조합을 제공한다.
본 발명의 CLRV 진단용 프라이머 조합에서, 정방향 프라이머는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되고, 역방향 프라이머는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 다만, 본 발명의 프라이머 조합에서, 정방향 프라이머는 역방향 프라이머보다는 5'쪽에 위치해야 한다.
본 발명의 CLRV 진단용 프라이머 조합은 바람직하게는 서열번호 8 및 14의 프라이머 조합(조합 8); 서열번호 5 및 15의 프라이머 조합(조합 18); 서열번호 7 및 15의 프라이머 조합(조합 20); 서열번호 7 및 17의 프라이머 조합(조합 44); 서열번호 1 및 21의 프라이머 조합(조합 79); 및 서열번호 1 및 22의 프라이머 조합(조합 85)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 CLRV 진단용 프라이머 조합은 더욱 바람직하게는 서열번호 8 및 14의 프라이머 조합(조합 8); 및 서열번호 7 및 17의 프라이머 조합(조합 44)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 8 및 14의 프라이머 조합(조합 8); 및 서열번호 7 및 17의 프라이머 조합(조합 44)을 포함할 수 있다. 2개의 프라이머 조합을 동시에 이용하면 CLRV를 더욱 정확하게 진단할 수 있다.
본 발명의 CLRV 진단용 프라이머 조합은 또한 서열번호 10 및 15의 프라이머 조합; 서열번호 10 및 16의 프라이머 조합; 서열번호 9 및 18의 프라이머 조합; 및 서열번호 10 및 18의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 CLRV 진단용 프라이머 조합은 CLRV 진단용 프라이머 조합 8의 RT-PCR 산물에 대한 검증기능을 가진 프라이머 CLR-C20/N80 조합과 CLR-C24/N80 조합, CLRV 진단용 프라이머 조합 44의 RT-PCR 산물에 대한 검증기능을 가진 프라이머 CLR-C30/N62 조합과 CLR-C30/N80 조합을 추가로 포함할 수 있다. 1차 RT-PCR 검사 결과의 검정이 필요할 경우, 즉 RT-PCR 산물이 CLRV로부터 유래된 결과인지 확인하기 위하여 이 프라이머 조합에 대한 검정용 프라이머(nested primer)를 이용하여 PCR 검사를 실시한다. 이때 RT-PCR 반응 결과가 CLRV 유래에서 비롯되었다면 검정용 PCR에서 양성반응을 나타낼 것이다 (도 5 참고).
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 서열번호 23의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(18개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 2의 프라이머(24개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 조합; 및 서열번호 24의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 포함하는, CLRV 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 RT-PCR에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 역전사효소, 리보뉴클레아제 저해제, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등일 수 있으며, 반응 완충액은 역전사 완충액 및 PCR 완충액 양자를 모두 포함하며, 내열성 중합효소는 EF Taq 중합효소 등을 이용할 수 있으며, 역전사효소는 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래 된 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사효소 (Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 키트에 포함되는 서열번호 24의 염기서열을 갖는 DNA 단편은 CLRV 진단용 프라이머 조합을 이용한 RT-PCR 또는 PCR 반응에 대한 양성대조구의 기능을 가진 플라스미드로서 이용될 수 있다 (도 6 참고).
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
식물 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 조합을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, CLRV를 종 특이적으로 진단하는 방법을 제공한다.
식물 시료에서 전체 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 프라이머 조합을 프라이 머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 식물은 체리, 베리류, 호두, 콩, 자두 또는 완두일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 CLRV에 감염될 수 있는 식물이면 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: CLRV 진단용 프라이머의 설계 및 조합
CLRV는 한가닥 RNA로 구성된 직경 약 28nm의 구형 바이러스이다. CLRV의 게놈은 두 가지로 구성되어 있는데 전체 게놈크기는 약 16.5kb이며, RNA 1은 약 9kb, RNA 2는 약 7.5kb 이다. 분류학적으로 코모비리데(Comoviridae) 네포바이러스(Nepovirus) 속(genus)에 속한다. CLRV는 주로 즙액, 접목, 종자, 선충에 의해 전염된다. 자연상태에서 대부분의 기주는 체리, 완두 등의 목본식물과 관련이 있으며, 실험적 기주범위는 36과 이상의 기주를 갖는다. 진단용 프라이머의 설계는 CLRV의 RNA1과 RNA2의 3'말단 유사염기서열 영역을 대상으로 이루어졌다.
CLRV 공통 염기서열 탐색은 지금까지 알려진 CLRV 분리주의 16가지 염기서열(표 1)을 다중 비교하여 이루어졌다. 이렇게 선발된 공통 염기서열은 CLRV와 분류학적으로 유사한 코모비리데(Comoviridae) 5종의 바이러스 염기서열(표 2)과 비교하여 종 특이적인 서열을 탐색하였다. 이러한 종 특이적 염기서열들 중에서 프라이머 조건을 충족시키는 진단용 프라이머 23가지를 설계하였다(표 3). 설계한 프라이머의 위치는 도 1과 같다. 이들 프라이머를 이용하여 92개의 프라이머 조합을 만들었으며, RT-PCR 예상 산물은 표 4와 같다.
표 1. 공통 염기서열 분석에 사용한 CLRV 분리주 염기서열
분리주 또는 계통 Genbank ac. no. 크기(bp) 분석 게놈
CLRV-rhubarb S84125 1805 RNA2 3'-terminal
CLRV-rhubarb S84124 1743 RNA1 3'-terminal
CLRV-W8 U24694 1565 RNA2 3'-terminal
CLRV-W8 Z34265 1588 RNA1 3'-terminal
CLRV-birch S84126 1182 3'-terminal
CLRV-JPN AB168098 1161 RNA1 3'-terminal
CLRV-JPN AB168099 1159 RNA1 3'-terminal
CLRV-JPN AB168100 1158 RNA1 3'-terminal
CLRV-E2484 AM981029 412 3'UTR
CLRV-E210 AJ877118 375 3'UTR
CLRV-E156 AJ877150 380 3'UTR
CLRV-CTIFL AJ877151 363 3'UTR
CLRV-Ludmila AJ877152 376 3'UTR
CLRV-E797 AJ877161 375 3'UTR
CLRV-E802 AJ877162 371 3'UTR
CLRV-E805 AJ877163 374 3'UTR
표 2. 종 특이적 염기서열 분석에 이용한 네포바이러스 염기서열
바이러스 Genbank ac. no. 크기(bp) 분석 게놈
CLRV-RNA2 S84125 1805 RNA2
CLRV-RNA1 S84124 1743 RNA1
Peach rosette mosaic virus AF016626 7977 RNA1
Blueberry leaf mottle virus U20622 1908 RNA1
Blueberry leaf mottle virus U20621 3082 RNA2
Artichoke yellow ringspot virus AM087671 5873 RNA1
Tomato ringspot virus NC_003840 8214 RNA1
Tomato ringspot virus NC_003839 7271 RNA2
Blackcurrant reversion virus NC_003509 7711 RNA1
Blackcurrant reversion virus NC_003502 6405 RNA2
표 3. CLRV 종 공통 염기서열로부터 설계된 진단용 프라이머
프라이머 서열(5'-3') 서열번호 길이 위치a
정방향 CLR-N10 CGTTTGGTTGCCGTAAGC 1 18 294-311
CLR-N20 GAGTCGACACGTGGATTTTGAGAT 2 24 408-431
CLR-N21 TCGACACGTGGATTTTGAGATAGT 3 24 411-434
CLR-N23 ACGTGGATTTTGAGATAGTGGTAA 4 24 416-439
CLR-N40 CCTGTGTAGTACGCGAAAGTRTCC 5 24 824-847
CLR-N42 GTCTCCKCACTTTGTAGCACCTCT 6 24 842-865
CLR-N50 TCTGGCGGGAATAGTGRAGGTC 7 22 1014-1035
CLR-N60 GGTTTTCAGCCCAGGKYAGTCTT 8 23 1118-1140
CLR-N62 TCAGCCCAGGKYAGTCTTATTTYA 9 24 1123-1146
CLR-N80 CAATTCTGGCGACCGTGTAAC 10 21 1372-1392
CLR-N85 TTCCATGCGACCGGTCTTAGTAGT 11 24 1436-1459
CLR-N90 GTTAACGAATATCTACTGCCATCC 12 24 1497-1520
CLR-N100 GCCGGGTGTGCTGGTAAC 13 18 1562-1579
역방향 CLR-C10 GGAAAGATTACGTAAAAGGAAAAC 14 24 1767-1790
CLR-C20 AAAMMCGATCGGGGCAACAA 15 20 1665-1684
CLR-C24 ACCCCCTTGCTAACGCTATCTACC 16 24 1628-1651
CLR-C25 CTTGCTAACGCTATCTACCCACAT 17 24 1623-1646
CLR-C30 TRRRATTCAAAGTCACAGGTRTG 18 23 1579-1601
CLR-C40 AACCCTTRGCTGTAGCATTCTTA 19 23 1462-1484
CLR-C45 GTTGCAGCCACYCCACCAG 20 19 1414-1432
CLR-C60 AAATAAGACYRACCTGGGCTGAAA 21 24 1121-1144
CLR-C70 AAGAACTTCACGTAGCAGAGCACT 22 24 883-906
CLR-C80 CMYCTGGCAGACCGGATAGAGC 23 22 609-630
a 위치는 Genbank ac. no. S84125 을 기준으로 작성되었음.
표 4. CLRV 진단용 프라이머 조합과 RT-PCR 예상 산물
Figure 112009001707132-PAT00001
실시예 2: CLRV 진단용 프라이머 은행 구축 및 최적 프라이머 조합의 선발
설계한 CLRV 프라이머들은 92가지로 조합하여(표 4), CLRV 및 여러 가지 관련 바이러스와의 RT-PCR 검정을 통하여 진단에 가장 효과적인 프라이머 조합을 선발하였다. 최적 진단용 프라이머 조합의 선발은 3가지 단계로 이루어졌다. 첫 번째는 CLRV 감염식물체와의 RT-PCR을 통한 선발이며, 두 번째는 분류학적 유사성이 있는 코모비리데 바이러스와의 비특이적 반응 분석이며, 세 번째는 CLRV의 자연기주인 박과 식물에 감염되는 바이러스와의 RT-PCR 분석을 통한 선발이다.
본 발명에서 사용한 전체 RNA 분리 및 RT-PCR 방법은 다음과 같다.
전체 RNA 분리: 상업적으로 시판되는 total RNA 분리 키트(페놀을 이용한 방법(Promega), TRIzol(Invitrogen Co.), easy-spin TM Total RNA Kit(iNtRON Co.)를 이용하여 분리하였다.
RT-PCR: 역전사(Reverse transcription) 반응은 분리한 전체 RNA 0.5 ㎕, 12.5 pmole 다운스트림 프라이머(downstream primer), 5배 역전사 완충액(250 mM Tris-HCl, 150 mM KCl, 40 mM MgCl2, 5 mM DTT, pH 8.5) 1 ㎕, 10 mM dNTP 0.5 ㎕, 10 U RNase inhibitor, 그리고 2 U AMV 역전사효소를 첨가한 반응액 5 ㎕를 42℃에서 1 시간 항온 처리하여 실시한 다음 94℃에서 10 분간 변성시켰다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)은 역전사반응액 5 ㎕에 12.5 pmole 업스트림프라 이머(upstream primer), 1.25 U Taq DNA polymerase, 10배 중합효소연쇄반응 완충액(100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, pH 8.3) 2 ㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 25 ㎕로 만들었다. 이 반응액을 95℃ 45 초, 55℃ 60 초, 72℃ 60 초로 40 회 증폭시켰으며 마지막에는 72℃에서 7 분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 0.5X TBE 완충액과 1.5 % 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 염색하여 확인하였다.
CLRV 감염식물체와의 RT-PCR 검정에서 92가지 프라이머 조합 중에서 반응강도가 뛰어나고 진단에 장해가 되는 비특이적 반응을 보이지 않는 14가지(조합 7, 8, 18, 20, 33, 43, 44, 54, 65, 66, 74, 79, 80, 85) 프라이머 조합을 선발하였다(도 2).
위에서 선발된 14가지 프라이머 조합은 분류학적으로 유사한 바이러스인 브로모비리데 9가지 바이러스와의 비특이적 반응 분석을 통하여 8가지(조합 8, 18, 20, 44, 54, 79, 80, 85) 프라이머 조합을 선발하였다(도 3). 비특이적 반응 분석에는 Comoviridae에 속하는 Cowpea mosaic virus (CPMV), Squash mosaic virus (SqMV), Broad bean wilt virus 2 (BBWV2), Tobacco ringspot virus (TRSV), Tomato ringspot virus (ToRSV), Tomato black ring virus (TBSV), Arabis mosaic virus (ArMV), Grapevine fanleaf virus (GFLV), Raspberry ringspot virus (RpRSV)를 이용하였다.
분류학적 유사바이러스와의 분석에서 선발된 8가지 조합은 기주 식물과 관련된 21가지 바이러스와의 RT-PCR 분석 결과 6가지(조합 8, 18, 20, 44, 79, 85) 프라이머 조합을 최종적으로 선발하였다(도 4). 이들 중 프라이머 조합 8과 44는 종자 실증실험에서 가장 우수한 반응을 보였다. 기주 관련 바이러스와의 비특이적 반응 분석에 이용된 21가지 바이러스는 다음과 같다: Alfalfa mosaic virus (AMV), Arabis mosaic virus (ArMV), Bean yellow mosaic virus (BYMV), Broad bean wilt virus (BBWV), Cowpea chlorotic virus (CCMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Cucumber necrosis virus (CuNV), Cymbidium ringspot virus (CymRSV), Grapevine fanleaf virus (GFLV), Lettuce mosaic virus (LMV), Prune dwarf virus (PDV), Pepper veinal mottle virus (PVMV), Ribgrass mosaic virus (RMV), Soybean mosaic virus (SMV), Squash mosaic virus (SqMV), Tobacco mosaic virus (TMV), Tobacco necrosis virus (TNV), Tobacco rattle virus (TRV), Tobacco streak virus (TSV), Tomato bushy stunt virus (TBSV), Tomato spotted wilt virus (TSWV).
이러한 결과들을 바탕으로 하여 종자 또는 식물체로부터 CLRV를 진단할 경우, 우선적으로 최적 진단용 프라이머로 선발된 프라이머 조합 8과 조합 44를 이용하여 RT-PCR를 수행한다. 이 진단 결과가 미흡할 경우 CLRV 진단용 프라이머 은행의 다른 프라이머의 조합을 이용하여 검증이 가능할 것이다.
실시예 3: CLRV의 진단 및 검증의 예
검사현장에서 CLRV 진단용 최적 프라이머로 조합 8, 조합 44를 이용하여 1차적인 진단을 실시한다. 1차 RT-PCR 검사 결과의 검정이 필요할 경우, 즉 RT-PCR 산물이 CLRV로부터 유래된 결과인지 확인하기 위하여 이 프라이머 조합에 대한 검정용 프라이머(nested primer)를 이용하여 PCR 검사를 실시한다. 이때 RT-PCR 반응 결과가 CLRV 유래에서 비롯되었다면 검정용 PCR에서 양성반응을 나타낸다(도 5). 부가적으로 이러한 본 발명의 CLRV 프라이머 은행으로부터 유래된 PCR 산물을 쉽게 확인할 수 있도록 프라이머가 설계된 전체 영역을 포함하는 양성대조구를 제조하였다. 이 양성대조구는 PCR 검사시 양성대조구로 이용가능하며(도 6), 또한 확인이 필요한 PCR 산물의 염기서열을 쉽게 비교할 수 있도록 양성대조구 플라스미드의 삽입된 영역의 염기서열을 결정하여 제공하였다(도 7).
본 발명의 진단법을 실시할 경우 체리, 콩, 자두 등의 식물체로부터 CLRV 감염여부를 정밀하게 진단할 수 있다. 또한 식물 바이러스에 대한 RT-PCR 진단키트의 산업화가 가능하다. 본 발명을 실시함으로써 국내에서 CLRV의 피해를 최소화할 수 있을 것이며, 국경 검역현장에서 손쉽게 활용할 수 있어 외국으로부터 CLRV에 감염된 식물체 및 종자의 유입을 효과적으로 차단할 수 있을 것이다.
도 1은 CLRV 프라이머 위치를 나타낸다. 위치는 Genbank accession no. S84125을 기준으로 작성되었다.
도 2는 92가지 프라이머 조합의 CLRV와의 특이성 검정 결과이다. RT-PCR 주형으로 CLRV에 감염된 체리 잎 조직으로부터 추출된 전체 RNA를 사용하였으며, 1-92 프라이머 조합은 표 4를 참조한다.
도 3은 선발된 CLRV와의 Comoviridae 내의 관련 바이러스와의 RT-PCR 분석 결과이다. 1:CLRV ,2:CPMV, 3:SqMV, 4:BBWV2, 5:TRSV, 6:ToRSV, 7:TBSV, 8:ArMV, 9:GFLV, 10:RpRSV.
도 4는 선발된 CLRV 진단용 프라이머 조합과 기주 관련 바이러스의 RT-PCR 분석 결과이다. 1:CLRV, 2:AMV, 3:ArMV, 4:BYMV, 5:BBWV, 6:CCMV, 7:CMV, 8:CuNV, 9:CymRSV, 10:GFLV, 11:LMV, 12:PDV, 13:PVMV, 14:RMV, 15:SMV, 16:SqMV, 17:TMV, 18:TNV, 19:TRV, 20:TSV, 21:TBSV, 22:TSWV.
도 5는 CLRV 진단용 최적 프라이머 조합 및 검정용 프라이머 조합의 (RT)PCR 분석 결과이다.
M : size marker
1 : 최적 진단용 프라이머 조합 8 (673bp)
2 : 조합 8에 대한 검정용 프라이머 조합 (CLR-C20/N80, 313bp)
3 : 조합 8에 대한 검정용 프라이머 조합 (CLR-C24/N80, 280bp)
4 : 최적 진단용 프라이머 조합 44 (633bp)
5 : 조합 44에 대한 검정용 프라이머 조합 (CLR-C30/N62, 479bp)
6 : 조합 44에 대한 검정용 프라이머 조합 (CLR-C30/N80, 230bp)
도 6은 CLRV 양성대조구로부터 유래한 진단용 프라이머 조합의 PCR 산물을 나타낸다.
M : size marker
1 : 양성대조구에 삽입된 CLRV DNA 단편(1,493bp)
2 : 진단용 프라이머 조합 8 (673bp)
3 : 진단용 프라이머 조합 44 (633bp)
도 7은 양성대조구에 삽입된 CLRV 염기서열(1,493bp)을 나타낸다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer combination for diagnosing Cherry leaf roll virus and uses thereof <130> PN08258 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-N10 primer <400> 1 cgtttggttg ccgtaagc 18 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-N20 primer <400> 2 gagtcgacac gtggattttg agat 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-N21 primer <400> 3 tcgacacgtg gattttgaga tagt 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-N23 primer <400> 4 acgtggattt tgagatagtg gtaa 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-N40 primer <400> 5 cctgtgtagt acgcgaaagt rtcc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-N42 primer <400> 6 gtctcckcac tttgtagcac ctct 24 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-N50 primer <400> 7 tctggcggga atagtgragg tc 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-N60 primer <400> 8 ggttttcagc ccaggkyagt ctt 23 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-N62 primer <400> 9 tcagcccagg kyagtcttat ttya 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-N80 primer <400> 10 caattctggc gaccgtgtaa c 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-N85 primer <400> 11 ttccatgcga ccggtcttag tagt 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-N90 primer <400> 12 gttaacgaat atctactgcc atcc 24 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-N100 primer <400> 13 gccgggtgtg ctggtaac 18 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-C10 primer <400> 14 ggaaagatta cgtaaaagga aaac 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-C20 primer <400> 15 aaammcgatc ggggcaacaa 20 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-C24 primer <400> 16 acccccttgc taacgctatc tacc 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-C25 primer <400> 17 cttgctaacg ctatctaccc acat 24 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-C30 primer <400> 18 trrrattcaa agtcacaggt rtg 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-C40 primer <400> 19 aacccttrgc tgtagcattc tta 23 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-C45 primer <400> 20 gttgcagcca cyccaccag 19 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-C60 primer <400> 21 aaataagacy racctgggct gaaa 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-C70 primer <400> 22 aagaacttca cgtagcagag cact 24 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLR-C80 primer <400> 23 cmyctggcag accggataga gc 22 <210> 24 <211> 1493 <212> DNA <213> Cherry leaf roll virus <400> 24 cgtttggttg ccgtaagcaa ccttcaaaag gatgtcatcg cttagcgttt taccgaaagg 60 ttaaagatgt gaatggcagc gtaacgcact gtcaatcctc cataatggtt ccacgagtcg 120 acacgtggat tttgagatag tggtaaacca ctcattcaga gtaacgcctg aatgtattag 180 tgctgctgta tggtgtttac cgtaaggttg gtgcccctga aaagggatcc tgttcgcttg 240 cgtggtcggt aacaccttct acagttttgt attagtttga ctcctggaaa gacaggtgac 300 gtggagagca aagctctatc cggtctgcca ggtgcaagac ctaaatccaa tgcaccatcc 360 ctaaccacat gggttaaatg tggacggtgg agttgccggt cctagctctt aagtgtatgt 420 tctgaaaata acatgcttct tttatttgtt tgagaatttc aaacatcata tcttttatgc 480 tttattttat tttattgtgt agtcatacgc acacaggaat tgatcccctg tgtagtacgc 540 gaaagtctcc tcactttgta gcacctcttg cttggtgtcc acaagtgctc tgctacgtga 600 agttcttcat ttagctatgt ttactctgga attacggacg tagtcccctt cagagccagc 660 gtgtaggatg cccggataga cttcaaacga agggttcccc gaagctggtc cacgttcctg 720 gcgggaatag tgaaggtcat ctccagttag acatagttta aaattatttt gaacttaacg 780 aaagacgaga cgagtagtta gcgtttagtc gaacctgggt ggttttcagc ccaggttggt 840 cttattttat aggctcagac tagccttagt tgaaactagt aaagttgaaa ttagtgatta 900 agtccaggaa gtttgtagta aaggcgataa gtccatccta ccccatattg aatgggatgc 960 gtggttatca aatttcacga attcttctac ttggtaatat cactagtgga tacttgaaaa 1020 gttagacatg ttgagtgggc gttctcattt caaacgtcat aaaacggaat atcacaattc 1080 tggcgaccgt gtaacggcaa caatgttaag gtgacattgg tggagtggct gcaaccattt 1140 ccatgcgacc ggtcttagta gtattaagga tgctacagcc aagggttccg taagttttag 1200 ttaacgaata tctactgcca tccgtaatag tgtgtgatgg tcctctatct tacttggtat 1260 atgagccggg tgtgctggta acacacctgt gactttgaat cccaagccca agaatttagg 1320 gggttatgtg ggtagatagc gttagcaagg gggttgttta gcaatatttg ttgccccgat 1380 cggttttcaa aatttgctta ttgtatgagt gtcggactca agcagtgttt aggttttaaa 1440 ttgtttagat ttaaatgttt acttttaaag ttttcctttt acgtaatctt tcc 1493

Claims (9)

  1. 정방향 프라이머가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되고, 역방향 프라이머가 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CLRV 진단용 프라이머 조합.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 8 및 14의 프라이머 조합; 서열번호 5 및 15의 프라이머 조합; 서열번호 7 및 15의 프라이머 조합; 서열번호 7 및 17의 프라이머 조합; 서열번호 1 및 21의 프라이머 조합; 및 서열번호 1 및 22의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 CLRV 진단용 프라이머 조합.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 8 및 14의 프라이머 조합; 및 서열번호 7 및 17의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 CLRV 진단용 프라이머 조합.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 8 및 14의 프라이머 조합; 및 서열번호 7 및 17의 프라이머 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 CLRV 진단용 프라이머 조합.
  5. 제2항에 있어서, 서열번호 10 및 15의 프라이머 조합; 서열번호 10 및 16의 프라이머 조합; 서열번호 9 및 18의 프라이머 조합; 및 서열번호 10 및 18의 프라이머 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 CLRV 진단용 프라이머 조합.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 조합; 및 서열번호 24의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 포함하는, CLRV 진단용 키트.
  7. 식물 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 조합을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, CLRV를 종 특이적으로 진단하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 식물은 체리, 베리류, 호두, 콩, 자두 또는 완두인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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