KR101024115B1 - 땅콩덤불바이러스 검출용 ｐｃｒ 프라이머쌍 및 이를 이용한 땅콩덤불바이러스 검출 방법 - Google Patents

땅콩덤불바이러스 검출용 ｐｃｒ 프라이머쌍 및 이를 이용한 땅콩덤불바이러스 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 땅콩덤불바이러스 검출용 PCR 프라이머쌍 및 이를 이용한 땅콩덤불바이러스 검출 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 정방향 프라이머와 서열번호 11 내지 18로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머로 이루어진 땅콩덤불바이러스(Peanut clump virus, PCV) 검출용 PCR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 RT-PCR 또는 RT-PCR 및 nested PCR의 결합 방법에 의하여 땅콩덤불바이러스 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 PCV를 시료에서 특이적으로 검출할 수 있는 PCR 프라이머쌍, 이를 이용하는 PCV 검출 방법 및 PCV 검출용 키트를 제공한다. 이러한 본 발명의 PCR 프라이머쌍, 검출 방법 및 검출용 키트는 미지의 시료에서 PCV의 존재여부를 빠르고, 간편하며, 정확하게 확인할 수 있으므로 산업 및 검역 현장 등에서 유용하게 사용할 수 있다.
땅콩덤불바이러스, RT-PCR, Nested PCR, 검역

Description

땅콩덤불바이러스 검출용 ＰＣＲ 프라이머쌍 및 이를 이용한 땅콩덤불바이러스 검출 방법{PCR primer pair detecting Peanut clump virus and method for detecting Peanut clump virus using the same}
본 발명은 땅콩덤불바이러스 검출용 PCR 프라이머쌍 및 이를 이용한 땅콩덤불바이러스 검출 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 정방향 프라이머와 서열번호 11 내지 18로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머로 이루어진 땅콩덤불바이러스(Peanut clump virus, PCV) 검출용 PCR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 RT-PCR 또는 RT-PCR 및 nested PCR의 결합 방법에 의하여 땅콩덤불바이러스 검출하는 방법에 관한 것이다.
바이러스 진단법으로 과거에는 전자현미경과 혈청학적 방법(ELISA)을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태적 특징으로 종을 진단하기는 불가능하다. 혈청학적 방법 중 효소 결합 면역흡수 검정법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA)은 가장 일반적으로 사용하 여온 진단방법이나 피시알 진단법보다 검출감도가 약 1000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 진단에 실패하는 경우가 종종 발생한다.
따라서, 현재 바이러스의 진단에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 PCR 방법을 가장 일반적으로 사용되고 있다. 병원체의 PCR 진단을 위한 프라이머의 개발에 있어 중요한 점은, 첫째 바이러스 종 내에 존재하는 모든 계통 및 분리주 를 검출 할 수 있어야 한다는 것이다. 이를 위하여 검출 대상 바이러스 종의 모든 계통 및 분리주에 있어서 공통되는 염기서열을 대상으로 프라이머를 설계하여야 한다. 둘째, 상이한 종 간에는 특이성이 있어야 한다는 것이다. 이를 위하여 검출 대상 바이러스 종과 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열에는 반응하지 않는 프라이머를 설계 하여야 한다.
땅콩덤불바이러스(PCV; Peanut clump virus)는 한가닥 RNA로 구성된 막대형 바이러스로 폭 21nm에 길이는 190nm 와 245nm 두가지 입자로 구성된다. PCV의 핵산은 전체 약 12.1kb이며, RNA 1은 약 6.8kb, RNA 2는 약 5.3kb 이다. 분류학적으로 페크루바이러스(Pecluvirus) 그룹에 속한다. PCV는 주로 즙액과 종자 및 토양에 의해 전염된다. PCV는 비교적 넓은 기주범위를 나타내며, 자연상태에서 땅콩, 단수수, 조 등에 발생하고 있다. 현재 다양한 종류와 많은 양의 식물들이 외국에서 수입되고 있는바 이들을 검역하기 위해서는 정확하고 빠르면서도 간편한 검출 방법의 개발이 절실한 실정이다.
이에 본 발명자들은 땅콩덤불바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 새로운 방법을 개발하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 땅콩덤불바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 새로운 프라이머쌍을 개발하고, 이를 이용하여 미지의 시료에서 땅콩덤불바이러스를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 땅콩덤불바이러스 검출용, 검정용 PCR 프라이머쌍 및 이를 이용한 땅콩덤불바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 정방향 프라이머와 서열번호 11 내지 18로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머로 이루어진 땅콩덤불바이러스(Peanut clump virus) 검출용 PCR 프라이머쌍을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
(b) 분리된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
(c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 시료로부터 땅콩덤불바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
(b) 분리된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 PCR 산물을 주형으로 하고, 상기 (b) 단계에서 이용한 프라이머쌍에 대한 네스티드 프라이머쌍(nested primer pair)을 이용하여 nested PCR을 수행하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 nested PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 시료로부터 땅콩덤불바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 검출용 PCR 프라이머쌍을 포함하는 땅콩덤불바이러스 검출용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 땅콩덤불바이러스(PCV) 검출용 PCR 프라이머쌍은 PCV를 특이적으로 검출하며, PCV와 계통상으로 유사한 다른 퓨로바이러스(Furovirus)는 검출하지 않을 뿐만아니라, 다른 바이러스도 검출하지 않는다. 따라서, 본 발명의 PCV 검출용 PCR 프라이머쌍은 PCV를 특이적으로 검출할 수 있다. 본 발명의 PCV 검출용 PCR 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 정방향 프라이머와 서열번호 11내지 18로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 17로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 1 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 2 및 서열번호 15로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 2 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 서열번호 15로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 4 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 4 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 4 및 서열번호 15로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 4 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 4 및 서열번호 17로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 서열번호 11로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 서열번호 15로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 6 및 서열번호 11로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 6 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 6 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 6 및 서열번호 15로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 서열번호 11로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 서열번호 15로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 8 및 서열번호 11로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 8 및 서열번 호 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 8 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 8 및 서열번호 15로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 서열번호 11로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 서열번호 15로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 10 및 서열번호 11로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 10 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 10 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍; 또는 서열번호 10 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머쌍일 수 있다. 더 바람직하게는 본 발명의 PCV 검출용 PCR 프라이머쌍은 서열번호 1 및 서열번호 17로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 4 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 4 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 6 및 서열번호 15로 표시되는 프라이머쌍; 또는 서열번호 9 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 4 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍; 또는 서열번호 9 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍일 수 있다. 상기 프라이머쌍은 퓨로바이러스나 다른 바이러스와 비특이적 증폭을 보이지 않으며 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출 할 수 있어 더욱 정확한 검출에 이용될 수 있다.
본 발명의 PCR 프라이머쌍은 시료에서 PCV를 검출하는 데에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 PCR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 시료로부터 PCV를 검출하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은
(a) 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
(b) 분리된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
(c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 시료로부터 땅콩덤불바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 RNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 RNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계에서 RT-PCR은 분리된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머쌍 중 역방향 프라이머를 프라이머로 하며, 역전사 효소를 이용하여 역전사 반응을 통해 상보적 DNA 가닥을 합성한 다음 PCR 반응을 수행할 수 있다. PCR 반응은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 역전사 반응에 의해서 합성된 상보적 DNA와 본 발명에서 제공되는 PCR 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중 합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 바람직하게는 52-57℃이며, 보다 바람직하게는 55℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.
상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용 하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 역전사 반응, PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
아울러, 본 발명은 상기 검출반응의 정확성을 높이기 위하여 nested PCR을 수행하는 단계를 추가로 포함시킬 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은
(a) 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
(b) 분리된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 PCR 산물을 주형으로 하고, 상기 (b) 단계에서 이용한 프라이머쌍에 대한 네스티드 프라이머쌍(nested primer pair)을 이용하여 nested PCR을 수행하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 nested PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 시료로부터 땅콩덤불바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
(a), (b) 및 (d) 단계의 RNA 추출, RT-PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 상기에서 기재한 바와 같으며, 상기 (c) 단계에서 nested PCR은 (b) 단계에서의 RT-PCR 산물이 증폭될 수 있도록 하는 네스티드 프라이머쌍(nested primer pair)을 이용하여 PCR을 수행하는 방법에 의할 수 있다. 이 때, PCR 반응의 조건은 상기에서 기재한 바와 같으며, 네스티드 프라이머쌍은 RT-PCR 산물이 증폭될 수 있는한 제한되지는 않으나, 서열번호 4 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머쌍에 대해서는 서열번호 6 및 서열번호 15의 프라이머쌍; 또는 서열번호 9 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍에 대해서는 서열번호 10 및 서열번호 14의 프라이머쌍 또는 서열번호 10 및 서열번호 15의 프라이머쌍일 수 있다.
이와 같은 nested PCR 단계의 추가로 PCV의 검출시 비특이적 반응에 의한 오류를 최소화시킬 수 있어 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 PCR 프라이머쌍을 포함하는 땅콩덤불바이러스 검출용 키트를 제공한다. 키트에는 상기 PCR 프라이머쌍 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).
본 발명의 일실시예에서는 PCV 진단용 프라이머를 디자인하기 위하여 외피단백질이 코드되어 있는 RNA 2를 대상으로 하여 지금까지 알려진 8가지 PCV 분리주의 염기서열을 비교하여 PCV 공통염기서열을 탐색하고, PCV와 분류학적으로 유사한 퓨로바이러스(Furovirus) 5종의 바이러스 염기서열과 유사하지 않은 서열을 선별하였다. 이를 바탕으로 18개의 프라이머를 설계하고, 이 프라이머들을 이용하여 53개의 프라이머 조합을 만들었다(표3, 표4).
본 발명의 다른 실시예에서는 상기 53개의 프라이머 조합을 대상으로 PCV에 감염된 식물체를 시료로 하여 분리된 RNA를 이용하여 RT-PCR 검정을 하여 비특이적 반응이 적고 PCV에 반응강도가 강한 34가지 프라이머 조합(조합 1, 5, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 50, 51, 52, 53)을 선발 하였다. 이들 중 증폭효율이 특히 뛰어나고 nested PCR 프라이머 조합 선발에 적합한 6가지 프라이머 조합을 1차 선발 하였다. 이후 다른 종류의 바이러스를 이용하여, 1차 선발한 6가지 프라이머 가 다른 종류 바이러스에 반응 하는지 여부를 실험하여 가장 우수한 3가지 프라이머 조합을 선별하였다.
본 발명의 일 시험예에서는 PCV에 감염되었을 것이라고 의심되는 시료를 대상으로 선별된 프라이머 조합을 이용하여 PCV를 검출하였다. 그 결과, 각각의 프라이머 조합 및 이들에 대한 nested PCR의 결과도 증폭이 잘 이루어져 시료가 PCV에 감염되었음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 PCV를 시료에서 특이적으로 검출할 수 있는 PCR 프라이머쌍, 이를 이용하는 PCV 검출 방법 및 PCV 검출용 키트를 제공한다. 이러한 본 발명의 PCR 프라이머쌍, 검출 방법 및 검출용 키트는 미지의 시료에서 PCV의 존재여부를 빠르고, 간편하며, 정확하게 확인할 수 있으므로 산업 및 검역 현장 등에서 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
PCV 진단용 프라이머의 설계
PCV 진단용 프라이머의 설계는 외피단백질이 코드 된 RNA2를 대상으로 이루어졌다. 종 특이적 염기서열 탐색을 위하여 지금까지 알려진 8가지 PCV 분리주의 염기서열(표 1)을 비교하여 공통염기서열을 찾고, 이를 PCV와 분류학적으로 유사한 퓨로바이러스(Furovirus) 5종의 바이러스 염기서열(표 2)과 비교하여 PCV 종 특이적인 염기서열 군을 찾아내었다. 이러한 종 특이적 염기서열 군을 바탕으로 진단용 프라이머 18가지를 설계하였다(표 3; 표 3에서 위치는 Genbank ac. no. L07269를 기준으로 작성되었음). 설계한 프라이머의 위치는 도 1과 같으며 이들 프라이머를 이용하여 53개의 프라이머 조합을 만들었다(표 4; 표 4에서 위치는 Genbank ac. no. L07269를 기준으로 작성되었음).
공통염기서열 분석에 사용한 PCV 분리주 염기서열
분리주 또는 계통 Genbank ac. no. 크기(bp) 분석 게놈
PCV L07269 4504 RNA-2
PCV-87 NC_003668 4504 RNA-2
PCV-Ni AF447398 4305 RNA-2
PCV-N AF447399 4553 RNA-2
PCV-M AF447400 4658 RNA-2
PCV-B AF447401 4466 RNA-2
IPCV-D AF447396 4310 RNA-2
IPCV-L AF239729 4290 RNA-2
종 특이적 염기서열 분석에 이용한 퓨로바이러스 염기서열
바이러스 Genbank ac. no. 크기(bp) 분석 게놈
OGSV AJ132579 3232 RNA-2
SCSV NC_004015 3418 RNA-2
RSNV DQ393892 978 RNA-2
SBWMV AJ132577 3683 RNA-2
BSBV NC_003518 3454 RNA-2
PCV 종 공통 염기서열로부터 설계된 진단용 프라이머
서열번호 프라이머 명 방향 염기서열 길이(bp) 위치
1 PC-N10 정방향 TDGRAGCTARRATTGTTGTATT 22 3,058-3,079
2 PC-N20 정방향 GANACKGAWRTWAAYCTNTGCTT 23 3,279-3,301
3 PC-N25 정방향 HGYTTWYTCNRAYCCKCATTTGCG 24 3,419-3,442
4 PC-N30 정방향 ACACHCAYTGCTATGGTGAAGAGCA 25 3,544-3,568
5 PC-N35 정방향 ACHTCDGGDGAYAAYATACATAA 23 3,670-3,692
6 PC-N37 정방향 RAAYTCNCCTTTAGCTTAYAATGG 24 3,747-3,770
7 PC-N38 정방향 GAAGYTCCAGYAATAACACACTCTT 25 3,770-3,794
8 PC-N39 정방향 ACTCTTYTGGTTGTGYYTGCTC 22 3,789-3,810
9 PC-N40 정방향 GTCAATGGTCTGGRTYGCCTWCTGT 25 3,816-3,840
10 PC-N50 정방향 CTTTTTGAGTGTTTTGAVTGATAAT 25 3,904-3,928
11 PC-C10 역방향 BRRCGGGGGATTTGCACCTA 20 4,463-4,482
12 PC-C20 역방향 TGAGTTYRCRYACCAGCAGTCTACG 25 4,427-4,451
13 PC-C25 역방향 GATAYARRGGTTTTTGCAATTAAC 24 4,342-4,365
14 PC-C30 역방향 TTAAACCYACAACCGTGCTCTWTGG 25 4,278-4,302
15 PC-C35 역방향 TTGATCAVTCTCGGTHTAATCATTT 25 4,237-4,261
16 PC-C40 역방향 CMMARBATTATCATTCAAAACACTC 25 3,910-3,934
17 PC-C50 역방향 AGWAGGCRAYCCAGACCATTGACA 24 3,815-3,838
18 PC-C60 역방향 TCCGAGCARRCACAACCARA 20 3,794-3,813
상기 표 3에서 M은 A 또는 C를; R은 A 또는 G를; W는 A 또는 T를; Y는 C 또는 T를; K는 G 또는 T를; V는 A, C 또는 G를; H는 A, C 또는 T를; D는 A, G 또는 T를; B는 C, G 또는 T를; N은 A, C, G 또는 T를 의미한다.
PCV 진단용 프라이머 조합과 RT-PCR 예상 산물
조합 역방향 위치 정방향 위치 산물(bp)
1 PC-C60 3,794-3,813 PC-N10 3,058-3,079 756
2 PC-N20 3,279-3,301 535
3 PC-N25 3,419-3,442 395
4 PC-N30 3,544-3,568 270
5 PC-C50 3,815-3,838 PC-N10 3,058-3,079 781
6 PC-N20 3,279-3,301 560
7 PC-N25 3,419-3,442 420
8 PC-N30 3,544-3,568 295
9 PC-C40 3,910-3,934 PC-N10 3,058-3,079 877
10 PC-N20 3,279-3,301 656
11 PC-N25 3,419-3,442 516
12 PC-N30 3,544-3,568 391
13 PC-C40 3,910-3,934 PC-N35 3,670-3,692 265
14 PC-C35 4,237-4,261 PC-N20 3,279-3,301 983
15 PC-N25 3,419-3,442 843
16 PC-N30 3,544-3,568 718
17 PC-N35 3,670-3,692 592
18 PC-N37 3,747-3,770 515
19 PC-N38 3,770-3,794 492
20 PC-N39 3,789-3,810 473
21 PC-N40 3,816-3,840 446
22 PC-N50 3,904-3,928 358
23 PC-C30 4,278-4,302 PC-N25 3,419-3,442 884
24 PC-N30 3,544-3,568 759
25 PC-N35 3,670-3,692 633
26 PC-N37 3,747-3,770 556
27 PC-N38 3,770-3,794 533
28 PC-N39 3,789-3,810 514
29 PC-N40 3,816-3,840 487
30 PC-N50 3,904-3,928 399
31 PC-C25 4,342-4,365 PC-N25 3,419-3,442 947
32 PC-N30 3,544-3,568 822
33 PC-N35 3,670-3,692 696
34 PC-N37 3,747-3,770 619
35 PC-N38 3,770-3,794 596
36 PC-N39 3,789-3,810 577
37 PC-N40 3,816-3,840 550
38 PC-N50 3,904-3,928 462
39 PC-C20 4,427-4,451 PC-N25 3,419-3,442 1,032
40 PC-N30 3,544-3,568 908
41 PC-N35 3,670-3,692 782
42 PC-N37 3,747-3,770 705
43 PC-N38 3,770-3,794 682
44 PC-N39 3,789-3,810 663
45 PC-N40 3,816-3,840 636
46 PC-N50 3,904-3,928 548
47 PC-C10 4,463-4,482 PC-N30 3,544-3,568 938
48 PC-N35 3,670-3,692 813
49 PC-N37 3,747-3,770 736
50 PC-N38 3,770-3,794 713
51 PC-N39 3,789-3,810 694
52 PC-N40 3,816-3,840 667
53 PC-N50 3,904-3,928 579
<실시예 2>
PCV 진단용 프라이머 조합의 선발
표 4의 53가지 PCV 진단용 프라이머 조합 중 PCV 진단에 가장 효과적인 프라이머 조합을 다음과 같이 선발하였다. 먼저 PCV 감염 식물체를 이용하여 PCV에 반응강도가 강하고 비특이적 반응이 적은 조합을 1차 선발 한 후 PCV와 분류학적으로 유사한 퓨로바이러스(Furovirus)와 기주와 관련된 다른 바이러스를 이용하여 PCV에 특이적으로 반응하는 프라이머 조합을 최종 선발하였다.
<2-1> PCV 감염식물체와의 RT-PCR을 통한 선발
PCV 감염 식물체를 시료로 하여 RNA를 분리하고, RT-PCR을 통하여 PCV의 유전체를 증폭할 수 있는지를 확인하였다.
시료로부터 전체 RNA를 분리하는 것은 상업적으로 시판되는 total RNA 분리 키트(페놀을 이용한 방법(Promega), TRIzol(Invitrogen Co.), easy-spin TM Total RNA Kit(iNtRON Co.))를 이용하여 분리하였다.
역전사(Reverse transcription) 반응은 분리한 전체 RNA 0.5 ㎕, 12.5 pmole 다운스트림 프라이머(downstream primer), 5배 역전사 완충액(250 mM Tris-HCl, 150 mM KCl, 40 mM MgCl2, 5 mM DTT, pH 8.5) 1 ㎕, 10 mM dNTP 0.5 ㎕, 10 U RNase inhibitor, 그리고 2 U AMV 역전사효소를 첨가한 반응액 5 ㎕를 42℃에서 1 시간 항온 처리하여 실시한 다음 94℃에서 10 분간 변성시켰다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)은 역전사반응액 5 ㎕에 12.5 pmole 업스트림프라이머(upstream primer), 1.25 U Taq DNA polymerase, 10배 중합효소연쇄반응 완충액(100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, pH 8.3) 2 ㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 25 ㎕로 만들었다. 이 반응액을 95℃ 45 초, 55℃ 60 초, 72℃ 60 초로 40 회 증폭시켰으며 마지막에는 72℃에서 7 분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 0.5× TBE 완충액과 1.5 % 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 후 ethidium bromide로 염색하여 확인하였다.
그 결과, 도 2에서 보듯이, PCV 감염식물체와의 RT-PCR 검정에서 53가지 프라이머 조합 모두에서 PCV 특이적 반응을 확인할 수 있었다. 이들 중에서 반응강도가 뛰어나고 진단에 장해가 되는 비특이적 반응을 보이지 않는 34가지(조합 1, 5, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 42, 43, 44, 46, 48, 49, 50, 51, 52, 53) 프라이머 조합을 선발하였다. 이 중 증폭효율이 특히 뛰어나고 nested PCR 프라이머 조합 선발에 적합한 6가지(조합 5, 12, 18, 24, 33, 37) 프라이머 조합을 1차 선발 하였다.
<2-2> PCV의 기주와 관련된 다른 바이러스와의 반응 분석
상기에서 선발된 6가지 프라이머 조합에 대해서 PCV의 기주와 관련된 14가지의 바이러스와의 RT-PCR을 통하여 다른 바이러스에도 상기 프라이머가 반응 하는지 여부를 분석하였다.
RT-PCR에 사용된 바이러스
바이러스 명 표 시
Alfalfa mosaic virus AMV
Arabis mosaic virus ArMV
Bean necrotic yellow vein virus BNYVV
Beet mosaic virus BtMV
Cowpea chlorotic mottle virus CCMV
Cowpea mild mottle virus CPMMV
Cowpea severe mosaic virus CPSMV
Cucumber mosaic virus CMV
Grapevine fanlef virus GFLV
Prune dwarf virus PDV
Ribgrass mosaic virus RMV
Soybean mosaic virus SMV
Tobacco rattle virus TRV
Tomato bushy stunt virus TBSV
이를 위하여, 상기 표 5에 열거된 바이러스 및 PCV를 각각 시료로 하여 상기 <실시예 2-1>에서와 같이 RNA 분리 및 RT-PCR 반응을 수행하였다.
그 결과, 도 3에서 보듯이, 프라이머 조합 24, 33 및 37이 PCV의 기주와 관련된 14가지의 바이러스에서 특이적으로 증폭되지 아니함을 확인하고 이 세 가지 프라이머 조합이 PCV 검정용 프라이머 조합으로 가장 바람직함을 알 수 있었다.
<실시예 3>
PCV 진단 결과의 검정용 프라이머 조합의 선발
검정용 프라이머 조합은 PCV 종 특이적이면서 진단 결과물 내에 프라이머의 염기서열이 위치하여야 한다.
이에 따라 검정용 프라이머 조합은 표 3에 나온 진단용 프라이머 후보군에서 선발하였다. 프라이머 조합 24를 이용한 결과물에 대한 검정용으로는 PC-C35와 PC-N37 조합을 선발하였고, 프라이머 조합 37를 이용한 결과물에 대한 검정용으로는 PC-C30과 PC-N50조합과 PC-C35와 PC-N50조합을 선발하였다.
PCV 검정용 프라이머 조합과 PCR 예상 산물
검정 대상 산물 검정용 프라이머 명 서열 번호 예상 산물 길이
조합 24
(PC-C30/N30, 759bp)		 PC-N37 6 515bp
PC-C35 15
조합 37
(PC-C25/N40, 550bp)		 PC-N50 10 399bp
PC-C30 14
조합 37
(PC-C25/N40, 550bp)		 PC-N50 10 358bp
PC-C35 15
<실시예 4>
PCV 진단 및 검정의 예
PCV에 감염되었을 것이라고 의심되는 시료들을 RNase free 상태에서 분쇄 한 후 TRIzol을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 이용하여 상기 <실시예 2-1>에서와 같은 방법으로 본 발명의 프라이머 조합 24 또는 37을 이용하여 각각 RT-PCR을 수행하고 그 결과를 전기영동으로 확인하였다. 또한 상기 프라이머 조합 24 또는 37을 이용한 RT-PCR로 인하여 나온 결과의 검정을 위하여 상기 표 6에 표시된 각 결과물에 맞는 검정용 프라이머 조합을 이용하여 nested PCR을 실시하였다. RT-PCR을 통해 나온 결과물과 검정용 nested PCR의 결과물을 상기 <실시예 2-1>에서와 같은 방법으로 전기영동하여 결과를 확인하였다.
그 결과, 도 4에서 보듯이, 각각 프라이머 조합 24 또는 37을 이용한 PCV 진단이 성공적으로 이루어졌으며, 이들에 대한 검정용 nested PCR의 결과도 증폭이 잘 이루어져 시료가 PCV에 감염되었음을 확인할 수 있었다.
또한, PCV 검출을 위한 양성대조구로 이용하기 위하여, 프라이머가 설계된 전체 영역(염기서열 19)을 포함하는 플라스미드를 제작하였다. 이를 대상으로 프라이머 조합 24 또는 37에 대해서 PCR을 수행한 결과, 도 5에서 보듯이, 증폭이 잘 이루어짐을 알 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 PCV를 시료, 특히 땅콩, 단수수 또는 조인 시료에서 특이적으로 검출할 수 있는 PCR 프라이머쌍, 이를 이용하는 PCV 검출 방법 및 PCV 검출용 키트를 제공한다. 이러한 본 발명의 PCR 프라이머쌍, 검출 방법 및 검출용 키트는 미지의 시료에서 PCV의 존재여부를 빠르고, 간편하며, 정확하게 확인할 수 있으므로 산업 및 검역 현장 등에서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 Genbank ac. no. L07269를 기준으로 작성된 PCV 진단용 프라이머 위치이다.
도 2는 53가지 프라이머 조합의 PCV와의 특이성을 확인한 것이다. RT-PCR 주형으로 PCV에 감염된 땅콩 잎 조직으로부터 추출된 전체 RNA를 사용하였다. M : size marker; 1~53레인은 표 4의 1~53 프라이머 조합을 나타낸다.
도 3은 1차 선발된 PCV 진단용 프라이머 조합을 이용한 기주 관련 바이러스의 RT-PCR 결과를 나타낸다. M : size marker; 1:PCV, 2:BNYVV, 3:AMV, 4:ArMV, 5:BtMV, 6:CCMV, 7:CPMMV 8:CPSMV, 9:CMV, 10:GFLV, 11:PDV, 12:RMV, 13:SMV, 14:TRV, 15:TBSV.
도 4는 PCV 진단용 프라이머 조합 및 검정용 프라이머 조합의 nested PCR 결과를 나타낸다.(M : size marker; 1 : 프라이머 조합 24 (759bp); 2 : 조합 24에 대한 검정용 nested PCR (PC-C35/PC-N37) (515bp); 3 : 프라이머 조합 37 (550bp); 4 : 조합 37에 대한 검정용 nested PCR (PC-C30/PC-N50) (399bp); 5 : 조합 37에 대한 검정용 nested PCR (PC-C35/PC-N50) (358bp))
도 5는 PCV 양성대조구를 시료로 한 PCR 결과를 나타낸다. (M : size marker; 1 : 양성대조구에 삽입된 PCV DNA 단편 (1,621bp); 2 : 프라이머 조합 24 (759bp); 3 : 프라이머 조합 37 (550bp))
<110> Republic of Korea (Management: Rural Development Administration) <120> PCR primer pair detecting Peanut clump virus and method for detecting Peanut clump virus using the same <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-N10: forward primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 1 tdgragctar rattgttgta tt 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-N20: forward primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 2 ganackgawr twaayctntg ctt 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-N25: forward primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 3 hgyttwytcn raycckcatt tgcg 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-N30: forward primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 4 acachcaytg ctatggtgaa gagca 25 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-N35: forward primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 5 achtcdggdg ayaayataca taa 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-N37: forward primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 6 raaytcncct ttagcttaya atgg 24 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-N38: forward primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 7 gaagytccag yaataacaca ctctt 25 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-N39: forward primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 8 actcttytgg ttgtgyytgc tc 22 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-N40: forward primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 9 gtcaatggtc tggrtygcct wctgt 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-N50: forward primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 10 ctttttgagt gttttgavtg ataat 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-C10: reverse primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 11 brrcggggga tttgcaccta 20 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-C20: reverse primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 12 tgagttyrcr yaccagcagt ctacg 25 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-C25: reverse primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 13 gatayarrgg tttttgcaat taac 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-C30: reverse primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 14 ttaaaccyac aaccgtgctc twtgg 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-C35: reverse primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 15 ttgatcavtc tcggthtaat cattt 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-C40: reverse primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 16 cmmarbatta tcattcaaaa cactc 25 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-C50: reverse primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 17 agwaggcray ccagaccatt gaca 24 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC-C60: reverse primer for detecting Peanut clump virus(PCV) <400> 18 tccgagcarr cacaaccara 20 <210> 19 <211> 1621 <212> DNA <213> Peanut clump virus <400> 19 ttctgtctgc ttacttgcta ataaagaact aaaaagtgac ttcgcaggtg taccttcagt 60 attttcagtg gaggaaatgt tgttgtcggc tgtaccgtca agttttaatg ttatgttagt 120 cgatgagtat acgttgactc gaagtgctga aatcttgctc ttgcaaagga aactgggagc 180 taagattgtt gtattgtttg gtgacagaga gcaaggtaac acaaacaaac ttacaagtcc 240 ggagtggttg catgtgccca ttgtcttttc aagtgactcg agtcatcggt tcggtcctga 300 gacggcaaag ttctgtgaag accaaggttt ttctttggaa ggaaaagggg gcgaagataa 360 aattgtgaag ggtgattacg agggtgaagg agaggaaaca gaagttaatc tctgctttac 420 tgaagaaacg aaggccgatc tcgctgaggt acaagtggaa gcttttcttg tgtctagtgt 480 ccaaggcagg acatttccaa gtgtgtcatt gtttgtgagg gagaacgaca agtctgcttt 540 ttctaaccct catttgcgct tggttgctat tacgagacac aggaagttgc tgagtattag 600 agccgaccca gaggtttggg ttagtttcat gttcgcgacg agagaaggcg aagaagtgga 660 cacccattgc tatggtgaag agcaccgtcc cgacgaggcc gaataagtat tggccaggag 720 tcgtagctat aggtttagtg tctttgttta tcttcttgtc tgtgtcgaat caaaaacatt 780 ccaccacttc tggtgataat atacataaat tctctaacgg tggaacttac agagacggat 840 ctaagtgcat aacatataat cggaactctc ctttagctta taatggaagc tccagcaata 900 acacactctt ctggttgtgt ctgctcggat tgtcaatggt ctggatcgcc tactgtggat 960 acaagagctt gtctggacag tggcattcat gtcaacacga caaaaacgag agaaacttcc 1020 ttcttgagtg ttttgaatga taatgcttgg ttatttgtta ttgctgctgt tatactatgt 1080 ttgtatttca ttatgagcaa gcctcgtgtg gatgtaatgt atacagagtt ccatcaagat 1140 ttaaatggct ttagcatgaa attggctcca ggtgtgccta tcgatccgaa agtcattgca 1200 gctgtaaaga actggcaaaa gtatcctttt gggactggcc ctagagagaa tatggtaagc 1260 agtattgtta gtggtctaag gcatagcttc actatcctac tacttatagt tgtgctattt 1320 gtctacgtgt gtcataatcc ctaaaaatac aaaaatgatt agaccgagat tgatcaactc 1380 ggggcggtgc gagccataga gcacggttgt aggtttaaac ttaaaacctt caagtctcat 1440 tccctagcta ttataaggtt aattgcaaaa acccttatat ctggctaaga tgggagtgcc 1500 gacaagttgt cgggagtgtc aagacacgac acttagtggc tggcgtagac tgctggtatg 1560 tgaactcaga gagttcacat aggtgcaaat cccccgctga aacggagcga tatccgtccc 1620 a 1621

Claims (7)

  1. 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 정방향 프라이머와 서열번호 11 내지 18로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머로 이루어진 땅콩덤불바이러스(Peanut clump virus) 검출용 PCR 프라이머쌍.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 17로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 4 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 4 및 서열번호 16로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 6 및 서열번호 15로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 땅콩덤불바이러스 검출용 PCR 프라이머쌍.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 4 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 땅콩덤불바이러스 검출용 PCR 프라이머쌍.
  4. (a) 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
    (b) 분리된 RNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 시료로부터 땅콩덤불바이러스를 검출하는 방법.
  5. (a) 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
    (b) 분리된 RNA를 주형으로 하고, 제3항의 프라이머쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 PCR 산물을 주형으로 하고, 상기 (b) 단계에서 이용한 프라이머쌍에 대한 네스티드 프라이머쌍(nested primer pair)을 이용하여 nested PCR을 수행하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계의 nested PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 시료로부터 땅콩덤불바이러스를 검출하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 네스티드 프라이머쌍은 서열번호 4 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머쌍에 대해서는 서열번호 6 및 서열번호 15의 프라이머쌍; 또는 서열번호 9 및 서열번호 13으로 표시되는 프라이머쌍에 대해서는 서열번호 10 및 서열번호 14의 프라이머쌍 또는 서열번호 10 및 서열번호 15의 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항의 프라이머쌍을 포함하는 땅콩덤불바이러스 검출용 키트.
KR1020090003925A 2009-01-16 2009-01-16 땅콩덤불바이러스 검출용 ｐｃｒ 프라이머쌍 및 이를 이용한 땅콩덤불바이러스 검출 방법 KR101024115B1 (ko)

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Arch Virol. 2000;145(9):1857-66.
GenBank: AF447399.1
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The Plant Pathology Journal. Vol.20 No.4, 2004. pp302-307

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