KR102173154B1 - 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102173154B1
KR102173154B1 KR1020180145758A KR20180145758A KR102173154B1 KR 102173154 B1 KR102173154 B1 KR 102173154B1 KR 1020180145758 A KR1020180145758 A KR 1020180145758A KR 20180145758 A KR20180145758 A KR 20180145758A KR 102173154 B1 KR102173154 B1 KR 102173154B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dengue virus
denv
seq
detection
primer set
Prior art date
Application number
KR1020180145758A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200060145A (ko
Inventor
박태정
김종길
Original Assignee
주식회사 낙스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 낙스 filed Critical 주식회사 낙스
Priority to KR1020180145758A priority Critical patent/KR102173154B1/ko
Publication of KR20200060145A publication Critical patent/KR20200060145A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102173154B1 publication Critical patent/KR102173154B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/101—Temperature
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 그의 용도에 관한 것으로, 상기 프라이머 세트는 뎅기바이러스를 단시간에, 높은 특이성 및 민감도로 검출하는데 사용할 수 있으므로, 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도{Loop Mediated Isothermal Amplification Primer Set for Detection of Dengue Virus Serotype 1 or 3 and Uses Thereof}
본 발명은 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
뎅기바이러스(dengue virus, DENV)는 플라비바리데과(Flaviviridae)의 플라비바이러스속(flavivirus)에 속하는 바이러스로 네 개의 혈청형(DENV1, DENV2, DENV3, DENV4)으로 분류된다. 열대줄무늬모기나 한줄무늬모기를 통해 감염되며, 사람에게 감염되면 뎅기열, 뎅기 출혈열, 뎅기 쇼크증후군등의 질병이 발생한다. 이러한 질병들은 적절한 치료를 통해 호전될 수 있지만, 치료를 받지 못하면 사망률이 20%까지 증가할 수 있다. 다만, 바이러스 감염에 대한 치료는 바이러스 감염 자체를 치료하는 것이 아니라 증상을 완화시키는 대증요법(Symptomatic treatment)에 의한 것이라는 점에서, 치료법상 한계점이 존재하므로, 사전에 감염을 예방하는 것이 중요하다.
최근까지 개발된 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR) 방법의 종류로는, 증폭에 소요되는 시간을 줄인 래피드 PCR(rapid PCR), 시료의 정제 과정을 생략하는 직접 PCR(direct PCR), 역전사 반응과 PCR을 결합시켜 RNA를 주형으로 사용한 역전사 효소-PCR(reverse transcriptase PCR; RT-PCR), 상온에서 일어나는 비특이 증폭을 획기적으로 감소시켜 PCR 반응의 특이성(specificity)을 개선시킨 핫-스타트 PCR(hot-start PCR), PCR 반응의 실시간 모니터링(monitering)이 가능한 실시간 PCR(real-time PCR) 등이 있다. 이외에도 다양한 PCR 방법 및 관련 기술이 개발되었다.
그러나, 기존의 PCR 방법은 사이클의 반복에 의해 증폭이 진행되므로, 증폭에 많은 시간이 소요되며, 증폭에 사용되는 장치의 구성이 복잡하다. 또한, 증폭을 위한 온도 등의 조건을 최적화하는 데에도 많은 시간이 소요되며, 이에 숙련된 기술을 필요로 하므로, 신속한 바이러스의 검출에 기존의 PCR 방법을 사용하는 것은 적합하지 못하다.
한편, 등온고리매개 증폭(Loop mediated isothermal amplification: LAMP)은 기본적으로 4개 이상의 프라이머를 이용하여, 양끝을 루프모양처럼 합성하여 유전자의 특정 부위를 무한대로 증폭하고, 증폭된 DNA 산물을 형광 검출용 시약을 이용하거나 침전 반응시켜 증폭유무를 확인하는 방법이다. LAMP는 기존 PCR법과 달리 PCR 사이클이 필요하지 않은 Bst 중합효소를 이용하여 등온의 조건에서 반응을 수행하기 때문에, 대상 물질을 30분 내에 검출할 수 있다. 또한, 등온에서 증폭을 진행하기 때문에, 증폭 장치를 간단하게 구성할 수 있어, 휴대하기 용이한 형태로 제작이 가능하므로, 현장에서 신속한 검출에 적합하다.
이에 본 발명자들은 뎅기바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP용 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 뎅기바이러스를 검출함으로써, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허공개 제10-2013-0031909호
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 1 검출용 고리매개등온 증폭(Loop mediated isothermal amplification: LAMP) 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 3 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 1 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 1 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 3 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시료에서 RNA를 분리하는 단계; 및 상기 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 1 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트 또는 서열번호 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 3 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 1 검출용 고리매개등온 증폭(Loop mediated isothermal amplification: LAMP) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 서열번호 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 3 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 제공한다.
뎅기바이러스는 뎅기열의 병인이 되는 RNA 바이러스로써, 플라비바이러스과 플라비바이러스속으로 분류된다. 또한, 뎅기바이러스는 외피막을 가지는 정이십면체의 바이러스로써, DENV-1, 2, 3 및 4의 4가지의 혈청형으로 분류되며, 각 혈청형의 유전자 사이에는 약 65%의 유사성이 있는 것으로 알려져 있다.
고리매개등온 증폭법은 기존의 중합효소연쇄반응법(PCR)과는 달리 가닥 치환 활성(strand displacement activity)이 높은 Bst 중합효소를 사용하여 3단계의 온도변화 없이 일정한 온도에서 접합 및 신장이 가능하기 때문에, 반응 시간이 1시간이내로 짧고, 온도변화에 따른 DNA 손실 및 손상이 없으며, 일정온도만 유지하면 되기 때문에 고가의 장비가 필요 없어 현장 활용성이 높다.
본 발명의 뎅기바이러스에 특이적인 LAMP 프라이머 세트는 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3에 민감하고 특이적이기 때문에 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3을 효과적으로 구분하여 검출할 수 있다. 따라서, 뎅기바이러스 감염의 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 프라이머 세트는 4개의 프라이머를 사용한다는 점에서, 기존의 6개의 프라이머를 사용하는 LAMP 방법 대비 경제적이면서도, 더욱 신속한 뎅기바이러스의 검출이 가능하다.
본 발명에 따른 표적 유전 물질의 등온고리매개 증폭은 하기의 과정으로 수행될 수 있다.
우선, 핵산 성분을 포함하는 표적 유전물질이 포함되어 있는지 판단하고자 하는 시료를 전처리한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 시료는 식품, 천연물 및 생물학적 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "천연물"은 유기체에 의해 생성된 물질을 말하며, 본 발명의 일 구체예에 따른 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 이용하여 상기 생성된 물질에 포함된 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3을 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 개체로부터 분리한 혈액, 땀, 소변, 대변 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
시료의 전처리 방법은 예를 들어, QIAamp® Viral RNA Mini Kit(50)(QIAGEN, 독일)를 사용한 통상적인 RNA 추출 과정일 수 있다.
다음으로, 전처리된 시료와 표적 유전물질에 반응하는 시약을 혼합한다. 예를 들어, 표적 유전 물질에 결합하는 4개의 프라이머 세트(F3, B3, FIP 및 BIP)와 Isothermal Amplification Buffer II, 황산마그네슘(MgSO4), dNTP Mix, Bst 3.0 DNA Polymerase, AMV Reverse Transcriptase 및 EvaGreen® Fluorescent 시약을 사용할 수 있다. 프라이머 세트로는 서열번호 1 내지 4 또는 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트가 사용된다.
본 발명에서는 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 확인하기 위하여 선별을 진행하였다. 그 결과, 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 뎅기바이러스 혈청형 1에 특이적이며, 서열번호 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 뎅기바이러스 혈청형 3에 특이적임을 확인하였다.
그 후, 시약을 혼합한 전처리된 시료를 MiniOpticon Real-Time machine을 이용하여 실시간으로 증폭, 예를 들어, 30분 동안 반응시켜 증폭할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 등온증폭반응은 66.4℃ 내지 69.7℃에서 수행될 수 있다.
등온증폭반응은 서열번호 1 내지 4 또는 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 60℃ 내지 72.0℃에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는, 뎅기바이러스 혈청형 1은 69.7℃에서, 뎅기바이러스 혈청형 3은 66.4℃에서 수행될 수 있다.
또한, 등온증폭반응은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 또는 서열번호 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 6mM 내지 10mM 농도의 MgSO4 조건에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는, 뎅기바이러스 혈청형 1은 6mM에서, 뎅기바이러스 혈청형 3은 8mM의 MgSO4 조건에서 수행될 수 있다.
본 발명의 각 프라이머에는 검출의 편의성을 높이기 위해, 검출용 표지가 추가로 포함될 수 있다. 검출용 표지는 프라이머에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 1 검출용 고리매개등온 증폭(Loop mediated isothermal amplification: LAMP) 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 1 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 3 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 3 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 LAMP 조성물은 LAMP를 위한 중합효소(polymerase), dNTP 혼합물 및/또는 반응완충액(buffer)이 더 포함될 수 있다. 뎅기바이러스는 RNA 바이러스이기 때문에 증폭을 위해서는 역전사(reverse transcription)과정이 추가된 역전사고리매개등온 증폭법(RT-LAMP)이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 LAMP 조성물은 검출의 편의성을 높이기 위해, 검출용 표지 화합물이 더 포함될 수 있다. 검출용 표지 화합물은 증폭과정에서 증폭산물에 포함되거나 증폭산물에 물리적으로 삽입되어 통상적인 방식으로 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물일 수 있다. 예를 들어, 검출 민감도 등을 고려하여 EvaGreen®과 같은 fluorescent DNA binding dye를 사용할 경우, 시각적으로 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3을 특이적으로 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 1 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 1 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 3 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 3 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 증폭 반응을 수행하기 위해 Bst Polymerase, dNTPs 및/또는 완충액 등을 포함할 수 있다 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명 및/또는 LAMP를 수행하는데 부수적으로 필요한 도구나 시약 등이 더 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 시료에서 RNA를 분리하는 단계; 및 상기 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 1 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트 또는 서열번호 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 3 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출 방법을 제공한다.
시료에서 RNA를 분리하는 단계는 핵산 성분을 포함하는 표적 유전물질이 포함되어 있는지 판단하고자 하는 시료로부터 통상적으로 RNA를 분리하기 위하여 사용하는 방법에 의해 RNA를 분리하는 것일 수 있다. 예를 들어, QIAamp® Viral RNA Mini Kit(50)(QIAGEN, 독일)를 사용하여 시료로부터 RNA를 추출할 수 있다.
표적 서열을 증폭하는 단계는 시료로부터 추출한 RNA에 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 1 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트 또는 서열번호 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 3 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트와 LAMP 반응에 필요한 시약, 예를 들어 Isothermal Amplification Buffer II, MgSO4, dNTP Mix, Bst 중합효소 및 AMV Reverse Transcriptase 등을 혼합하여 LAMP 반응액을 제조하고, 이를 LAMP 반응에 일반적으로 사용되는 장치, 예를 들어 MiniOpticon Real-Time machine(BIO-RAD)을 사용하여 증폭하는 것일 수 있다.
또한, 상기 증폭 산물의 검출은 예를 들어, 탁색도, 침전물 생성, SYBR Green I을 이용한 형광 측정, DNA laddering, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
검출의 편의성을 높이기 위해 프라이머에 검출용 표지를 추가하거나 별도의 검출용 표지 화합물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 작업의 용이성, 검출 민감도 등을 고려하여 EvaGreen®과 같은 fluorescent DNA binding dye를 사용할 수 있다. 이 경우, 반응액 중 형광염색제를 실시간으로 검출할 수 있는 장비를 이용하여 별도의 전기영동(electrophoresis)이나 SYBR Green I 등의 추가 없이 실시간으로 증폭을 확인하고, anneal peak를 통해서 표적서열의 증폭 여부를 확인할 수 있다. 형광염색제를 검출할 수 있는 장비 중에는 현재 휴대가 용이하도록 가볍고 작은 크기로 이루어진 장비들이 있으므로, 이러한 장비를 이용하여 본 발명의 검출방법을 수행하면 야외에서도 신속하게 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출이 가능하다.
또한, 본 발명의 검출 방법에 따른 뎅기바이러스의 검출 한계는 뎅기바이러스 혈청형 1(서열번호 1 내지 4)에서 33.3 copies/rxn, 및 뎅기바이러스 혈청형 3(서열번호 9 내지 12)에서 9.59 copies/rxn이므로, 기존의 검출 방법에 비하여 민감도가 매우 우수하다.
따라서, 본 발명의 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 검출 방법을 통하여, 야외에서 뎅기바이러스를 특이적으로 신속하게 진단할 수 있으며, 신속면역진단기법(Rapid immunodiagnostic test, RIDT) 보다는 민감하고 정확하게, 역전사중합효소연쇄반응법(RT-PCR) 보다는 민감하고 신속하게 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3을 검출할 수 있으므로, 뎅기바이러스의 신속진단 및 구별법으로 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명에 따른 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트는 뎅기바이러스를 단시간에 진단하는데 사용할 수 있으며, 우수한 검출 한계를 나타내므로, 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 뎅기바이러스 혈청형 1(A), 혈청형 2(B), 혈청형 3(C) 및 혈청형 4(D)에 대한 본 발명 프라이머(표 1)의 RT-LAMP 반응 최적 온도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 뎅기바이러스 혈청형 1(A), 혈청형 2(B), 혈청형 3(C) 및 혈청형 4(D)에 대한 본 발명 프라이머의 RT-LAMP 반응 최적 MgSO4 농도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 뎅기바이러스 혈청형 1(A), 혈청형 2(B), 혈청형 3(C) 및 혈청형 4(D)에 대한 본 발명 프라이머의 RT-LAMP 반응 검출 한계를 나타낸 그래프이다.
도 4는 뎅기바이러스 혈청형 1(A), 혈청형 2(B), 혈청형 3(C) 및 혈청형 4(D)에 대한 본 발명 프라이머의 RT-LAMP 반응 특이성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 뎅기바이러스 혈청형 1(A), 혈청형 2(B), 혈청형 3(C) 및 혈청형 4(D)에 대한 본 발명 프라이머의 특이성을 UV 광 조사 하에서 시각적으로 확인한 사진이다.
도 6은 뎅기바이러스 혈청형 1(A), 혈청형 2(B), 혈청형 3(C) 및 혈청형 4(D)에 대한 본 발명 프라이머의 특이성을 햇빛 하에서 시각적으로 확인한 사진이다.
도 7은 뎅기바이러스 혈청형 1(A), 혈청형 2(B), 혈청형 3(C) 및 혈청형 4(D)에 대한 기존에 알려진 프라이머(표 2)의 시간별 RT-LAMP 증폭 신호를 나타낸 그래프이다.
도 8은 뎅기바이러스 혈청형 1(A), 혈청형 2(B), 혈청형 3(C) 및 혈청형 4(D)에 대한 본 발명 프라이머의 시간별 RT-LAMP 증폭 신호를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 뎅기바이러스 혈청형 1 내지 4 증폭 프라이머 제작
1-1. 시료 및 장비의 준비
뎅기바이러스(dengue viruse: DENV) 바이러스성 용해물(lysate) 및 정제된 바이러스성 RNA는 한국질병통제센터(청주)와 한국병원성바이러스은행(서울)에서 분양받았다. 바이러스성 RNA는 QIAamp® Viral RNA Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하였고, 뎅기바이러스 특이적 프라이머(Primer)는 제노텍(대전, 한국)으로부터 합성되었다.
10X 등온 증폭 버퍼(Isothermal Amplification Buffer) Ⅱ, 황산 마그네슘(magnesium sulfate), dNTP Mix, Bst 3.0 DNA 중합효소 및 AMV 역전사효소는 New England Biolabs(Ipswich, MA, USA)에서 구입하였다. EvaGreen 형광 DNA 염색시약은 Bio-Medical Science(서울, 한국)에서 구입하였으며, 초순수는 Welgene(경산, 한국)에서 구입하였다.
RNA 농도는 UV-visible 분광광도계(Optizen NANO-Q, Mecasys, 대전, 한국)를 사용하여 측정하였다.
1-2. 프라이머 제작
각 유형의 뎅기바이러스를 스크리닝하기 위해 GenBank(National Center for Biotechnology Information)에서 DENV의 전체 서열을 얻었다. 뎅기바이러스 혈청형 1(FJ687475), 혈청형 2(KP406804), 혈청형 3(KP406805) 및 혈청형 4(KP406806)의 Genbank 번호는 한국질병통제센터(청주)와 한국병원성바이러스은행(서울)에서 제공받았다.
DENV RNA를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머는 Eiken 웹 사이트 (http://primerexplorer.jp/e/)의 Primer Explorer V5 프로그램을 사용하여 디자인하였다. BLAST(basic local alignment search tool)를 사용하여 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머를 표 1과 같이 동정하였고, 설계된 모든 프라이머는 제노텍으로부터 합성되었다.
혈청형 게놈
위치		 프라이머
명칭		 LAMP 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
DENV-1 1247-1426
(180bp)		 F3 AGACACTGCATGGGACTTTG 서열번호 1
FIP TGCGGTTCCAAAAACCTGGTGTGTTCCATAGGAGGGGTGTTC 서열번호 2
B3 AGAGTGACGTGCTCCTTGAA 서열번호 3
BIP ATGGGGTCTTGTTCAGCGGTGAGCCATGTCAGCAGAATCC 서열번호 4
DENV-2 3089-3286
(198bp)		 F3 GTTAAAAGTTGCCACTGGC 서열번호 5
FIP CCAGCGAGATTCTTTGGAATTATCAGTCACACACTCTTTGGAGC 서열번호 6
B3 ACTGTAGTTCCTTTGCAGAA 서열번호 7
BIP CAGTGTCACAACACAATAACAGACCCCATCTCAAGTTTGCCTAGA 서열번호 8
DENV-3 7428-7607
(181bp)		 F3 CACTCTGGGAAGGATCAC 서열번호 9
FIP TGCTAAATAGCTCCCTCTAAAAGATGCTGGGAAGTTCTGGAACAC 서열번호 10
B3 TTTTCCACTTTTCTCCTAAGG 서열번호 11
BIP AGCTGGGCTTGCTTTTTCTATTTCACCTTGTGACCCTGT 서열번호 12
DENV-4 615-817
(203bp)		 F3 ACCGAACCTGAGGACATTGA 서열번호 13
FIP CGTTCCCCACTCTGAGTGCATGTTGCTGGTGCAATCTCACG 서열번호 14
B3 CCCTCTGAGCATGTTTCCAA 서열번호 15
BIP GAAGCGCTCAGTAGCCCTAACACCCCTTCCGATGACATCCA 서열번호 16
실시예 2. LAMP 반응 조건
역전사 등온고리매개 증폭(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification: RT-LAMP) 반응은 25.0㎕ PCR 튜브에 하기의 용액을 혼합한 반응액을 이용하여 수행되었다: 정방향(forward) 및 역방향(backward) 내부 프라이머(inner primer: FIP 및 BIP, 1.6μM) 각각 1.0㎕, 외부 프라이머(outer primer: F3 및 B3, 0.2μM) 각각 1.0㎕, deoxynucleotide solution mixture(1.4mM, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 3.5㎕, 10X 등온증폭버퍼 Ⅱ 2.5㎕(1X), MgSO4(8μM) 1.5㎕, Bst 3.0 DNA 중합효소(320U/㎖) 1.0㎕, AMV 역전사효소(200U/㎖) 0.5㎕, EvaGreen(1X) 0.5㎕, 초순수 9.5㎕, 정제된 DENV RNA 용액 2.0㎕.
음성 대조군으로는 초순수정제수를 사용하였고, LAMP 반응은 60 내지 72℃의 온도에서 30분 동안 BIO-RAD의 MiniOpticon Real-Time machine을 이용하여 수행하였으며, 뎅기바이러스 혈청을 넣은 것과 음성 대조군의 증폭을 실시간으로 비교하였다.
실시예 3. RT-LAMP 조건 최적화
3-1. 뎅기바이러스의 LAMP 반응 온도 최적화
RT-LAMP 분석 조건의 최적화를 위하여, 반응 온도가 RT-LAMP 반응에 미치는 영향을 조사하였다.
구체적으로, BIO-RAD의 MiniOpticon Real-Time machine을 이용하여 60.0℃에서 71.2℃ 사이의 온도에서 30분 동안, 서열번호 1 내지 4(DENV-1), 서열번호 5 내지 8(DENV-2), 서열번호 9 내지 12(DENV-3) 또는 서열번호 13 내지 16(DENV-4)를 사용하여 실시예 2의 방법으로 LAMP 반응을 수행하였으며, BIO-RAD의 CFX Manager 3.1를 통하여 온도 최적화 분석을 진행하였다.
그 결과, DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4의 검출에 대해 각각 69.7℃, 65.0℃, 66.4℃ 및 66.5℃의 온도가 최적의 RT-LAMP 반응 온도임을 확인하였다(도 1).
따라서, 이후의 실험에서는 최적 반응 조건을 나타내는 온도에서 DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4의 검출을 위한 RT-LAMP 분석을 수행하였다.
3-2. 뎅기바이러스의 LAMP 반응 MgSO 4 농도 최적화
황산마그네슘은 RT-LAMP 반응 동안 이중가닥 DNA 사이의 전하 상호 작용을 감소시킬 수 있는 보조 인자로 작용한다고 알려져 있다. 마그네슘은 본질적으로 RT-LAMP 반응을 진행하는데 필수적이지만, 보다 낮거나 높은 농도의 마그네슘은 반응 생성물뿐만 아니라 RT-LAMP 반응에도 강하게 영향을 줄 수 있다.
따라서, RT-LAMP 분석 조건의 최적화를 위하여, 황산마그네슘(MgSO4) 농도가 RT-LAMP 반응에 미치는 영향을 조사하였다.
구체적으로, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM 또는 10mM의 MgSO4 농도 및 DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4에 대해 각각 69.7℃, 65.0℃, 66.4℃ 및 66.5℃의 온도로 반응시킨 것을 제외하면 실시예 3과 동일한 방법으로 LAMP 반응을 수행하였으며, BIO-RAD의 CFX Manager 3.1를 통하여 온도 최적화 분석을 진행하였다.
그 결과, DENV-1 및 DENV-4에서는 6.0mM, DENV-2 및 DENV-3에서는 8.0mM 농도의 황산 마그네슘을 사용할 경우 RT-LAMP 반응이 가장 우수함을 확인하였다(도 2).
따라서, 이후의 실험에서는 최적 반응 조건을 나타내는 황산마그네슘 농도에서 DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4의 검출을 위한 RT-LAMP 분석을 수행하였다.
실시예 4. 뎅기바이러스 검출에 대한 RT-LAMP 분석의 민감도 확인
병원균의 검출 방법은 미량 농도의 병원균 DNA 및 RNA에도 유의적인 검출이 가능한 것이 요구되므로, 다양한 농도의 RNA에 대하여 LAMP 반응을 수행하여 DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4의 검출을 위한 표 1의 프라이머 세트의 민감도를 분석하였다.
구체적으로, 뎅기바이러스 RNA를 초순수로 10배 희석하여 RT-LAMP 반응의 주형으로 사용하였다. RNA 농도는 UV-visible 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 각 뎅기바이러스 혈청형의 카피(copy) 수는 앰플리콘(amplicon) 크기 및 뎅기바이러스 RNA의 농도를 측정하여 계산하였다. DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4의 앰플리콘 크기는 각각 180bp, 198bp, 181bp 및 203bp이다. 분석 효율은 사이클 임계치(Ct) 값과 log10 RNA 카피 수 사이의 보정 그래프(calibration graph)를 작성하여 평가하였다.
그 결과, 사이클 임계치(Ct) 값과 뎅기 바이러스의 농도 사이에 다음과 같이 우수한 선형성이 관찰되었다: DENV-1, 6.23×103 내지 6.23×109copies/㎕; DENV-2, 7.91 내지 7.91×109copies/㎕; DENV-3, 4.97×101 내지 4.97×109copies/㎕; DENV-4, 5.98×102 내지 5.98×109copies/㎕. 또한, DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4 각각에 대해 33.00, 3.55, 9.59 및 9.06copies/㎕의 검출 한계를 확인하였다(도 3).
실시예 5. 뎅기바이러스 검출에 대한 RT-LAMP 분석의 특이성 확인
뎅기바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4를 다른 바이러스들과 구분하여 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 다양한 바이러스의 LAMP 반응에 따른 뎅기바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4의 특이성을 분석하였다.
구체적으로, 뎅기바이러스 혈청형 1 내지 4, 노로바이러스(Norovirus), 로타바이러스(Rotavirus) 및 소바이러스성설사증바이러스(Bovine viral diarrhea)를 사용하였으며, 대조군으로 초순수정제수를 이용하였다. 바이러스의 종류 및 실시예 3에서 확인한 최적의 온도 및 최적의 MgSO4 농도를 사용한 것을 제외하면 실시예 2와 동일한 방법으로 증폭하여 비교하였다.
그 결과, DENV-1은 서열번호 1 내지 4, DENV-2는 서열번호 5 내지 8, DENV-3는 서열번호 9 내지 12, DENV-4는 서열번호 13 내지 16에만 각각 특이적으로 반응함을 확인하였다(도 4).
한편, RT-LAMP 산물은 RT-LAMP 반응 믹스에 형광 염료를 첨가하여 형광의 증가를 모니터링함으로써 검출할 수 있다. RT-LAMP 산물을 시각화하기 위하여, 뎅기바이러스 증폭 산물을 Evagreen® 20㎕로 처리한 다음 365nm에서 UV 광조사 하에서 색상 변화를 관찰하여 표 1 프라이머의 특이성을 확인하였다. EvaGreen 염료는 SYBR Green I은 반응 억제제로 작용할 수 있으므로, SYBR Green I보다 효과적이다. RT-LAMP 분석을 모니터하기 위해 EvaGreen 염료를 상기 RT-LAMP 반응 산물에 첨가하고, 육안으로 색상 변화를 관찰하였다.
그 결과, DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4 RNA의 RT-LAMP 반응 생성물은 녹색 형광을 나타내지만 다른 것들은 365nm에서 UV 광 조사 하에서 주황색 및 황색 형광을 보임을 확인하였다(도 5). 또한, 햇빛에서, DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4 RNA에 대한 RT-LAMP 반응 생성물에서만 밝은 녹색이 관찰되었다(도 6).
상기 결과를 통하여, 표 1의 프라이머가 DENV의 RNA와 특이적으로 결합하여 DENV의 각 혈청형의 구별에 특이적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 뎅기바이러스 검출에 대한 RT-LAMP 분석의 신속성 확인
뎅기바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4의 신속한 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 기존의 뎅기바이러스 프라이머를 사용하여 RT-LAMP 반응의 증폭 신호를 분석하였다.
구체적으로, 표 1의 프라이머, 실시예 3에서 확인한 최적의 온도 및 최적의 MgSO4 농도를 사용한 것을 제외하면 실시예 2와 동일한 방법으로 증폭하여 뎅기바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4에 대한 RT-LAMP 반응의 증폭 신호를 측정하였다. 또한, 표 2의 기존 프라이머(Parida et al., Microbiol. 43 (2005) 2895-2903.)를 사용하여 뎅기바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4에 대한 RT-LAMP 반응의 증폭 신호를 측정하였다.
혈청형 게놈
위치		 프라이머
명칭		 LAMP 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
DENV-1 10469-10667
(199 bp)		 F3 GAGGCTGCAAACCATGGAA 서열번호 17
FIP GCTGCGTTGTGTCTTGGGAGGTTTTCTGTACGCATGGGGTAGC 서열번호 18
B3 CAGCAGGATCTCTGGTCTCT 서열번호 19
BIP CCCAACACCAGGGGAAGCTGTTTTTTTGTTGTTGTGCGGGGG 서열번호 20
FLP CTCCTCTAACCACTAGTC 서열번호 21
BLP GGTGGTAAGGACTAGAGG 서열번호 22
DENV-2 10449-10659
(211 bp)		 F3 TGGAAGCTGTACGCATGG 서열번호 23
FIP TTGGGCCCCCATTGTTGCTGTTTTAGTGGACTAGCGGTTAGAGG 서열번호 24
B3 GTGCCTGGAATGATGCTG 서열번호 25
BIP GGTTAGAGGAGACCCCCCCAATTTTGGAGACAGCAGGATCTCTGG 서열번호 26
FLP GATCTGTAAGGGAGGGG 서열번호 27
BLP GCATATTGACGCTGGGA 서열번호 28
DENV-3 10289-10506
(218 bp)		 F3 GCCACCTTAAGCCACAGTA 서열번호 29
FIP TGGCTTTTGGGCCTGACTTCTTTTTTGAAGAAGCTGTGCAGCCTG 서열번호 30
B3 GTTGTGTCATGGGAGGG 서열번호 31
BIP CTGTAGCTCCGTCGTGGGGATTTTCTAGTCTGCTACACCGTGC 서열번호 32
FLP CCTTGGACGGGGCT 서열번호 33
BLP GGAGGCTGCAAACCGTG 서열번호 34
DENV-4 10289-10517
(229 bp)		 F3 CTATTGAAGTCAGGCCAC 서열번호 35
FIP TGGGAATTATAACGCCTCCCGTTTTTTCCACGGCTTGAGCAAACC 서열번호 36
B3 ACCTCTAGTCCTTCCACC 서열번호 37
BIP GGTTAGAGGAGACCCCTCCCTTTTAGCTTCCTCCTGGCTTCG 서열번호 38
FLP GGCGGAGCTACAGGCAG 서열번호 39
BLP TCACCAACAAAACGCAG 서열번호 40
그 결과, 기존의 프라이머 세트는 증폭 신호를 생성하기 위해 더 긴 시간(30분 이상)을 요구하는 반면(도 7), 표 1의 프라이머 세트를 사용할 경우에는 증폭 신호의 최대 강도가 15분 이내에 달성되었음을 확인하였다(도 8). 또한, 표 1의 프라이머 사용시 기존의 프라이머 대비 높은 강도의 증폭 신호가 효과적으로 생성되었다는 점에서, RT-LAMP 반응 속도를 높이기 위해 표 1의 프라이머가 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
한편, RT-LAMP 반응 생성물의 확인을 위하여 전기영동을 수행하였다.
구체적으로, Real-Time Thermal Cycler(MiniOpticonTM Detector, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 서열을 증폭하고, 겔 전기영동을 수행한 후, ChemiDoc(ChemiDocTM MP Imaging System, Bio-Rad)을 사용하여 증폭된 서열을 확인하였다.
그 결과, 기존의 프라이머(표 2)를 사용할 경우, 뎅기바이러스 RNA의 RT-LAMP 반응 생성물이 프라이머의 이합체화로 인하여 잘 구분되지 않았으나, 표 1의 프라이머 사용시 뎅기바이러스 RNA의 RT-LAMP 반응 생성물이 효과적으로 구분됨을 확인하였다. 또한, 표 1의 프라이머를 사용할 경우, 기존 방법 대비, 뎅기바이러스 혈청형 1, 2 및 4의 신속한 검출이 가능함을 확인하였다(표 3)
분석 방법 검출 대상 검출 한계 반응
시간(분)		 참조문헌
ELISA Structure viral antigens 15 ㎍/㎖ 240 Young et al., Microbiol. 38 (2000) 1053-1057.
Real-time RT-PCR Viral RNA 250 RNA copies/㎖ 180 Sudiro et al., Virol. 63
(2000) 29-34.
Fourplex Real-time RT-PCR Viral RNA 100 PFU/㎖ 75 Johnson et al., Microbiol. 43 (2005) 4977-4983.
Silicon Nanowire Biosensor Peptide nucleic acid 1 fg/㎖ 30 Zhang et al., Actuators B Chem. 146 (2010) 138-144.
RT-LAMP Viral RNA 1 PFU 60 Parida et al., Microbiol. 43 (2005) 2895-2903.
RT-LAMP DENV-1 RNA 33.00 copies/rxn 25 -
RT-LAMP DENV-2 RNA 3.55 copies/rxn 25
RT-LAMP DENV-4 RNA 9.06 copies/rxn 25
상기 결과를 통하여, 본 발명의 프라이머를 사용하여 뎅기바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4를 각각 특이적이고 높은 민감도로 신속하게 RT-LAMP 분석을 통하여 검출할 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Loop Mediated Isothermal Amplification Primer Set for Detection of Dengue Virus Serotype 1 or 3 and Uses Thereof <130> PN180367 <160> 40 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-1_F3 <400> 1 agacactgca tgggactttg 20 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-1_FIP <400> 2 tgcggttcca aaaacctggt gtgttccata ggaggggtgt tc 42 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-1_B3 <400> 3 agagtgacgt gctccttgaa 20 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-1_BIP <400> 4 atggggtctt gttcagcggt gagccatgtc agcagaatcc 40 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-2_F3 <400> 5 gttaaaagtt gccactggc 19 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-2_FIP <400> 6 ccagcgagat tctttggaat tatcagtcac acactctttg gagc 44 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-2_B3 <400> 7 actgtagttc ctttgcagaa 20 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-2_BIP <400> 8 cagtgtcaca acacaataac agaccccatc tcaagtttgc ctaga 45 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-3_F3 <400> 9 cactctggga aggatcac 18 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-3_FIP <400> 10 tgctaaatag ctccctctaa aagatgctgg gaagttctgg aacac 45 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-3_B3 <400> 11 ttttccactt ttctcctaag g 21 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-3_BIP <400> 12 agctgggctt gctttttcta tttcaccttg tgaccctgt 39 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-4_F3 <400> 13 accgaacctg aggacattga 20 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-4_FIP <400> 14 cgttccccac tctgagtgca tgttgctggt gcaatctcac g 41 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-4_B3 <400> 15 ccctctgagc atgtttccaa 20 <210> 16 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-4_BIP <400> 16 gaagcgctca gtagccctaa caccccttcc gatgacatcc a 41 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-1_F3 <400> 17 gaggctgcaa accatggaa 19 <210> 18 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-1_FIP <400> 18 gctgcgttgt gtcttgggag gttttctgta cgcatggggt agc 43 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-1_B3 <400> 19 cagcaggatc tctggtctct 20 <210> 20 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-1_BIP <400> 20 cccaacacca ggggaagctg tttttttgtt gttgtgcggg gg 42 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-1_FLP <400> 21 ctcctctaac cactagtc 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-1_BLP <400> 22 ggtggtaagg actagagg 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-2_F3 <400> 23 tggaagctgt acgcatgg 18 <210> 24 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-2_FIP <400> 24 ttgggccccc attgttgctg ttttagtgga ctagcggtta gagg 44 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-2_B3 <400> 25 gtgcctggaa tgatgctg 18 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-2_BIP <400> 26 ggttagagga gaccccccca attttggaga cagcaggatc tctgg 45 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-2_FLP <400> 27 gatctgtaag ggagggg 17 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-2_BLP <400> 28 gcatattgac gctggga 17 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-3_F3 <400> 29 gccaccttaa gccacagta 19 <210> 30 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-3_FIP <400> 30 tggcttttgg gcctgacttc ttttttgaag aagctgtgca gcctg 45 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-3_B3 <400> 31 gttgtgtcat gggaggg 17 <210> 32 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-3_BIP <400> 32 ctgtagctcc gtcgtgggga ttttctagtc tgctacaccg tgc 43 <210> 33 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-3_FLP <400> 33 ccttggacgg ggct 14 <210> 34 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-3_BLP <400> 34 ggaggctgca aaccgtg 17 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-4_F3 <400> 35 ctattgaagt caggccac 18 <210> 36 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-4_FIP <400> 36 tgggaattat aacgcctccc gttttttcca cggcttgagc aaacc 45 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-4_B3 <400> 37 acctctagtc cttccacc 18 <210> 38 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-4_BIP <400> 38 ggttagagga gacccctccc ttttagcttc ctcctggctt cg 42 <210> 39 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-4_FLP <400> 39 ggcggagcta caggcag 17 <210> 40 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV-4_BLP <400> 40 tcaccaacaa aacgcag 17

Claims (9)

  1. 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 1 검출용 고리매개등온 증폭(Loop mediated isothermal amplification: LAMP) 프라이머 세트.
  2. 서열번호 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 3 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트.
  3. 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 1 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트; 및
    서열번호 9 내지 12의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 3 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트
    를 포함하는 고리매개 등온 증폭 프라이머 세트.
  4. 제 1 항에 따른 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 1 검출용 조성물.
  5. 제 2 항에 따른 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 3 검출용 조성물.
  6. 시료에서 RNA를 분리하는 단계; 및
    상기 RNA를 주형으로 하고, 제 1 항 또는 제 2 항의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
    를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 감염 진단을 위한 정보제공방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 등온증폭반응은 66.4℃ 내지 69.7℃에서 수행되는 것인 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 감염 진단을 위한 정보제공방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 시료는 식품, 천연물 및 생물학적 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 감염 진단을 위한 정보제공방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 개체로부터 분리한 혈액, 땀, 소변, 대변 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 감염 진단을 위한 정보제공방법.
KR1020180145758A 2018-11-22 2018-11-22 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도 KR102173154B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180145758A KR102173154B1 (ko) 2018-11-22 2018-11-22 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180145758A KR102173154B1 (ko) 2018-11-22 2018-11-22 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200060145A KR20200060145A (ko) 2020-05-29
KR102173154B1 true KR102173154B1 (ko) 2020-11-02

Family

ID=70912008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180145758A KR102173154B1 (ko) 2018-11-22 2018-11-22 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102173154B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102413053B1 (ko) 2021-12-10 2022-06-24 주식회사 낙스 도파민이 결합된 흑린 나노 시트 및 금 나노 막대를 포함하는 나노물질 복합체 및 이의 용도

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112013003656A2 (pt) 2010-07-29 2016-08-02 Bigtec Private Ltd sondas e indicadores para a detecção da dengue.
KR101541957B1 (ko) * 2013-06-25 2015-08-05 원광대학교산학협력단 ４가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단용 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Teoh 등, BMC Infectious Diseases, Vol. 13, No. 387, 페이지 1-9 (2013.08.21.)*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102413053B1 (ko) 2021-12-10 2022-06-24 주식회사 낙스 도파민이 결합된 흑린 나노 시트 및 금 나노 막대를 포함하는 나노물질 복합체 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200060145A (ko) 2020-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Deb et al. Development of a multiplexed PCR detection method for Barley and Cereal yellow dwarf viruses, Wheat spindle streak virus, Wheat streak mosaic virus and Soil-borne wheat mosaic virus
JPWO2017212904A1 (ja) 複数のプライマーセットを組み合わせたｌａｍｐ法を用いたアフリカ豚コレラウイルスの迅速検出法
Zhang et al. A loop‐mediated isothermal amplification assay for rapid detection of cyprinid herpesvirus 2 in gibel carp (Carassius auratus gibelio)
KR101149422B1 (ko) 우역 바이러스, 가성우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스의 동시 검출을 위한 다중 프라이머 세트 및 그를 이용한 검출 방법
CN113604612A (zh) 阿龙山病毒环介导等温扩增检测引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用
KR102019804B1 (ko) 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 검출방법
KR102128651B1 (ko) 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 뎅기 바이러스 혈청형 검출세트 및 검출방법
KR102173154B1 (ko) 뎅기바이러스 혈청형 1 또는 3의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도
CN108950080B (zh) 一种基于双重荧光pcr法联合检测辛德毕斯病毒及盖塔病毒的引物探针组及试剂盒
JP2019110810A (ja) イチゴの病原ウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットおよびイチゴの病原ウイルスの検出方法
CN108060271B (zh) 基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法
KR102076343B1 (ko) 실시간 lamp법을 이용한 아데노바이러스 55형 검출용 조성물 및 이의 용도
CN110878380B (zh) 一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的引物组合物、试剂盒及方法
KR102254155B1 (ko) 신경 괴사 바이러스 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머-프로브 세트, 조성물 및 키트
CN110592269A (zh) 草鱼出血病2型病毒（gcrv-2）的raa恒温荧光检测方法及试剂
Wang et al. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for the rapid and accurate diagnosis of Exserohilum turcicum for field applications
KR102202693B1 (ko) A형 간염 바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이의 용도
CN102399903A (zh) 一种基孔肯雅病毒等温扩增检测试剂盒及其引物
KR102143795B1 (ko) 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20200092653A (ko) 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트 및 이의 용도
JP2007135526A (ja) キュウリモザイクウイルスの診断法
KR101024113B1 (ko) 동부퇴록얼룩바이러스 검출용 ｐｃｒ 프라이머쌍 및 이를 이용한 동부퇴록얼룩바이러스 검출 방법
KR20240102034A (ko) 블랙베리퇴록둥근무늬바이러스 신속 진단을 위한 재조합효소-중합효소 증폭 반응용 프라이머 조성물 및 이의 용도
CN110894551A (zh) 草鱼出血病i型病毒（gcrv-i）的raa恒温荧光检测方法及试剂
KR100657866B1 (ko) 네스티드 중합효소 연쇄반응을 이용한 홍반열 리케차 균의검출방법

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant