KR102019804B1 - 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 검출방법 - Google Patents

중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중증열성혈소판증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus, SFTSV) 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 역전사고리매개 등온증폭법에 의하여 중증열성혈소판증후군 바이러스를 빠른 시간에 높은 정확도로 검출할 수 있는 중증열성혈소판증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus, SFTSV) 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.

Description

중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 검출방법{Primer set for detection of SFTSV and SFTSV detection method using the same}
본 발명은 중증열성혈소판증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus, SFTSV) 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 역전사고리매개 등온증폭법에 의하여 중증열성혈소판증후군 바이러스를 빠른 시간에 높은 정확도로 검출할 수 있는 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
중증열성혈소판증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus, SFTS)은 고열, 구토, 설사, 혈소판 감소, 백혈구 감소 및 다발성 장기부전과 같은 증상을 동반하며, 치사율이 6~30%에 이르는 심각한 질환이다(Yu XJ et al., N. Engl. j. Med. 2011; 364:1523-32; Ding F et al Clin Infect Dis 2013; 56: 1682-3)
중증열성혈소판증후군 바이러스는 작은소피참진드기(Haemaphysalis longicornis)를 주요 매개체로 하는 것으로, 상기 진드기는 한국에도 널리 퍼져 있는 것으로 알려져 있다. (Chae JS et al. J Vet Sci 2008; 9: 285-93; Kim CM et al. Appl Environ Microbiol 2006; 72: 5766-76)
중증열성혈소판증후군은 2006년 중국에서 첫 사례가 발견되었고, 2009년 중국에서 최초로 보고되었으며, 중증열성혈소판증후군 바이러스는 2010년 중국의 SFTS 환자로부터 최초로 분리되어 질환의 원인 바이러스로 판명되었다.
중증열성혈소판증후군은 한국의 경우 일본과 더불어 2012년 최초로 보고되었고 매년 감염 환자가 지속적으로 늘어나는 추세이며 치사율 또한 높다. 그러나, 아직까지 백신과 같은 바이러스 특이적 치료 방법은 없기 때문에 정확하고 신속한 조기진단과 확진이 필수적이며 증상에 맞는 치료를 통하여 생존율을 높일 수 있다.
현재 중증열성혈소판증후군 바이러스의 항원 진단법으로 RT-PCR을 수행하는 방법이 있고, 항체 진단법으로는 바이러스를 세포에 감염시킨 후 고정하여 가검 혈청과 반응시킨 후 형광면역 염색하는 간접면역형광항체법 (Indirect Immunofluorescence Assay, IFA)이 이용되지만, 시료의 상태에 따라 비특이 반응이 많아 결과 판단이 어렵고 바이러스를 직접 다루어야 하므로 일반 실험실에서 수행하기 힘든 단점이 있다.
한편, 종래의 바이러스 진단법으로는 전자현미경 또는 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태학적 특징으로 종을 진단하는 것은 거의 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법은 가장 일반적으로 사용되는 진단 방법이나 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하, PCR이라 함) 진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 정확한 진단이 실패하는 경우가 자주 발생한다. 최근에는 바이러스를 진단하기 위하여 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 PCR 방법을 일반적으로 많이 사용하고 있으나, PCR을 이용한 진단 방법은 특이적인 프라이머(primer)의 개발이 매우 중요하며, 증폭된 반응산물을 전기영동(electrophoresis)으로 확인하고, 최종적으로는 염기서열 분석(DNA sequencing)을 해야 하는 일련의 과정을 거쳐야한다. 더불어 이러한 방법은 중합효소연쇄반응기(Thermocycler)와 같은 전문적인 장비 및 이를 운용할 수 있는 전문 인력이 요구되며, 최종 확인을 위한 증폭산물의 염기서열 분석은 고비용 및 고기술력을 요구하는 과정이다. 또한 이러한 일련의 과정들은 수행하는데 있어서 많은 시간이 소요되며 육안으로 식별 가능한 검출법이아니기 때문에 분석 장비가 갖춰지지 않은 현장에서의 활용력은 현저히 떨어진다. 이와 같이 바이러스를 단시간 내에 효과적으로 검출하기 위해서는, 전문장비 없이 현장에서 실시간으로 검출할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 기존의 PCR 방법과 유사하나 기존 PCR 방법은 변성, 접합, 및 신장의 세 단계를 반복적으로 수행하면서 유전자의 증폭을 시행하기 때문에 반응과정 중 지속적으로 온도의 변화를 필요로 하는 반면, 등온증폭법은 고정된 일정 온도에서 접합 및 신장이 가능한 장점을 가지고 있다. 이는 기존 PCR 방법에 사용되는 DNA Taq 중합효소(DNA Taq polymerase)를 사용하는 대신, 핵산말단가수분해(exonuclease) 기능을 갖고 있는 Bst DNA 중합효소(Bst polymerase)를 사용함으로서 열에 의존하지 않고 DNA의 이중나선 구조의 변성을 유발할 수 있기 때문이다. 따라서 등온증폭법은 유전자를 증폭하는 동안 온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭을 가능하게 한다.
따라서, 보다 정확하고 신속한 방법으로 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출을 위한 개선된 검출법이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 중증열성혈소판증후군 바이러스를 특이적으로 검출 할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 프라이머를 포함하는 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 조성물을 이용하여 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해 본 발명은
서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트;
서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및
서열번호 5 및 6으로 이루어진 제3프라이머 세트;를 포함하는, 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
(서열 번호 1) 5'-TTCCCTCAGGCTCAAGAGT-3'
(서열 번호 2) 5'-AGACGGGGTCCAAGCTTAG-3'
(서열 번호 3) 5'-GACAATGTTTCTCTCCCTAA-TGCACATTGCTTGAGGAAGT-3'
(서열 번호 4) 5'-TTCCAAGAGCCAGTGGACTTGC-CCAAACCACACCTCTGACAC-3'
(서열 번호 5) 5'-CAACAAATTTCCCTGTTAGGTGTTC-3'
(서열 번호 6) 5'-GGTGCAAGGCAGAAGATCTG-3'
본 발명에 의한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트는 외부 프라이머, 루프 프라이머, 및 내부 프라이머의 3쌍으로 이루어져 있으며, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기 서열은 제1프라이머 세트로서 외부 프라이머 세트이고, 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열은 제2프라이머 세트로서 루프 프라이머 세트이다. 또한, 서열번호 5 및 6으로 표시되는 염기서열은 내부 프라이머 쌍으로서 제3프라이머 세트이다.
본 발명에 의한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트는 중증열성혈소판증후군 바이러스 RNA를 표적으로 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA, RNA 표적의 복합도 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 조건에 의존한다.
본 발명에서 "검출"은 화학 분석에서, 시료 속에 화학종이나 미생물 따위의 존재 유무를 알아내는 것으로, 본 발명에서는 중증열성혈소판증후군 바이러스를 검출하는 것을 의미한다.
본 발명의 각 프라이머에는 검출의 편의성을 높이기 위해, 검출용 표지를 추가 구성할 수 있다. 검출용 표지는 프라이머에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등일 수 있으며, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 및 NED 등이 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
본 발명에 의한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 반응용액 조성물에는 제1프라이머 세트, 제 2 프라이머 세트 및 제 3 프라이머 세트가 각각 5uM, 80uM, 및 20uM의 농도로 함유되는 것이 야외 중증열성혈소판증후군 바이러스의 효율적인 검출을 위해 바람직하다.
본 발명에 의한 프라이머 세트는 역전사고리매개등온증폭법 (Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP)에 의해 중증열성혈소판증후군 바이러스를 검출하기 위해 사용되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 프라이머 세트는 역전사고리매개등온증폭법 (Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP)에 이용하기 위한 것이며, RNA를 대상으로 RT를 먼저 수행하여 만들어진 cDNA를 이용하여 2차적으로 LAMP법을 수행할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
역전사고리매개 등온증폭법 (Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP)은 기존의 PCR과는 달리 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 따라서, 전문 진단은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단이나 현장 진단용 등으로 이용 가능하다.
본 발명에 있어서, "RT-LAMP"는 박테리아 또는 바이러스로 야기된 질병을 진단하고, PCR의 단점을 보완한 진단법으로, PCR과는 달리 일정한 온도에서 어닐링(annealing) 및 신장(extention)이 가능하여 온도조절장치가 필요하지 않으며, 일정한 온도조건에서 증폭시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 중증열성혈소판증후군 바이러스 는 분야바이러스(Bunyavirus)에 속하는 SFTS 바이러스 HB29 및 그 유사 변종을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 프라이머 세트는 중증열성혈소판증후군 바이러스 RNA를 표적으로 하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 RT-LAMP 프라이머가 중증열성혈소판증후군 바이러스의 L분절 RNA 서열 4393 내지 4598에 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 조성물에는 역전사고리매개등온증폭을 위한 중합효소(polymerase), dNTP혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 또는 반응완충액(buffer)이 더 함유될 수 있다. 중증열성혈소판증후군 바이러스는 RNA 바이러스이기 때문에 증폭을 위해서는 역전사(reverse transcription)과정이 추가된 역전사고리매개등온증폭법(RT-LAMP)이 이용되어야 한다. 따라서 기존의 고리매개등온증폭법(LAMP)에서 주로 사용되어진 Bst polymerase 대신 보다 빠른 증폭 능력과 강력한 역전사효소능을 가지고 있는 GspSSD DNA polymerase를 함유하는 것이 바람직하다.
검출의 편의성을 높이기 위해 프라이머에 검출용 표지를 추가하거나 별도의 검출용 표지 화합물을 사용할 수 있다. 이들 중에서도 본 발명에서는 작업의 용이성, 검출 민감도 등을 고려하여 EvaGreenㄾ과 같은 fluorescent DNA binding dye, 지시약을 사용하는 것이 바람직하다.
이 경우 반응액 중 형광염색제을 실시간으로 검출할 수 있는 장비를 이용하여 별도의 전기영동(electrophoresis)이나 SYBR Green I 등의 추가 없이 실시간으로 증폭을 확인하고, anneal peak를 통해서 표적서열의 증폭 여부를 확인할 수 있다. 형광염색제를 검출할 수 있는 장비 중에는 현재 휴대가 용이하도록 가볍고 작은 크기로 이루어진 장비들이 있어 이러한 장비를 이용하여 본 발명의 검출방법을 수행하면 야외에서도 즉시 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출이 가능하다.
본 발명에 의한 상기의 프라이머 세트를 포함하는 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 조성물에는 반응용액 조성물에 역전사고리매개등온증폭을 위한 중합효소(polymerase), dNTP 또는 반응완충용액이 함유되어 있지 않을 경우, 이들이 별도로 포함될 수 있으며, 이외에도 역전사고리매개등온증폭반응을 수행하는데 부수적으로 필요한 도구나 시약 등이 더 포함될 수 있다.
구체적으로 본 발명에 의한 상기의 프라이머 세트를 포함하는 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 조성물에는 pH 의 변화에 따라 색상이 변화하는 지시약을 더 포함하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명은
시료의 RNA를 추출하는 단계;
상기 RNA를 주형으로 역전사반응을 수행하여 전체 cDNA(total cDNA)를 합성하는 단계;
상기 cDNA를 주형으로 제 5 항에 따른 조성물을 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법.을 제공한다.
또한, 본 발명에 의한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법에서 상기 등온증폭반응은 60℃ 내지 65℃에서 20분 내지 40분동안 수행하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법에서 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법에서 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 지시약의 색상 변화에 의해 증폭 산물을 검출하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 지시약으로 페놀 레드를 사용하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법에서 상기 프라이머 세트는 RT-LAMP 프라이머가 중증열성혈소판증후군 바이러스 RNA의 L분절 서열 4393 내지 4598에 결합하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 의한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 키트는 역전사고리매개등온증폭반응을 수행하는데 부수적으로 필요한 도구나 시약 등이 더 포함될 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 키트는 밀폐된 공간에 철을 수용하고, 철의 산화 반응에 의해 발열하는 휴대용 열원을 더 포함하는 것이 가능하다. 구체적으로 등온증폭반응이 수행되는 60℃ 내지 65℃의 온도를 유지할 수 있는 시중에서 판매되는 핫팩, 손난로 등을 더 포함하는 것이 가능하다.
본 발명에 의한 중증열성혈소판증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus, SFTSV) 검출용 프라이머 세트는 역전사 고리 매개 등온 증폭법(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)을 이용하여 중증열성혈소판증후군 바이러스를 단시간에 높은 민감도와 특이도로 감지할 수 있다.
본 발명에 의한 중증열성혈소판증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus, SFTSV) 검출용 키트는 시중에 유통 되는 휴대용 열원인 손난로 또는 핫팩을 사용하여 별도의 고가의 검출 장치 없이 눈으로 중증열성혈소판증후군 바이러스의 감염 여부를 장소에 구애 받지 않고 높은 민감도와 특이도로 빠르고 정확하게 감지 할 수 있다.
도 1 및 도 2는 역전사 고리 매개 등온 증폭법(RT-LAMP)을 사용하기 위한 프라이머 세트를 나타낸 것이다.
도 3은 중증열성혈소판증후군 바이러스에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP의 민감도를 RT-PCR 및 real time PCR과 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 중증열성혈소판증후군 바이러스에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP의 특이도를 RT-PCR 및 real time PCR과 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 손난로를 이용한 중증열성혈소판증후군 바이러스의 검출방법의 모식도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출을 위한 표적 부위 선정
인간에서 중증 열성 혈소판 감소 증후군을 유발시키는 바이러스의 검출을 위한 표적 부위를 선정하기 위하여 미국 국립 생물 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information, NCBI)에서 제공하는 154개의 바이러스의 서열을 비교분석 하여 불변부위를 선정하였다.
<실시예 2> 중증열성혈소판증후군 바이러스 특이적 프라이머 디자인
중증열성혈소판증후군 바이러스는 S(Small)분절, M(Medium)분절, L(Large)분절로 구성되는 3개의 ssRNA 분절을 가진다.
그 중 6368개의 뉴클레오티드로 구성된 RNA dependent RNA polymerase 단백질을 암호화하는 L분절에서 RT-LAMP에 이용 가능한 하기 6개의 프라이머 세트를 제작하였다(도1, 도2)
(서열 번호 1) 5'-TTCCCTCAGGCTCAAGAGT-3'
(서열 번호 2) 5'-AGACGGGGTCCAAGCTTAG-3'
(서열 번호 3) 5'-GACAATGTTTCTCTCCCTAA-TGCACATTGCTTGAGGAAGT-3'
(서열 번호 4) 5'-TTCCAAGAGCCAGTGGACTTGC-CCAAACCACACCTCTGACAC-3'
(서열 번호 5) 5'-CAACAAATTTCCCTGTTAGGTGTTC-3'
(서열 번호 6) 5'-GGTGCAAGGCAGAAGATCTG-3'
<실시예 3> 역전사고리매개 등온증폭법 수행 및 민감도 측정
상기 실시예 2에서 디자인된 중증열성혈소판증후군 바이러스에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 역전사고리매개 등온증폭법을 수행하고 민감도를 측정하였다.
역전사고리매개 등온증폭법 수행을 위하여 2㎕의 RNA(lane 1: CB/2014, lane 2: CB/2015, lane3: CB/2016, N,C: negative control), 1㎕의 외부 프라이머 (F3, B3; 5uM), 1㎕의 내부 프라이머 (FIP, BIP; 80uM), 1㎕ 루프 프라이머 (LF, LB; 20uM) 및 5ul의 2x Master Mix(WarmStart Colorimetric LAMP 2x Master Mix)로 조성물을 만들었다.
혼합물을 65℃ 에서 10 분, 15 분, 20 분, 30 분 동안 반응시킨 다음, 85 ℃에서 5 분간 비활성화 하였다.
도 2에서 보는 바와 같이 튜브 내 증폭 생성물의 양성 반응은 지시약 색 변화에 의해 직접적으로 검출 가능했다. 지시약으로는 페놀레드(phenol-red)를 사용하였으며, 페놀레드 용액은 pH 6.4 이하에서는 노란색, pH 7.0에서는 분홍색, pH 7.4 이상에서는 적색을 나타낸다.
음성 튜브는 분홍색을 유지하는 반면, 양성 튜브는 노란색으로 나타나고 증폭 생성물은 2% 아가로스 젤 전기영동에 의해 확인되었다. 튜브의 색 변화는 20분부터 확인할 수 있었다.
<비교예 1> one-step RT-PCR 에 의한 검출
비교예 1로서 중증열성혈소판증후군 바이러스 RNA를 사용하여 One-step RT-PCR을 실시한 뒤 전기영동 하였다.
바이러스는 세포에서 증식 후 CPE(cytopathic effect)를 확인한 뒤 -70 에서 얼렸다 녹이기를 2회 반복하고 원심을 돌려 수확하였다. 바이러스 상층액으로 RNA/DNA extraction kit(Intron)을 사용하여 각 바이러스의 핵산을 추출하고 -70에 보관하였다. 추출 과정은 kit의 매뉴얼을 따랐다.
-70℃ 에서 꺼내 녹인 RNA를 TOPscriptTM One-step RT PCR Kit (Enzynomics, Daegeon, KOREA)을 사용하여 역전사반응 42℃ /30 분, DNA 변성 95℃/10분 수행 후 DNA 변성 95℃/30초, 프라이머 어닐링 60℃에서 30 초, 신장반응 72℃에서 30초의 과정을 35회 반복 후 72℃ 에서 5분의 신장반응 조건으로 One-step RT-PCR 과정을 진행하였고, 그 결과는 도 3C에 나타내었다.
<비교예 2> real-time PCR에 의한 검출
TOPrealTM One-step RT qPCR Kit (SYBR Green, low Rox) (Enzynomics, Daegeon, KOREA)을 사용하여 역전사반응 42℃/30 분, DNA 변성 95℃/10 분 수행 후 DNA 변성 95℃/30초, 프라이머 어닐링 60℃에서 30초, 신장반응 72 ℃에서 30초의 과정을 35회 반복 후 72℃에서 5분의 신장반응 조건으로 real-time PCR 실험을 진행하고 그 결과를 도 3d 에 나타내었다.
도 3d 에서 보는 바와 같이 본 발명의 실시예에 의하여 중증열성혈소판증후군 바이러스에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 역전자등록매개 등온증폭벅이 비교예의 one-step RT-PCR이나 real-time PCR보다 높은 민감도를 보이는 것을 확인 하였다.
<실시예 4> RT-LAMP와 one-step RT-PCR 및 real-time PCR의 특이도 비교측정
임상 샘플에서 RT-LAMP의 특이성을 평가하기 위해 8개의 혈청 샘플을 역전사 고리 매개 등온 증폭법(도 4a), one-step 역전사 중합효소연쇄반응법(도 4b), 실시간 중합효소연쇄반응법(도 4c)을 적용 하였다.
세 가지 실험방법을 모두 비교해 보았을 때 모두 공통적으로 확인된 8개의 샘플 중 하나의 양성 샘플을 확인 할 수 있었다. 또한 유사한 임상 증상을 일으킬 수 있는 다른 바이러스(JEV, Dengue1-4, EV71, Echo 6, E18, Coxakie B5, Zika, H1, H3, B, MERS)의 RNA를 주형으로 하여 실험 하였을 때 다른 바이러스와의 교차 반응 없이 오직 중증열성혈소판증후군 바이러스만 특이적으로 검출 할 수 있음을 확인하였다(도 4d,f).
<실시예 5> 휴대용 열원인 손난로를 이용한 중증열성혈소판증후군 바이러스 탐침
역전사 고리 매개 등온 증폭법 반응은 전사 및 증폭 cDNA를 역전시키기 위해 60 ℃ 내지 65℃에서 20분내지 40분 이상 동안 일정한 온도가 필요하다.
본 발명에서는 2개의 손난로를 쌓아 온도를 65℃로 유지시킨 다음 온도 확인 스티커를 부착하여 온도를 쉽게 확인 할 수 있는 간단한 검출 과정을 나타내었다(도 5a).
그 다음 도4a와 같은 방법으로 실험을 진행하였고, 그 결과 이전의 결과보다 민감도가 10분 정도 늦었지만 중증열성혈소판증후군 바이러스가 특이적으로 검출되는 것을 확인 하였다(도 5b).
<110> CHUNGBUK UNIVERSITY <120> Primer set for detection of SFTSV and SFTSV detection method using the same <130> DP-2017-0187 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> primer <400> 1 ttccctcagg ctcaagagt 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> primer <400> 2 agacggggtc caagcttag 19 <210> 3 <211> 40 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> primer <400> 3 gacaatgttt ctctccctaa tgcacattgc ttgaggaagt 40 <210> 4 <211> 42 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> primer <400> 4 ttccaagagc cagtggactt gcccaaacca cacctctgac ac 42 <210> 5 <211> 25 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> primer <400> 5 caacaaattt ccctgttagg tgttc 25 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> primer <400> 6 ggtgcaaggc agaagatctg 20

Claims (12)

  1. 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트;
    서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및
    서열번호 5 및 6으로 이루어진 제3프라이머 세트;를 포함하는,
    중증열성혈소판증후군 바이러스(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus, SFTSV) 검출을 위한 역전사고리매개 등온증폭(Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP)용 프라이머 세트.
    (서열번호 1) 5'-TTCCCTCAGGCTCAAGAGT-3'
    (서열번호 2) 5'-AGACGGGGTCCAAGCTTAG-3'
    (서열번호 3) 5'-GACAATGTTTCTCTCCCTAATGCACATTGCTTGAGGAAGT-3'
    (서열번호 4) 5'-TTCCAAGAGCCAGTGGACTTGCCCAAACCACACCTCTGACAC-3'
    (서열번호 5) 5'-CAACAAATTTCCCTGTTAGGTGTTC-3'
    (서열번호 6) 5'-GGTGCAAGGCAGAAGATCTG-3'
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 중증열성혈소판증후군 바이러스 RNA를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 RT-LAMP 프라이머가 중증열성혈소판증후군 바이러스 RNA의 L분절 서열 4393 내지 4598에 결합하는 것을 특징으로 하는 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 프라이머 세트.
  5. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 하나의 항의 프라이머 세트를 포함하는
    중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 조성물.
  6. 분리된 시료의 RNA를 추출하는 단계;
    상기 RNA를 주형으로 역전사반응을 수행하여 전체 cDNA(total cDNA)를 합성하는 단계;
    상기 cDNA를 주형으로 제 5 항에 따른 조성물을 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계;
    상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는
    중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 등온증폭반응은 60℃ 내지 65℃에서 20분 내지 40분동안 수행하는 것을 특징으로 하는 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 하는,
    중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 지시약의 색상 변화에 의해 증폭 산물을 검출하는 것인
    중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 지시약은 페놀 레드인 것인
    중증열성혈소판증후군 바이러스 검출 방법
  11. 제5항의 조성물을 포함하는 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 키트.
  12. 제11항에 있어서,
    휴대용 열원을 더 포함하는 것인 중증열성혈소판증후군 바이러스 검출용 키트.


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