KR102141369B1 - 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 이를 이용한 중증열성혈소판감소증후군의 진단방법 - Google Patents

중증열성혈소판감소증후군 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 이를 이용한 중증열성혈소판감소증후군의 진단방법 Download PDF

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이유미
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Abstract

본 발명은 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 이를 이용한 중증열성혈소판감소증후군의 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머쌍; 및 서열번호 4의 프로브;를 포함하는 중증열성혈소판감소증후군(Sever Fever with Thrombocytopenia Syndrome; SFTS) 바이러스 유전자 검출용 조성물, 상기 SFTS 바이러스 유전자 검출용 조성물을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 진단용 키트 및 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 감염 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 SFTS 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 이를 이용한 SFTS 진단방법은 SFTS 바이러스의 S 단편 유전자를 특이적으로 검출할 수 있으며, 한국, 중국, 일본의 다양한 계통군의 SFTS 바이러스를 모두 검출가능하며, 무엇보다 기존 알려진 검출 방법에 비해 정확도 및 민감도가 우수할 뿐만 아니라 빠른 시간 안에 SFTS 바이러스의 검출이 가능하므로, 중증열성혈소판감소증후군을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있다.

Description

중증열성혈소판감소증후군 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 이를 이용한 중증열성혈소판감소증후군의 진단방법{Composition for detecting Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome viral RNA and method of diagnosing Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome using the same}
본 발명은 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 이를 이용한 중증열성혈소판감소증후군의 진단방법에 관한 것이다.
중증열성혈소판감소증후군(Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)은 SFTS 바이러스에 의해서 발생하는 급성 발열성 질환으로 백혈구, 혈소판 수치 감소, 간기능 수치 상승, 단백뇨 등의 증상을 특징으로 한다. SFTS 바이러스에 감염된 진드기가 사람을 물어 조직액을 흡입함을 통해 감염이 이루어지며, 매개체로 Haemaphysalis longicornis (작은소참드기), Amblyomma testudinarium(뭉뚝 참진드기), Ixodes nipponensis (일본참진드기) 등이 있다.
전국적으로 SFTS 환자 발생이 증가추세에 있고, 사망률은 SFTS 인지도 증가에 따라 2013년 이후 2016년까지 47.6%, 29.1%, 26.6%, 11.5%로 감소하는 추세였으나 2017년 사망 환자수가 급격히 증가하여 22.3%로 전년대비 10.8% 증가하였다. 따라서 지구 온난화로 인한 진드기 개체수 증가로 SFTS 환자는 계속 증가할 것으로 예상되므로 SFTS 감염에 대한 신속하고 정확한 진단이 환자의 예후 개선을 위해 필수적이다.
현재, 중증열성혈소판감소증후군의 진단은 환자의 혈액을 이용하여 바이러스를 분리하는 방법, 환자의 혈청을 이용하여 IFA나 ELISA 분석을 통해 항체가의 상승을 확인하는 방법, 환자의 혈청이나 혈장을 이용하여 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real time RT-PCR)이나 nested RT-PCR로 환자의 혈액내의 SFTS 바이러스 RNA를 증폭하여 검사하는 방법이 있다.
이 중에서 바이러스를 배양하여 진단하는 방법은 BSL3 시설이 필요하며, 배양되는데 시간이 다소 걸릴 수 있어 일반병원에서 시행하기 어려우므로, 주로 진단에 사용되는 검사 방법들은 혈청학적 검사인 간접면역형광항체법, 면역효소법이 가장 흔히 사용되고 있다. 그러나 이러한 방법들 또한 다른 병원체와 교차반응으로 위양성 반응이 있고, 증상 발생 후 항체 형성까지 수일이 소요되어 질병의 조기에 내원하여 검사를 시행할 경우 민감도가 낮으며, 확진을 위해서는 추적 검사가 필요하다는 단점이 있다.
특히, SFTS 바이러스를 질병 초기에 신속하게 진단하기 위해 환자의 혈액에서 바이러스의 특이 유전자를 검출하는 PCR 법에는 전통적인 방법에 의해 이루어지는 conventional RT-PCR과, 이를 변형하여 conventional RT-PCR 보다 100배 더 민감한 nested RT-PCR 방법이 있고, 또한 PCR이 진행되는 중에 결과를 실시간으로 확인할 수 있는 실시간(real time) RT-PCR 방법 등이 있다. 중증열성혈소판감소증후군 바이러스는 단일가닥 RNA 바이러스로 Bunyaviridae과, phlebovirus 속에 속하며, 바이러스 유전체는 Large(L), Medium(M), Small(S) 단편(segment)으로 구성되어 있다. SFTS 바이러스를 검출하기 위한 RT-PCR 진단방법으로 이들 3개의 단편(L, M, S segment)을 타겟으로 실시간 RT-PCR 및 nested RT-PCR법이 주로 이용되고 있으나, nested RT-PCR의 경우 PCR을 2번 시행하여 민감도가 상승하지만, 2회의 PCR 수행에 의해 필요 이상의 인력 및 시간이 소요되고, 잠재적인 오염가능성이 더 높아 단 한번으로도 민감도가 우수한 새로운 진단법의 개발이 매우 절실한 실정이다.
한편, SFTS 바이러스의 3개의 단편은 RNA-dependent RNA polymerase, RdRp를 암호화하는 L 단편, 바이러스 막 단백질의 구성성분인 glycoprotein(Gn과 Gc)을 암호화하는 M 단편, 바이러스 핵단백질로 SFTS 바이러스 유래 단백질 중 발현양이 많으며 감염숙주로 하여금 세포성 면역반응을 유발하는 nucleocapsid protein(NP)과 면역회피 기능을 하는 nonstructural protein (NSs)를 암호화하는 S 단편으로 구성되어있다. SFTS는 한국, 중국, 일본이 주로 유행지역으로 SFTS 바이러스의 M 단편과 S 단편의 염기서열을 토대로 계통분석 시 각 나라별 발생하는 바이러스의 유전자 서열이 서로 달라 Japanese(J) clade, Chinese(C) clade, 및 Korean(K) clade로 분류가능하다.
이에 SFTS 감염에 대한 신속하고 정확한 진단 및 치료를 위해 Japanese(J) clade, Chinese(C) clade 및 Korean(K) clade의 SFTS 바이러스 유전자를 질병초기에 신속하게 모두 진단할 수 있는 민감도와 특이도가 우수한 진단방법의 개발이 무엇보다 필요하다.
대한민국 공개특허 10-2019-0037027
따라서, 본 발명에서는 이러한 점을 감안하여, SFTS 바이러스 유전자 검출용 조성물을 제공하고, 이를 통해 SFTS 바이러스의 확인 및 중증열성혈소판감소증후군의 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 SFTS 바이러스 유전자 검출용 조성물을 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 감염 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 쌍; 및 서열번호 4의 프로브;를 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군(Sever Fever with Thrombocytopenia Syndrome; SFTS) 바이러스 유전자 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머쌍; 및 서열번호 4의 프로브;는 서열번호 1(SFTSV S 단편의 염기서열)로 이루어진 중증열성혈소판감소증후군(Sever Fever with Thrombocytopenia Syndrome) 바이러스의 S 단편(Small segment; S segment)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 SFTS 바이러스 유전자 검출용 조성물을 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은, (1) 중증열성혈소판감소증후군의 감염이 의심되는 환자에서 분리된 시료에서 바이러스성 RNA를 분리하는 단계; (2) 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (3) 상기 단계 (2)에서 합성한 cDNA를 주형으로 하고, 제3항의 키트를 사용하여 실시간 RT-PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 (4) 상기 단계(3)을 통해 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 유전자를 확인하는 단계;를 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 감염 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 (1)의 시료는 포유동물로부터 수득한 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 소변; 또는 참진드기;일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 (2)에서 상기 RNA로부터 cDNA 합성은 SFTS 바이러스의 RNA 유전체로부터 역전사효소 (reverse transcriptase)의 작용을 통한 역전사(reverse transcription) 반응을 별도로 수행하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 (4)에서 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 유전자의 확인은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 (4)에서 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 유전자는 서열번호 1로 이루어진 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 S 단편(Small segment; S segment)일 수 있다.
본 발명에 따른 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 이를 이용한 SFTS 진단방법은 SFTS 바이러스의 S 단편 유전자를 특이적으로 검출할 수 있으며, 기존 알려진 검출 방법에 비해 정확도 및 민감도가 우수할 뿐만 아니라 빠른 시간 안에 SFTS 바이러스의 검출이 가능하므로, 중증열성혈소판감소증후군을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에서 고안한 SFTS 바이러스 유전자 검출용 프라이머 및 프로브를 이용한 SFTS 바이러스 검출한계를 확인하기 위해 실시간 RT-PCR 수행 후, LOD 값을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 SFTS 의심 환자의 입원 당일 수득한 검체를 대상으로 본 발명의 SFTS 바이러스 유전자 검출용 프라이머 및 프로브를 이용한 SFTS 검출 민감도 및 특이도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 SFTS 의심 환자의 입원 기간 동안 환자로부터 수득한 검체를 대상으로 본 발명의 SFTS 바이러스 유전자 검출용 프라이머 및 프로브를 이용한 SFTS 검출 민감도 및 특이도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 본 발명의 방법에 따른 SFTS 검출 특이도 분석을 위해 음성대조군으로 사용한 세균과 바이러스들을 기재한 목록이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에서 분석한 각 환자 시료의 SFTS 바이러스의 M 단편 염기서열을 토대로 제작한 SFTSV의 계통수로서 SFTS 바이러스가 바이러스 유전자 염기서열에 따라 Korea clade(K1~K4), Japan clade(J1~J3) 및 China clade(C1~C4)로 분류되는 것을 확인할 수 있다.
도 6은 진드기를 이용한 실험으로 6A는 참진드기 시료를 대상으로 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 RT-PCR 분석을 통해 SFTSV 검출 가능함을 확인한 결과이고, 6B는 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 중증열성혈소판감소증후군(Sever Fever with Thrombocytopenia Syndrome; SFTS) 바이러스 유전자를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 새로운 검출용 조성물을 제공함에 특징이 있다.
본 발명자들은 SFTS 감염에 대한 정확하고 신속한 진단 및 치료를 위해, SFTS 바이러스 특이 유전자를 검출할 수 있는 방법을 연구하던 중, 동정된 SFTS 바이러스의 S 단편(Small segment; S segment)에 특이적으로 결합하여 SFTS 바이러스를 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 발굴하였다.
한편 앞서 종래기술에서도 기술한 바와 같이, 중증열성혈소판감소증후군(Sever Fever with Thrombocytopenia Syndrome; SFTS) 바이러스는 단일가닥 RNA 바이러스로 Bunyaviridae과, phlebovirus 속에 속하며, 바이러스 유전체는 3개의 단편(segment)으로 구성되어 있다. SFTS 바이러스의 3개의 단편은 RNA-dependent RNA polymerase, RdRp를 암호화하는 L 단편(Large segment, L segment), 바이러스 막 단백질의 구성성분인 glycoprotein(Gn과 Gc)을 암호화하는 M 단편(Medium segment, M segment), 바이러스 핵단백질로 SFTS 바이러스 유래 단백질 중 발현양이 많으며 감염숙주로 하여금 세포성 면역반응을 유발하는 nucleocapsid protein (NP)과 면역회피 기능을 하는 nonstructural S protein (NSs)를 암호화하는 S 단편(Small segment, S segment)으로 구성되어있다. 보고에 따르면 Bunyaviruses의 S 단편 내에서 nonstructural S protein(NSs)은 바이러스가 인간의 선천적인 항바이러스 방어에 대항하도록 하므로 NS 단백질은 바이러스 감염에 있어 주요한 독력 결정인자중의 하나로 잘 알려져 있다.
본 발명에서는 한국의 환자 및 매개체에서 분리된 SFTS 바이러스 유전자의 3개의 단편 중, S 단편(Small segment, S segment) 내에서 nonstructural S protein(NSs)유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 발굴하기 위한 실험을 수행하였고, 각기 다른 염기서열로 구성된 많은 프라이머 및 프로브들 중에서 SFTS 바이러스 유전자에 대해 민감도 및 특이도가 월등히 우수한 프라이머 및 프로브를 발굴하였으며, 발굴된 프라이머를 SFTS-S 583F 프라이머(5-AGAGGMATGAGCTTGAAC-3; 서열번호 2) 및 SFTS-S 653R 프라이머(5-TCCCAACAGTCTAAYAGA-3; 서열번호 3) 명명하였고, 상기 프로브는 SFTS-S 602P 프로브(5-ACCACTTATTCACTTCTTCCTCATTGC-3; 서열번호 4)로 명명하였다.
여기서 상기M은 A 또는 C 염기일 수 있고, 상기 Y는 C 또는 T 염기일 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군(Sever Fever with Thrombocytopenia Syndrome; SFTS) 바이러스 유전자 검출용 조성물을 제공함에 특징이 있다.
또한 본 발명에서 상기 프라이머 및 프로브는 중증열성혈소판감소증후군(Sever Fever with Thrombocytopenia Syndrome) 바이러스의 S 단편(Small segment; S segment)의 nonstructural S protein(NSs)유전자에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 S 단편은 서열번호 1로 이루어진 염기서열을 갖는다.
또한 본 발명의 실시예 1에서는, SFTS 바이러스 유전자 검출 또는 진단을 위해 새로운 프라이머와 프로브를 디자인하였다. 실시예 2에서는 실시예 1에서 SFTS 바이러스 유전자 검출 또는 진단을 위한 디자인한 프라이머와 프로브들을 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행하여 최적의 프라이머와 프로브를 선별하였다. 본 발명에서 발굴한 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머쌍 및 서열번호 4의 프로브를 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행하여 SFTS 바이러스의 검출능을 분석한 결과, 다른 염기서열로 구성된 프라이머 및 프로브들에 비해 본 발명의 프라이머 및 프로브를 사용한 경우, 민감도 및 특이도가 가장 우수한 것으로 나타났고, 나아가 종래 사용되는 SFTS 바이러스 검출법에 비해서도 더 우수한 민감도 및 특이도를 보임에 따라, 본 발명이 종래 방법에 비해 SFTS 바이러스 유전자를 더 높은 정확도와 민감도로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 실시예 2에서는, 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머쌍 및 서열번호 4의 프로브를 이용한 실시간 RT-PCR을 통해, 71 bp의 크기를 갖는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 SFTS 바이러스의 S 단편의 증폭산물을 확인할 수 있었으며, 구체적으로 상기 71 bp의 염기서열은 agaggaatgagcttgaaccaccacttattcacttcttcctcattgcgtaagcctctattagactgttggga(서열번호 5)이다.
또한 본 발명에 따른 상기 SFTS 바이러스 유전자 검출용 조성물은 SFTS 바이러스의 S 단편을 특이적으로 높은 민감도 및 정확도로 검출할 수 있는 본 발명의 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물로서, 분석하고자 하는 시료에 SFTS 바이러스의 존재 여부에 대한 분석뿐만 아니라 중증열성혈소판감소증후군(Sever Fever with Thrombocytopenia Syndrome; SFTS)의 진단을 위한 진단용 조성물로도 사용될 수 있다.
그러므로 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머쌍; 및 서열번호 4의 프로브;를 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군(Sever Fever with Thrombocytopenia Syndrome; SFTS) 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 본 발명의 검출용 또는 진단용 조성물은 상기에서 언급한 본 발명에 따른 프라이머 쌍 및 프로브 이외에 중합효소 연쇄반응(PCR)에 사용할 수 있는 성분, 예를 들면 반응용 완충용액, dNTP, Mg2 + 이온, DNA 중합효소를 포함할 수 있다.
상기 반응용 완충용액은 1～10 mM TrisHCl, 10～40 mM KCl(pH9.0)을 사용할 수 있고, 상기 dNTP는 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한 상기 조성물은 실험상의 편의, 안정화 및 반응성 향상을 위해 안정화제 및/또는 비반응성 염료 등을 포함할 수 있다.
상기 비반응성 염료 물질이란 중합효소 연쇄반응에 영향을 미치지 않는 물질로부터 선택되어져야 하며, 중합효소 연쇄반응 산물을 이용한 분석이나 식별을 위해 사용되는 것을 목적으로 한다. 이러한 조건을 만족시키는 물질로는 로다민, 탐라, 락스, 브로모페놀 블루, 크실렌 시아놀, 브로모크레졸 레드, 크레졸 레드 등의 수용성 염료로 사용될 수 있다.
상기 조성물은 액상 형태로 제공될 수 있으며, 안정성, 보관의 간편성 및 장기 보관성을 증가시키기 위하여 건조된 상태인 것이 바람직하다. 상기 건조는 일반적인 상온건조, 가온건조, 동결건조, 감압건조와 같은 공지의 건조 방법에 의해 수행될 수 있으며, 조성물의 성분이 손실되지 않는 한, 임의의 건조 방법은 모두 사용 가능하다. 상기와 같은 건조 방법은 사용되는 효소의 종류 및 양에 따라 상이하게 적용될 수 있다.
상기 조성물은 한 반응 튜브 내에 혼합시킨 후 동결하거나 건조시켜 안정화된 상태로 제조하여 사용하게 됨으로써, 중합효소 연쇄반응 동안에 별도의 혼합과정이 필요하지 않으므로 반응 중 혼합으로 인한 오류를 방지 할 수 있으며, 안정성, 반응성 및 보관성을 향상 시킬 수 있다.
상기의 조성물은 프라이머 쌍 및 프로브를 제외한 나머지 성분인 반응용 완충용액, dNTP, Mg2 + 이온, DNA 중합효소들이 이미 함유된 시중에 판매되는 제품을 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 진단용 키트에는 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머쌍; 및 서열번호 4의 프로브;를 포함하고 있어 중증열성혈소판감소증후군(SFTS)을 매우 높은 정확도로 진단할 수 있다.
상기 진단은 분석하고자 하는 검체 시료에 SFTS 바이러스가 포함되어 있는지 여부를 판별하기 위해 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)을 사용할 수 있으며, 상기 중합효소연쇄반응은 일반적인 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응 (Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 및 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time polymerase chain reaction, real-time PCR) 등을 포함한다.
본 발명의 진단 키트는 본 발명의 프라이머쌍 및 프로브 이외에도, 역전사효소, 중합효소, 중합효소연쇄반응을 위한 주형 DNA(template DNA)로서 상보적 DNA(cDNA), 및 버퍼 등의 반응 시약을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 일반적인 중합효소연쇄반응 또는 실시간 중합효소연쇄반응 등에 사용될 수 있는데, 이 경우 SFTS 바이러스의 RNA 유전체로부터 역전사효소 (reverse transcriptase)의 작용을 통한 역전사 (reverse transcription) 반응을 별도로 수행하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성하고 이를 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 사용할 수 있다.
중합효소연쇄반응의 결과물은 아가로즈 겔 전기영동 (agarose gel electrophoresis) 또는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 등의 방법으로 분리할 수 있으며, 사용된 프라이머쌍에 의해 중합된 DNA에 해당하는 길이를 갖는 DNA의 존재를 확인하여 중증열성혈소판감소증후군을 진단할 수 있다.
또한 본 발명에서는 SFTS 바이러스 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 4의 프로브(probe)를 사용하였는데, 상기 프로브는 각 말단에 형광물질 및 소광체(quencher)를 결합시켜 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 프로브의 5말단에는 형광물질이 결합되고 3말단에는 소광체가 결합된 것일 수 있으며, 프로브의 5말단 에는 적색, 녹색, 청색 등 특정 파장을 방출하는 형광물질이 결합되고 3말단에는 블랙홀 소광체(black hole quencher, BHQ)가 결합될 수 있다. 형광물질과 소광체가 프로브에 결합되어 있는 상태에서는 소광체가 형광물질이 방출하는 빛을 흡수하기 때문에 형광 신호가 검출되지 않는다. 반면, DNA의 합성 및 신장 과정에서 DNA 중합효소의 exonuclease activity에 의해 결합되어 있던 형광물질이 분리되면 형광신호를 검출할 수 있다. 중합효소연쇄반응이 진행되는 동안, 이러한 형광신호를 실시간으로 측정할 수 있으며, 증가한 형광신호를 바탕으로 바이러스 유전자 존재 유무를 판별할 수 있다. 이러한 프로브의 사용은 실시간 중합효소연쇄반응에 유용하게 사용될 수 있다.
나아가 본 발명은 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 감염 진단방법을 제공할 수 있으며, SFTS 감염 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공할 수 있다.
바람직하게 상기 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 감염 진단을 위한 정보 제공 방법은, (1) 중증열성혈소판감소증후군의 감염이 의심되는 환자에서 분리된 시료에서 바이러스성 RNA를 분리하는 단계; (2) 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (3)상기 단계 (2)에서 합성한 cDNA를 주형으로, 실시예 3에서 사용된 키트를 사용하여 실시간 RT-PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 (4) 상기 단계 (3)를 통해 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 유전자를 확인하는 단계;를 포함한다.
상기 시료는 이에 제한되지는 않으나, 포유동물로부터 수득한 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 소변; 또는 참진드기;일 수 있다.
또한 상기 방법에서 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 유전자의 확인은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 방법을 통해 수행할 수 있다.
또한 본 발명의 방법에 있어서, 상기 SFTS는 SFTS 바이러스에 의해 감염되어 유발되는 질병을 지칭한다.
이상 본 발명에서 고안한 SFTS 바이러스의 S 단편에 특이적으로 결합하는 서열번호 2 및 3의 프라이머쌍 및 서열번호 4의 프로브를 이용할 경우, SFTS 바이러스를 높은 민감도와 정확도로 신속하게 검출이 가능한 장점이 있으며, 하기 본 발명의 실시예를 통해 실제 SFTS로 의심되는 환자들의 시료를 대상으로 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 RT-PCR 분석법을 수행한 결과, 내원 당시 환자의 시료를 대상으로 한 분석에서 97%의 높은 민감도와 100%의 특이도로 신속한 진단이 가능함을 확인하였을 뿐만 아니라 SFTS 환자가 병원 내원이 지연된 경우의 민감도를 예측할수 있는 SFTS의 의심환자의 입원 전체 기간 동안 채혈 검체를 대상으로 한 분석에서도 88%의 높은 민감도와 100%의 특이도로 정확도가 우수한 진단이 가능하다는 것으로 확인하였다.
또한, 본 발명의 방법에 따른 상기와 같은 진단 정확도는 종래 사용되었던 진단 방법을 수행한 경우와 다른 종류의 프라이머와 프로브를 이용한 경우에 비해 월등히 우수한 것으로 나타났다.
그러므로 본 발명에서 고안한 SFTS 검출용 조성물을 이용한 SFTS 감염 진단 방법 및 감염 진단을 위한 정보 제공방법은 SFTS를 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있으며, 실시간으로 SFTS 바이러스의 검출이 가능하기에 발병 후, 시간이 상당히 경과된 시점에서도 높은 정확도로 진단할 수 있고, 타질환과 SFTS의 질병을 높은 특이도로 구별할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
SFTS 바이러스 유전자 검출 또는 진단을 위한 프라이머 및 프로브 제작
본 발명자들은 SFTS 바이러스의 S 단편 서열을 대상으로, 중증열성혈소판감소증후군을 신속하고 정확하며 높은 민감도로 검출할 수 있는 새로운 진단용 프라이머 및 프로브를 하기 표 2와 같이 디자인 하였다.
또한 하기 표 2의 프라이머 및 프로브 디자인을 위해 하기 표 1에 기재된 SFTS 바이러스의 S 단편 서열을 참고하였다.
한국, 중국 및 일본의 환자에서 동정된 SFTS 바이러스의 S 단편(segment)에 대한 정보
GenBank accession
NO. of S segment		 Strain/isolate Isolation source Country
AB817995 YG1 Human Japan
AB817996 SPL003A Human Japan
AB817999 SPL010A Human Japan
AB818002 SPL035A Human Japan
AB985526 SPL057A Human Japan
AB985529 SPL066A Human Japan
AB985532 SPL070A Human Japan
AB985541 SPL087A Human Japan
AB985544 SPL097A Human Japan
AB985545 SPL100A Human Japan
AB985551 SPL112A Human Japan
AB985554 SPL120A Human Japan
AB985557 SPL125A Human Japan
AB985559 SPL129A Human Japan
HM745932 HB29 Human China
HM802204 SD4 Human China
HM802205 SD24 Human China
HQ141591 AH12=AH12/China/2010 Human China
HQ141606 JS4 Human China
HQ171192 HGX Human China
HQ171193 HZM Human China
HQ171194 WWG Human China
HQ419239 2010-WSQ NA China
HQ830168 JS26 Human China
JQ670932 AHL/China/2011 Human China
JQ693002 SDLZSheep01/2011 Sheep China
JQ733562 HB154/China/2011 Human China
JQ733565 HB155/China/2011 Human China
JQ733568 HB156/China/2011 Human China
KC505137 JS2011-062 Human China
KF358693 Gangwon/Korea/2012 Human Korea
KF374683 Zhao Human China
KF711897 2011YPQ11 Human China
KF791948 HL/Injected Human China
KF887435 LN2012-58 Human China
KJ597823 Zhejiang/01/2011 Human China
KP202165 HB29 Vero cells China
KP663733 KASJH Human Korea
KP663736 KAGWH3 Human Korea
KP663739 KAGBH5 Human Korea
KP663742 KAGBH6 Human Korea
KP663745 KACNH3 Human Korea
KR017811 AH-YTY/China/05/2012 Human China
KR017821 ZJZHSH-FDE/China/06/2012 Human China
KR017825 ZJZHSH-LWL/China/08/2014 Human China
KR017826 ZJZHSH-WRF/China/08/2014 Human China
KR612072 AP01 Human Korea
KR612073 CP01 Human Korea
KR612076 JP01 Human Korea
KR706565 QD7 Human China
KU507553 KADGH Human Korea
KU507555 KAGNH Human Korea
KU507556 KAGNH4 Human Korea
KU507557 KAJNH2 Human Korea
KU507577 KAUSH2 Human Korea
KY789439 CB1 Human Korea
KY789440 CB2 Human Korea
KY789441 CB3 Human Korea
NC_018137 HB29 Human China
SFTS 바이러스 유전자 검출을 위해 디자인한 프라이머 및 프로브
No. Primers/probes
Name		 Sequences(5'-> 3') Length Product Length(bp)
1 SFTS-S 583F AGAGGMATGAGCTTGAAC 18 71
SFTS-S 653R TCCCAACAGTCTAAYAGA 18
SFTS-S 602P ACCACTTATTCACTTCTTCCTCATTGC 27
2 SFTS-S 576F AAGGCTAAGAGGMATGAG 18 78
SFTS-S 653R TCCCAACAGTCTAAYAGA 18
SFTS-S 602P ACCACTTATTCACTTCTTCCTCATTGC 27
3 SFTS-S 576F AAGGCTAAGAGGMATGAG 18 78
SFTS-S 653R TCCCAACAGTCTAAYAGA 18
SFTS-S 603P CCACTTATTCACTTCTTCCTCATTGCG 27
4 SFTS-S 576F AAGGCTAAGAGGMATGAG 18 78
SFTS-S 653R TCCCAACAGTCTAAYAGA 18
SFTS-S 598P AACCACCACTTATTCACTTCTTCCTCA 27
5 SFTS-S 576F AAGGCTAAGAGGMATGAG 18 78
SFTS-S 653R TCCCAACAGTCTAAYAGA 18
SFTS-S 599P ACCACCACTTATTCACTTCTTCCTCA 26
6 SFTS-S 576F AAGGCTAAGAGGMATGAG 18 78
SFTS-S 653R TCCCAACAGTCTAAYAGA 18
SFTS-S 604P CACTTATTCACTTCTTCCTCATTGCGT 27
7 SFTS-S 576F AAGGCTAAGAGGMATGAG 18 78
SFTS-S 653R TCCCAACAGTCTAAYAGA 18
SFTS-S 602P ACCACTTATTCACTTCTTCCTCATTGC 27
8 SFTS-S 583F AGAGGMATGAGCTTGAAC 18 71
SFTS-S 653R TCCCAACAGTCTAAYAGA 18
SFTS-S 603P CCACTTATTCACTTCTTCCTCATTGCG 27
9 SFTS-S 583F AGAGGMATGAGCTTGAAC 18 71
SFTS-S 653R TCCCAACAGTCTAAYAGA 18
SFTS-S 604P CACTTATTCACTTCTTCCTCATTGCGT 27
상기 표에서 M은 A 또는 C 염기일 수 있고, 상기 Y는 C 또는 T 염기일 수 있다.
< 실시예 2>
SFTS 바이러스 유전자 검출 또는 진단을 위한 최적의 프라이머와 프로브 선별
상기 실시예 1에서 디자인한 SFTS 바이러스 유전자 검출 또는 진단을 위한 프라이머와 프로브를 대상으로 실시간 RT-PCR을 수행하여, 민감도 및 특이도 검사를 수행하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 DNA(SFTS 바이러스의 S segment가 클로닝된 재조합 벡터 DNA)를 이용하여 검출한계(Limit of Detection, LOD)를 확인하였을 때, 상기 표 2의 프라이머 및 프로브들 중에서, 1번째(No.1)의 프라미어 및 프로브를 사용한 경우, 다른 프라이머 및 프로브를 사용한 군에 비해서 더 우수한 민감도 및 특이도를 나타내었고, 또한 기존의 SFTS 바이러스 검출을 위한 검사법에 비해서도 더 우수한 민감도 및 특이도를 나타내었다. 구체적으로 1번째(No.1)의 프라미어 및 프로브를 사용한 경우, 실시간 RT-PCR 분석 결과, 95% 검출(LOD95%)이 39.739 copy/test(ct 40.3)로 확인되었으며, 기존의 SFTS 바이러스 검출용 검사법 수행 시에는, 96.332 copy/test(ct 38.9)로 나타나, 본 발명에서 고안한 프라이머 및 프로브를 사용한 경우, 실시간 RT-PCR의 민감도가 더 높아 SFTS 바이러스 유전자의 검출 및 진단을 위해 시간과 비용을 모두 절약할 수 있으며, 검출 효과가 우수함을 알 수 있었다.
< 실시예 3>
환자로부터 수득한 시료를 대상으로 본 발명의 SFTS 바이러스 유전자 검출 또는 진단용 프라이머와 프로브를 이용한 SFTS 검출능 분석
본 발명자들은 본 발명에서 고안한 SFTS 바이러스 유전자 검출 또는 진단용 프라이머와 프로브(상기 표 1의 No.1 번의 프라이머(SFTS-S 583F, 653R 프라이머) 및 프로브(SFTS-S 602P 프로브))가 실제로 SFTS 감염을 진단하는데 사용 가능한지 확인하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
이를 위해 실험에 사용한 시료는 하기 3가지를 만족하는 환자로부터 수득한 시료를 대상으로 분석하였다.
① 만19세 이상인 자
② SFTS 감염으로 고려되는 자
증상 발생 후부터 연구 참여 평가시점까지 SFTS 증상이 객관적으로 확인된 자로서, 하기에 해당되는 자
- 발열 (액와체온 >37.8 ℃)
- 혈소판 감소증 (platelet < 100 X 109/L)
- 백혈구 감소증 (WBC < 5 X 109/L)
③ 감염내과 의사에 의해 SFTS가 의심되는 경우
위의 3가지를 만족하는 환자를 대상으로 SFTS RT-PCR 검사를 시행하였으며 SFTS 의 확진은 IFA 4배 이상 상승하거나 바이러스 분리로 정의하여 각각의 PCR법을 수행하여 정확도를 평가하였다.
또한, 민감도 확인 검체는 2018년도 SFTS 환자 대상으로 진행되었고, 환자 36명으로부터 119개의 혈액검체를 수집하여 사용하였으며, 특이도 확인을 위한 검체는 2008년부터 2018년 사이에 수집된 검체로 SFTS가 아닌 타질환으로 확진된 환자 50명을 대상으로 진행하였다. 참고로, 특이도 검사를 위해 음성대조군으로 사용한 병원체들과 바이러스들의 목록은 도 4에 나타내었다.
민감도 및 특이도 비교를 위하여 다른 PCR을 시행하였는데, 환자의 plasma, WB(whole blood)로부터 바이러스 RNA를 추출하였고, 상기 추출은 바이러스 Gene-spinTM 바이러스 DNA/RNA 추출키트(intron)를 이용하여 수행하였다. 이후 상기 RNA로부터 SuperScript VILO MasterMix (Invitrogen)을 사용하여 cDNA를 합성하여 주형 DNA로 사용하였으며, 실시간 RT-PCR 다음과 같이 진행되었다.
SFTS 바이러스의 S 단편을 타겟으로 하는 실시간 RT-PCR은 본 발명에서 고안한 프라이머 및 프로브를 이용한 방법과 하기 표 3의 종래 개시된 방법의 PCR로 각각 진행하였으며, S 단편을 타겟으로 하는 nested RT-PCR 및 M 단편을 타겟으로 하는 RT-PCR을 수행하였다. 실시간 RT-PCR은 LightCycler TaqMan Master (Roche Diagnostics, Indianapolis)를 사용하였으며, 96 Excycler (Bioneer)기기로 PCR을 수행하였다. RT-PCR과 nested RT-PCR은 Accupower PCR premix(Bioneer)와 cDNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 수행된 각각의 PCR의 정보는 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.
PCR에 사용한 프라이머, 프로브 정보
PCR Gene Primer name Sequences
실시간 RT-PCR
(reference)		 S-seg SFTS-SQ-F 5‘-ACCTCTTTGACCCTGAGTTWGACA-3‘
SFTS-SQ-R 5‘-CTGAAGGAGACAGGTGGAGATGA-3‘
SFTS-SQ-P 5‘-TGCCTTGACGATCTTA-3‘
실시간 RT-PCR
(본 발명)		 S-seg SFTS-S 583F 5‘-AGAGGMATGAGCTTGAAC-3’
SFTS-S 653R 5‘-TCCCAACAGTCTAAYAGA-3’
SFTS-S 602P 5‘-ACCACTTATTCACTTCTTCCTCATTGC-3’
RT-PCR M-seg SFTS-F(=MF3) 5′-GATGAGATGGTCCATGCTGATTCT-3′
SFTS-R(=MR2) 5′-CTCATGGGGTGGAATGTCCTCAC-3′
Nested RT-PCR S-seg SFTS-S-NP-2F 5′-CATCATTGTCTTTGCCCTGA-3′
SFTS-S-NP-2R 5′-AGAAGACAGAGTTCACAGCA-3′
SFTS-S-N2F 5′-AAYAAGATCGTCAAGGCATCA-3′
SFTS-S-N2R 5′-TAGTCTTGGTGAAGGCATCTT-3′
PCR 수행 조건
실험조건(1차) 실험조건(2차)
PCR　 단계 기능 온도 시간(hh:mm:ss) 온도 시간(hh:mm:ss)
실시간 RT-PCR
(S-segment,
reference)		 1 INCUBATE 95 00:05:00 　 　
2 INCUBATE 95 00:00:05 　 　
3 INCUBATE 55 00:00:05 　 　
4 Scan FAM 　 　
5 GOTO Step2 45 cycle 　 　
6 INCUBATE 25 00:01:00 　 　
실시간 RT-PCR
(S-segment,
design)
(본 발명)		 1 INCUBATE 95 00:05:00 　 　
2 INCUBATE 95 00:00:05 　 　
3 INCUBATE 51 00:00:05 　 　
4 Scan CY5 　 　
5 GOTO Step2 45 cycle 　 　
6 INCUBATE 25 00:01:00 　 　
RT-PCR
(M-segment)		 1 INCUBATE 95 00:10:00 　 　
2 INCUBATE 95 00:00:20 　 　
3 INCUBATE 58 00:00:40 　 　
4 INCUBATE 72 00:00:30 　 　
5 GOTO Step2 35 cycle 　 　
6 INCUBATE 72 00:02:00 　 　
Nested RT-PCR
(S-segment)		 1 INCUBATE 95 00:10:00 94 00:10:00
2 INCUBATE 94 00:00:20 94 00:00:20
3 INCUBATE 53 00:00:20 57 00:00:20
4 INCUBATE 72 00:00:30 72 00:00:30
5 GOTO Step2 35 cycle Step2 30 cycle
6 INCUBATE 72 00:02:00 72 00:02:00
민감도 및 특이도 결과
PCR 수행조건 　
　		 민감도(Sensitivity) 특이도
(specificity)		 소요시간
입원당시 및 추적검체 포함(n=119) 입원당시 검체
(n=36)		 n=50
실시간 RT-PCR
(S-segment,reference)
cutoff=39		 70.6% 88.9% 98% 1-2h
실시간 RT-PCR
(S-segment,design)
cutoff=40 (본 발명)		 88.2% 97.2% 100% 1-2h
RT-PCR(M-segment) 48.7% 61.1% 100% 2-3h
Nested RT-PCR (S-segment) 78.2% 91.7% 100%　 4-5h
분석결과, 상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 다른 PCR 방법에 비해 본 발명에서 고안한 프라이머 및 프로브를 이용하여 수행한 실시간 RT-PCR 분석 결과가 민감도 및 특이도 분석에서 가장 우수한 값으로 나타나, 검출 효과가 가장 우수함을 알 수 있었으며, 기존 다른 방법에 비해 1~2시간의 짧은 시간 만에 SFTS 바이러스를 정확하게 진단 및 검출할 수 있는 것으로 나타났다.
<실시예 4>
본 발명의 SFTS 바이러스 유전자 검출 또는 진단용 프라이머와 프로브를 이용한 SFTS 검출 정확도 검증
<4-1> 내원 당시 검체를 이용한 PCR 진단법의 정확도
내원 당시의 환자 검체(혈액)를 대상으로 본 발명에서 고안한 SFTS 바이러스 유전자 검출용 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR 분석법으로 SFTS 검출에 대한 민감도 및 특이도 검증 분석을 수행하였다.
내원 당시 검체를 이용한 PCR 진단법의 정확도
1st SFTS positive = 36 / Negative = 50 환자 대상
　 SQ ref
(cut off=39)		 SQ design
(cut off=40)		 RT-PCR
(M seg)		 Nested RT-PCR
(S seg)
Finding
(+)		 Finding
(-)		 Finding
(+)		 Finding
(-)		 Finding
(+)		 Finding
(-)		 Finding
(+)		 Finding
(-)
SFTS positive 32 4 35 1 22 14 33 3
SFTS negative 1 49 0 50 0 50 0 50
Total 86 86 86 86
Sensitivity,
%(95% CI)		 88.89%
(73.9 - 96.9)		 97.22%
(85.5 - 99.9)		 61.1%
(43.5 - 76.9)		 91.67%
(77.5 - 98.2)
Specificity,
%(95% CI)		 98%
(89.4 - 99.9)		 100%
(92.9 - 100.0)		 100%
(92.9 - 100.0)		 100%
(92.9 - 100.0)
PPV, % 97.00% 100% 100% 100%
NPV, % 92.45% 98.04% 78.13% 94.34%
AUC 0.934
(0.860 - 0.977)		 0.986
(0.933 - 0.999)		 0.806
(0.706 - 0.883)		 0.958
(0.892 - 0.990)
*SQ ref, 실시간 RT-PCR(S-segment,reference); SQ design, 실시간 RT-PCR(S-segment,design, 본발명)
내원 당시 검체를 이용한 PCR 진단법의 정확도의 비교
　 Difference between areas 95% CI z statistic p value
SQ ref, cut off=39 -
SQ design, cut off=40		 0.052 0.002 - 0.101 2.033 0.004
SQ design, cut off=40 - RT-PCR, M seg 0.181 0.101 - 0.260 4.448 <0.001
SQ ref, cut off=39 - RT-PCR, M seg 0.129 0.052 - 0.206 3.292 0.001
SQ ref, cut off=39 - Nested RT-PCR, S seg 0.024 -0.028 - 0.075 0.91 0.363
RT-PCR, M seg -
Nested RT-PCR, S seg		 0.153 0.077 - 0.229 3.924 <0.001
*SQ ref, 실시간 RT-PCR(S-segment, reference); SQ design, 실시간 RT-PCR(S-segment, design, 본원발명)
그 결과, 상기 표 6 및 도 2에 나타낸 바와 같이, SFTS의 S 단편을 타겟으로 한 실시간 RT-PCR 분석 결과, 본 발명에서 고안한 프라이머 및 프로브를 사용한 군이 다른 종류의 프라이머 및 프로브를 사용한 군에 비해 가장 우수한 민감도 및 특이도를 나타내었고, 구체적으로 민감도 97.2% 및 특이도 100%의 결과를 확인할 수 있었다. 한편, S 단편을 타겟으로 한 nested RT-PCR 분석에서는 91.67%의 민감도 결과를 보였으나, nested RT-PCR 은 두 번의 PCR을 수행해야 하는 번거로움이 있고, 이로 인한 PCR 오염 가능성이 더 높음을 고려할 때, 본 발명의 프라이머 및 프로브를 사용하는 것이 더 정확하고 우수한 검사결과를 도출할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 상기와 같은 결과에 대해, AUC를 이용해 각 민감도 및 특이도의 비교 분석에서, 본 발명에서 고안한 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 RT-PCR법이 M 단편을 타겟으로 한 conventional RT-PCR 보다 통계적으로도 의미 있게 정확도가 높음이 확인되었다(표 7 참조).
<4-2> SFTS 의심 환자의 입원기간 동안 채혈한 검체를 대상으로 본 발명의 SFTS 바이러스 유전자 검출 또는 진단용 프라이머와 프로브를 이용한 PCR 진단법의 정확도 평가
나아가 본 발명자들은 본 발명에서 고안한 프라이머 및 프로브를 이용하여 SFTS 의심 환자의 입원기간 동안 환자로부터 수득한 혈액 검체를 대상으로 SFTS 검출에 대한 민감도 및 특이도 분석을 수행하였다. 구체적으로 SFTS 의 확진은 IFA 4배 이상 상승하거나 바이러스 분리 및 확인으로 정의하여, SFTS 환자로 확진된 환자 36명으로부터 119개의 혈액검체 및 타질환으로 확진된 환자 50명을 대상으로 상기 실시예 <4-1>과 같은 방법으로 정확도 검사를 수행하였다.
또한, SFTS 의심 환자의 입원기간 동안 채혈한 검체를 대상으로 분석을 수행한 것은, 보통 환자들이 증상이 발생하였으나 초기에 내원하지 않고 늦게 내원한 경우가 빈번하고, 다른 질환으로 의심하여 치료 도중에 SFTS 가 의심되어 입원기간동안 SFTS PCR 검사법을 의뢰하는 경우도 많은데, 이러한 경우 진단의 민감도가 낮아지는 문제점이 있다. 이에 환자가 입원해 있는 기간 동안이나 또는 늦게 내원한 환자의 시료를 대상으로도 높은 민감도와 특이도로 SFTS의 진단 가능성을 확인하기 위함이다.
입원 기간동안 검체를 이용한 PCR 진단법의 정확도
ALL SFTS positive = 119 / Negative = 50
　 SQ ref
(cut off=39)		 SQ design
(cut off=40)		 RT-PCR
(M seg)		 Nested RT-PCR
(S seg)
Finding
(+)		 Finding
(-)		 Finding
(+)		 Finding
(-)		 Finding
(+)		 Finding
(-)		 Finding
(+)		 Finding
(-)
SFTS positive 83 36 105 14 58 61 93 26
SFTS negative 1 49 0 50 0 50 0 50
Total 169 169 169 169
Sensitivity, %(95% CI) 69.75%
(60.7 - 77.8)		 88.24%
(81.0 - 93.4)		 48.74%
(39.5 - 58.1)		 78.15%
(69.6 - 85.2)
Specificity
(95% CI)		 96.0%
(86.3 - 99.5)		 100.0%
(92.9-100.0)		 100.0%
(92.9-100.0)		 100.0%
(92.9-100.0)
PPV, % 98.81% 100.00% 100.00% 100.00%
NPV, % 57.65% 78.13% 45.05% 65.79%
AUC 0.822
(0.756 - 0.876)		 0.941
(0.894 - 0.972)		 0.744
(0.671 - 0.808)		 0.891
(0.834 - 0.933)
*SQ ref, 실시간 RT-PCR(S-segment, reference); SQ design, 실시간 RT-PCR(S-segment, design, 본 발명)
입원 기간동안 검체를 이용한 PCR 진단법의 정확도의 비교
　 Difference between areas 95% CI z statistic p value
SQ ref, cut off=39 -
SQ design, cut off=40		 0.119 0.068 - 0.171 4.547 <0.001
SQ ref, cut off=39 - RT-PCR, M seg 0.078 0.022 - 0.135 2.706 0.007
SQ ref, cut off=39 - Nested RT-PCR, S seg 0.069 0.017 - 0.121 2.582 0.010
SQ design, cut off=40 -
RT-PCR, M seg		 0.197 0.153 - 0.242 8.777 <0.001
SQ design, cut off=40 - Nested RT-PCR, S seg 0.050 0.017 - 0.084 2.916 0.004
RT-PCR, M seg - Nested RT-PCR, S seg 0.147 0.104 - 0.190 6.744 <0.001
*SQ ref, 실시간 RT-PCR(S-segment, reference); SQ design, 실시간 RT-PCR(S-segment, design, 본 발명)
그 결과, 표 8~ 표 9 및 도 3에 나타낸 바와 같이, SFTS의 S 단편을 타겟으로 하며, 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용하여 수행한 실시간 RT-PCR(본 발명의 방법)이 기존 real time RT-PCR법이나 nested RT-PCR법에 비해 통계적으로 의미 있게 정확도가 더 높은 것으로 나타났고, 다른 프라이머 및 프로브를 사용한 경우에 비해서도 더 우수한 민감도를 보였다.
<4-3> 다양한 병원체들과 바이러스를 대상으로 본 발명의 SFTS 바이러스 유전자 검출 또는 진단용 프라이머와 프로브를 이용한 PCR 진단법의 정확도 분석
본 발명에서 고안한 프라이머 및 프로브를 이용하여 도 4의 박테리아 및 바이러스를 대상으로 특이도를 분석하였다.
그 결과, 다양한 질병의 원인인 박테리아에서는 모두 음성으로 확인되었으며, 또한 SFTSV가 아닌 다른 바이러스를 대상으로 한 경우, 검출되지 않는 것으로 나타났고, 뎅기바이러스, 인플루엔자 바이러스, A형 간염 바이러스 및 한탄바이러스에 감염된 환자의 검체에서 모두 검출되지 않음을 확인하였다.
따라서 이러한 결과를 통해, 본 발명에서 고안한 프라이머 및 프로브는 SFTS 바이러스에 대해 우수한 특이도를 보임을 알 수 있었고, 다른 박테리아 균주 및 바이러스에 대해서는 증폭산물이 검출되지 않아, SFTS 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 5>
한국, 일본 및 중국 계통군의 SFTS 바이러스 검출 가능성 분석
최근 연구결과에 의하면 각 나라별 발생하는 중증열성혈소판감소증후군의 원인이 되는 SFTS 바이러스의 유전자 서열이 서로 다르다는 것이 확인되었다. 한편, 아직까지 다양한 계통군(clade)의 SFTS 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 검출기술이 개발되지 못하고 있는데, 본 발명자들은 본 발명에서 고안한 프라이머 및 프로브를 이용할 경우, 각기 다양한 계통군의 SFTS 바이러스를 모두 검출가능한지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, SFTS바이러스는 바이러스 유전자 염기서열에 따라 계통군 분석 시 Korea, Japan, China clade로 분류되는데, 우리나라 SFTS 환자는 3개국 clade가 모두 확인되고 있다. 이에 하기 표 10과 같이 각기 다른 계통군의 SFTSV에 의해 감염된 환자의 시료를 대상으로 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용하여 상기 기술된 실시예에서 수행한 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 또한, 본 발명에서 사용한 SFTSV의 계통군 및 각 시료에 대한 분류는 도 5에 나타내었다.
한국, 일본 및 중국 계통군의 SFTS 바이러스 검출 가능성 분석
Lab No. Specimens Viral clades Ct(SQ-design) log10 (copies)
2018-HY-36 WB C2 28.34 5.12
2018-JN12 WB C3 34.16 3.39
2018-KM23 WB J1 36.41 2.72
2018-980 WB J1 27.63 5.34
2018-DA02 WB J1 27.65 5.33
2018-HY-13 WB J1 33.15 3.69
2018-km03 WB J1 32.12 4.00
2018-AJ27 WB J1 34.79 3.21
2018-YN22 WB J1 35.61 2.96
2018-KM12 WB J1 32.68 3.83
2018-AJ28 WB J1 34.06 3.42
2018-YN10 WB J1 24.96 6.13
2018-WJ18 WB J1 30.99 4.34
2018-YN05 WB J1 37.66 2.35
2018-AJ29 WB J1 33.36 3.63
2018-WJ06 WB J1 31.09 4.31
2018-638 WB J3 29.20 4.87
2018-JN44 WB J3 33.98 3.45
2018-JN38 WB J3 26.81 5.58
2018-CB01 WB J3 37.89 2.28
2018-JN42 WB J3 31.23 4.26
2018-JN17 WB J3 30.62 4.45
2018-913 WB K1 35.86 2.89
2018-YN03 WB K1 26.83 5.57
2018-YN01 WB K1 35.37 3.03
2018-JN50 WB K1 34.09 3.41
2018-WJ01 Serum K2 31.12 4.30
2018-HY01 WB K3 27.41 5.40
2018-HY22 WB K4 31.36 4.23
2018-HY-35 WB K4 21.16 7.26
2018-HY24 WB K4 27.5 5.37
2018-HY17 WB K4 26.2 5.76
2018-HY06 WB K4 29.22 4.86
2018-AJ17 WB K4 28.21 5.16
2018-HY-29 WB K4 31.65 4.14
2018-HY-31 WB K4 26.8 5.58
*C, Chinese clade; J, Japanese clade; K, Korean clade; SQ design, 실시간 RT-PCR (S-segment,design, 본발명)
분석 결과, 상기 표 10에 나타낸 바와 같이 3개국 clade에 감염된 모든 SFTS 환자의 시료에서 본 발명의 프라이머 및 프로브를 사용할 경우, 모두 증폭물을 확인할 수 있었고, 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 고안한 방법은 한국, 일본 및 중국 계통군의 SFTS 바이러스를 모두 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 6>
진드기 시료를 대상으로 본 발명의 SFTS 바이러스 유전자 검출 또는 진단용 프라이머와 프로브를 이용한 SFTS의 검출
진드기에 물려 병원에 내원한 환자들로부터 참진드기 55개를 채취하고 이들을 대상으로 본 발명의 프라이머(서열번호 2, 3) 와 프로브(서열번호 4)를 이용하여 SFTSV에 대한 RT-PCR을 수행한 결과, 54개의 진드기 시료에서는 음성으로 확인되었으며, 1개 진드기 시료에서는 양성으로 확인되었다. Nested RT-PCR 검사상에서도 동일하게 54개의 진드기 시료에서는 음성으로 확인되었으며, 1개의 진드기에 대해서만 양성으로 확인되었고 본 발명의 실시간 RT-PCR을 시행한 결과에서도 동일하게 양성으로 확인되었으며, 염기 서열 분석 결과 SFTS 바이러스로 확인되었다(도 6 참조).
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 고안한 프라이머 및 프로브는 인체 유래 시료뿐만 아니라 진드기 시료를 대상으로도 SFTSV 검출이 가능하다는 것을 알 수 있었고(SFTS SQ-PCR (ref) Ct 30.25값을 나타내었고, SFTS SQ-PCR (design) Ct 27.98값을 나타내었다)(도 6a 참조), 이러한 결과는 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 RT-PCR 분석 결과를 통해서도 SFTSV 검출이 가능하다는 것을 알 수 있었다(도 6b 참조).
이상의 결과를 통해, 본 발명자들은 중증열성혈소판감소증후군의 원인 바이러스인 SFTS 바이러스의 S 단편 내에서 nonstructural S protein(NSs) 유전자의 염기서열을 검출 및 증폭시킬 수 있는 본 발명에서 고안된 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행할 경우, 우리나라 뿐만 아니라 중국 및 일본에서 유행하는 유전형의 바이러스에 의해 발생하는 중증열성혈소판감소증후군도 정확하고 신속하게 검출할 수 있고 우수한 정확도도 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> KIM, Dong-Min <120> Composition for detecting Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome viral RNA and method of diagnosing Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome using the same <130> NPDC80724 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1746 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SFTSV S segment sequence <400> 1 acacaaagaa cccccttcat ttggaaacca tgtcgctgag taaatgctcc aacgttgacc 60 tcaaatctgt tgcaatgaat gccaacactg tcaggcttga gccatctctg ggagagtacc 120 ccactcttag gagagacctc gttgagtgct cttgtagtgt gttgactcta tcaatggtca 180 agaggatggg caagatgacc aacacagtat ggttatttgg caacccaaag aatcctcttc 240 accagcttga gcctggactc gagcagctgt tggacatgta ctacaaggac atgaggtgct 300 actcccagag agagctgagt gctcttaggt ggcctagtgg gaagccatct gtatggttcc 360 tacaggcagc tcacatgttc ttctccatca agaacagctg ggctatggaa accggtagag 420 agaactggcg gggcctcttc cacaggataa caaaaggcca aaagtatctt tttgaagggg 480 acatgatatt ggattctctt gaagccatag agaagcgaag gcttagacta gggttacctg 540 agatcctaat aactggacta tccccaatcc tggatgtggc cctcctccag atagagtcac 600 ttgcaaggct aagaggaatg agcttgaacc accacttatt cacttcttcc tcattgcgta 660 agcctctatt agactgttgg gacttcttta ttcccatccg caaaaagaag acagatggct 720 catacagtgt cctggatgag gatgatgagc ctggggtcct ccaaggttat ccatatctga 780 tggcacacta tttgaatagg tgcccattcc acaacctcat caggtttgat gaagagctga 840 gaactgcagc cctaaacacc atctggggaa gagattggcc agccattggt gacctcccga 900 aggaggtcta attttgtcga attggatcat gaaatttagc ctaattggat atgtcaaatt 960 gctgcttaca ggttcctgta agcagcagca gcaacctcag cagctctgct ggggacccca 1020 tctgggccaa ggattccctt ggccttcagc cacttcaccc ggacatcatt gggaaagaag 1080 acagagttca cagcagcatg gagaggatcc ctgaaagagt tgtaaacctc tgtcttgcta 1140 gctccgcgca tcttcacatt gatagtcttg gtgaaggcat cttgccacag agagtaggcc 1200 tccatcaggg tcttcgttgt ggcttcagat acccctgcag ttggaatcag ggacccaaag 1260 gccatgcaca tcatctcagg gggataattt tcgaccttca ggttcatgac agctggcccc 1320 actgggagat actcctttag ggctgctgct gcagcacatg tccaagtggg aaggctctgt 1380 gcaaccctca caggagtgat tgagagcctg gtttctgccc tctcaaccag cccatatttc 1440 tcttggagtg ccatcaacct cttagaccca gagtttgaca ttttccctga tgccttgacg 1500 atcttgttgc ctcgagtcag ggcaaagaca atgatgaact ttgtgtccct cacccaatca 1560 tctccacctg tctccttcag cttcttgatg atcaatgcag gatcaaggcc ttcataggcc 1620 agctctctcg caaaatcttc aagctcagtc aaattgagct gctgctcacc aaactccact 1680 gcaatcctgg accactctga catgatcact cctttgcgtc tttccttttt tgggggttct 1740 ttgtgt 1746 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SFTS-S 583F primer <400> 2 agaggmatga gcttgaac 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SFTS-S 653R primer <400> 3 tcccaacagt ctaayaga 18 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SFTS-S 602P probe <400> 4 accacttatt cacttcttcc tcattgc 27 <210> 5 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SFTSV S segment PCR product <400> 5 agaggaatga gcttgaacca ccacttattc acttcttcct cattgcgtaa gcctctatta 60 gactgttggg a 71

Claims (7)

  1. 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머쌍; 및 서열번호 4의 프로브;를 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군(Sever Fever with Thrombocytopenia Syndrome; SFTS) 바이러스 유전자 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머쌍; 및 서열번호 4의 프로브;는 서열번호 1로 이루어진 중증열성혈소판감소증후군(Sever Fever with Thrombocytopenia Syndrome) 바이러스의 S 단편(Small segment; S segment)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 바이러스 유전자 검출용 조성물.
  3. 제1항의 조성물을 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 진단용 키트.
  4. (1) 중증열성혈소판감소증후군의 감염이 의심되는 환자에서 분리된 시료에서 바이러스성 RNA를 분리하는 단계;
    (2) 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
    (3) 상기 단계 (2)에서 합성한 cDNA를 주형으로 하고, 제3항의 키트를 사용하여 실시간 RT-PCR 증폭을 수행하는 단계; 및
    (4) 상기 단계 (3)을 통해 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 유전자를 확인하는 단계;를 포함하는,
    중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 감염 진단을 위한 정보 제공 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 단계 (1)의 시료는, 포유동물로부터 수득한 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 소변; 또는 참진드기;인 것을 특징으로 하는, 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 감염 진단을 위한 정보 제공 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 단계 (3)에서 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 유전자의 확인은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 감염 진단을 위한 정보 제공 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 단계 (3)에서 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 유전자는 서열번호 1로 이루어진 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 S 단편(Small segment; S segment)인 것을 특징으로 하는, 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 감염 진단을 위한 정보 제공 방법.
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