KR101247981B1 - 구제역 7가지 혈청형 감별을 위한 유전자 진단키트 - Google Patents

구제역 7가지 혈청형 감별을 위한 유전자 진단키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 구제역 바이러스의 7가지 혈청형(O, A, Asia 1, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3)을 감별하는 유전자 진단방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 아시아에서 실질적으로 적용할 수 있고 7가지 혈청형을 정확하게 감별할 수 있는 일반적 유전자 진단법(Conventional Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; Conventional RT-PCR)을 개발하는데 있다. 보다 상세하게는 혈청형 특이적인 프라이머를 서로 다른 size 로 구분하도록 디자인한 후, 편리성과 특이도, 민감도를 동시에 확보하기 위하여 O와 Asia 1의 동시진단 세트, A와 C의 동시진단 세트, SAT 1, SAT 2, SAT 3의 동시진단 세트로 나누어 진단전략을 수립하였다. 각각의 세트에 대한 반응조건을 확립한 뒤 혈청형별 비특이 여부와 민감도를 측정하였다. 각 세트(set)에서 다른 혈청형에 대한 비특이는 관찰되지 않았으며, 평균적으로 103 copy의 민감도를 관찰하였으며, 또한 야외 실증 시험을 통하여 적용 가능성을 증명하였다.
본 발명에서 제공하는 구제역 혈청형 감별을 위한 유전자 진단방법은 새롭게 디자인된 프라이머를 사용하여 7가지 혈청형을 전기영동상의 DNA size로 감별할 수 있으며, 시료의 RNA를 추출하여 One-step RT-PCR하는 방법으로 진단할 수 있다. 뿐만 아니라, 3개의 튜브에 동시에 RNA 시료를 넣어 동일한 조건에서 증폭을 진행하도록 설정되어 교차오염을 줄이면서도 간편하게 혈청형 감별이 가능하다. 따라서 본 진단방법을 킷트화할 경우 우리나라 및 주변의 아시아 국가들에서 간편한 사용법과 저렴한 비용으로 짧은 시간 안에 구제역 혈청형을 감별해 낼 수 있다.
구제역 바이러스, 동시 진단, 혈청형 감별, 유전자 진단법, Conventional RT-PCR

Description

구제역 7가지 혈청형 감별을 위한 유전자 진단키트{RT-PCR for differentiation of seven serotypes of foot-and-mouth disease virus}
본 발명은 구제역 7가지 혈청형을 감별해 내는 유전자 진단키트에 관한 것이다.
도 1은 종래에 대표적으로 사용되었던 구제역 혈청형 감별 프라이머(Vangrysperre and De Clercq., Arch. Virol. (1996))를 O(O/SKR/2002), A(A22 Iraq), Asia1(Asia 1/MOG/05)형의 구제역 바이러스에 적용하여 RT-PCR한 뒤 전기 영동한 결과를 나타낸 그림이다.
혈액형 O형을 확인하기 위한 프라이머를 적용하였을 때 O형과 Asia 1형에서 402bp, Asia 1형을 확인하기 위한 프라이머 적용시에 Asia 1 형에서 292bp, A형을 확인하기 위한 프라이머 적용시에는 A형에서 732bp로 예상되는 밴드 크기 나타내었으며, 흰색 상자로 그 밴드를 표시하였다.
도 2는, 제작한 프라이머를 포함한 RT-PCR mix에 7가지 혈청형 바이러스 분리주의 RNA를 넣고 반응시킨 뒤 전기 영동하여 밴드를 확인한 결과이다. 실험에 사용된 바이러스의 분리주명을 전기영동 사진 위쪽에 표시하였다.
도 3은 혼합 감염시 1) O형과 Asia 1형, 2) A형과 C형, 3) SAT 1, SAT 2, SAT 3형을 감별하기 위한 감별 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR을 실시한 후 전기 영동한 결과이다. 각 혈청형의 밴드를 흰색 화살표로 표시하였다. 사용된 RNA는 도 2에서와 동일한 분리 주에서 추출하였다.
도 4는 확립된 유전자 검사법의 민감도를 측정한 것이다. 바이러스 RNA의 카피수(copy number)를 기준으로 10배 단계 희석한 후 RT-PCR 실시하고, 전기 영동하였다. 젤 사진 아래쪽에는 예상되는 진단 한계(detection limit)를 표시하였다. 구제역 바이러스의 RNA 카피수(copy number)는 7가지 혈청형을 모두 확인할 수 있는 3D 유전자 부분을 목적으로 하는 실시간(real-time) RT-PCR을 이용하여 계산되었다.
구제역(Foot-and-mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스 수포성 질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 국제수역사무국(OIE)에 의하여 리스트(List) 질병으로 분류되어 있으며, 축산물의 국가간 교역에 있어 매우 중요한 요소로 작용하고 있다. 병원체는 단일 가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae)와, 아프소바이러스(Apthovirus) 속에 속하며, 7개의 서로 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT 1, SAT 2, SAT 3)으로 분류되고 있다.
구제역은 혈청형별로 항체에 의한 교차방어가 되지 않기 때문에 구제역 발생시 백신 정책의 수행을 위해서 혈청형의 신속한 판단이 매우 중요하다. 대한민국과 같은 구제역 청정국에서의 긴급 발생시 뿐만 아니라 구제역이 수시로 발생하는 동 남아시아 국가들에서와 같이 여러 혈청형이 혼재하는 상황일 때(예를 들어, 베트남) 신속하게 진단할 수 있는 진단방법이 필요하다.
구제역 혈청형을 구분하기 위한 방법에는 대표적으로 유전자 진단법(conventional RT-PCR), 항원 엘라이자(Antigen enzyme-linked immunosorbent assay), 염기서열 분석법(Nucleotide sequencing) 등이 있다(World Organization for Animal Health(OIE), Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals). 이 중에서 유전자 진단법은 다른 2가지 진단법에 비하여 고도의 실험 기술이 필요치 않으면서 낮은 비용으로 신속한 진단(3~4 시간 소요)이 가능하다는 장점이 있다. 또한 민감도(sensitivity)에 있어서도 항원 엘리사(ELISA)보다 우수한 결과를 보여 왔다. 이러한 장점에도 불구하고 기존의 구제역 혈청형 감별에 세계적으로 사용되고 있으며, 세계동물보건기구 및 세계식량 농업기구의 국제 표준연구소인 영국 퍼브라이트 연구소(OIE/FAO World Reference Laboratory for FMD (WRL), Pirbright, UK)에서 개발된 프라이머(Vangrysperre W et al, Arch Virol. 1996. 141(2): 331-44; Reid SM et al. J. Virol. Metho. 1999. 83(1-2):113-23; Reid SM et al. Arch. Virol. 2001. 146(12): 2421-2434)는 Asia 1형 바이러스(Asia1/MOG/05)에 O형 특이적 프라이머가 특이 반응을 보였다(도 1). 현재 Asia 1은 아시아 전역 및 우리나라 주변국(몽골, 중국, 북한)에서 최근 발생한바 있어, 우리나라 주변의 역학 상황을 고려할 때 기존의 유전자 진단법을 사용하기는 힘든 실정이다. 또한 제작된 지 10년 이상이 경과하여(1996년에 개발) 최근에 발생하고 있는 바이러스 유전정보를 고려한 새로운 프라이머의 필요성이 제 기되게 되었다.
따라서, 상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 현재 아시아에서 유행하는 바이러스 주(strain)에 대한 비특이가 없고 아시아 여러 나라에서 실질적으로 사용이 가능한 유전자 진단방법을 구축하는 데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 의한 구제역 7가지 혈청형 감별을 위한 유전자 진단방법은, 7가지 혈청형(O, A, Asia 1, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3)을 서로 다른 밴드 크기로 진단하되, 상기 SAT 1, SAT 2, SAT 3은 공통의 밴드 크기를 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 구제역 7가지 혈청형 감별을 위한 유전자 진단방법은 O형과 Asia 1형을 동시 진단하며 감별하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 구제역 7가지 혈청형 감별을 위한 유전자 진단방법은 구제역 A형과 C형을 동시 진단하며 감별하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 구제역 7가지 혈청형 감별을 위한 유전자 진단방법은 구제역 SAT 1, SAT 2, SAT 3형을 동시 진단하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 구제역 7가지 혈청형 감별을 위한 유전자 진단방법은 7가지 혈청형(O, A, Asia 1, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3)을 서로 다른 밴드 크기로 진단하는 것을 특징으로 한다.
이때, 7가지 혈청형 모두를 1개의 튜브 안에서 진단하고자 할 때, 특이도 및 민감도 저하를 초래할 수 있으므로 상기한 동시 진단 세트 또는 7가지 혈청형을 따로 진단하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 의한 구제역 7가지 혈청형 감별을 위한 유전자 진단방법은 그 진단방법에 사용되는 각각의 프라이머의 염기서열을 제공하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 구제역 7가지 혈청형 감별을 위한 유전자 진단키트는, 상기 1) O형과 Asia 1형, 2) A형과 C형, 3) SAT 1, SAT 2, SAT 3형의 감별 진단 유전자 진단방법을 동시에 실시하도록 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 구제역 7가지 혈청형 감별을 위한 유전자 진단방법에 의하면, 비 특이가 없고 7가지 혈청형을 감별할 수 있는 프라이머 시퀀스를 새롭게 디자인하였고, 또한 Premix형태의 kit를 사용하여 RNA시료만 넣고 반응할 수 있도록 하였으며, 같은 온도 조건에서 one-step RT-PCR 할 수 있도록 하여 진단 시간의 신속성과 편리성을 확보하였다.
비 특이를 최대한 줄이면서 혼합 감염을 확인할 수 있도록, 1) O형과 Asia 1형, 2) A형과 C형, 3) SAT 1, SAT 2, SAT 3형을 각각 한 튜브에서 반응시키도록 전략을 마련하였다. 또한, 대한민국과, 전문 인력, 여건이 부족하며 구제역의 여러 가지 혈청형이 혼재하는 아시아 국가들에서도 실제로 적용해 보아 그 실용성을 확인하였다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도 2 내지 도 4를 참조하여 상세히 설명한다.
종래에는 현재까지 혈청형 감별에 사용되고 있었던 프라이머(Vangrysperre and De Clercq., Arch. Virol. (1996)) 적용시 Asia 1형의 몽골 분리주(Asia 1/MOG/05)를 특이적으로 진단하지 못하였다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이에 의해 한정되는 것은 아니고, 당업자에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본원 발명의 범위에 포함된다.
실시예 1 : 구제역 혈청형 감별 전략 확립 및 진단에 사용되는 프라이머 제작.
구제역의 혈청형 감별을 위하여 간섭현상을 최소화하면서 동시 진단이 가능하도록 하였다. 1) O형과 Asia 1형, 2) A형과 C형, 3) SAT 1, SAT 2, SAT 3형의 3개의 세트를 사용하여 동시 진단하였다. 각각의 세트 내에서는 전기 영동 상의 밴드 크기로 혈청형 감별이 가능하도록 하였다. 프라이머는 블라스트(Blast(NCBI))와 바이오 에디트 프로그램(Bio edit program)(Hall, T. A. Bio edit : a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. 1999. Nucleic Acids Symp Ser 41 : 95-98)을 사용하여 디자인하였으며, 디자인에 사용된 분리주의 유전정보는 C. Carrillo 의 논문의 표1의 유 전정보(C. Carrillo et al, 2005. J .Virol. Vol79, 6487-6504) 및 Asia 1/MOG/05 주(Genebank accesion no. EF614458)를 토대로 하였다. 디자인된 프라이머의 염기서열은 하기 표 1과 같다. 프라이머 시퀀스는 Bioneer corporation (Republic of Korea)에 의뢰하여 oligonucleotide로 제작하였다.
표 1. 본 연구에 사용된 진단 프라이머
No Name Specificity Direction Sequence size bp(type)
1 O-F1a O, Asia type multiplex Forward GGTGCCATCAAGGCAACTCGTGT
(서열번호 1)

190(O)
O-F1b Forward GTGCCATCAAAGCCACTCGGGT
(서열번호 2)
O-F1c Forward GCCATCAAAGCGACCCGGGT
(서열번호 3)
Asia1_F1 Forward CGACTGCCTACCAGAAGMARCCCA
(서열번호 4)

390(Asia 1)
All7_2AbR Reverse AARAAGAARGGYCCRGGGTT
(서열번호 5)
2 All4_VP1 F A, C type multiplex Forward TGCCACNGTNGARAACTAYGGHGG
(서열번호 6)
540(A)


270(C)
A_R Reverse TCATGCGCACGAGRAAGCTCGTG
(서열번호 7)
C_R Reverse GGGATTGGTTGTGTTGTYAAGTGCAGAAAC
(서열번호 8)
3 SAT common F1 SAT 1,2,3 common Forward ACACTTYCGYGACACCATGAA
(서열번호 9)

496(SAT)
SAT common R Reverse CCTYCGTTCAGGCGYTTGT
(서열번호 10)
<시험예 1> 특이적 진단 결과 확인
제작한 프라이머를 사용하여 각 바이러스 혈청형을 감별하는 것이 가능한지 알아보기 위하여 각각의 구제역 바이러스 RNA를 사용하여 One-step RT-PCR을 실시한 뒤 전기 영동하였다.
구제역 7가지 혈청형 RNA 추출을 위하여 바이러스를 준비하였다. 구제역 바 이러스 7종 중 O/SKR/2002는 우리나라 분리주이며, 5종(O1 Manisa, Asia 1/CAM/9/80, A22/IRQ 24/64, C3/Resende, SAT 1/BOT 1/68, SAT 2/ZIM 5/81 and SAT 3/ZIM 4/81)은 영국 퍼브라이트 연구소에서, Asia 1/MOG/05는 몽골 중앙수의연구소로부터 도입되었다. 바이러스 증식을 위해 IBRS-2 세포주가 사용되었다. 이들 세포는 10% fetal bovine serum (FBS)과 항생제를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (D-MEM)의 배지로 5% 이산화탄소를 유지하는 37℃ 배양기에서 증식시켰다.
바이러스는 세포에서 증식 후 CPE(cytopathic effect)를 확인한 뒤 -70℃ 에서 얼렸다 녹이기를 2회 반복하고 원심을 돌려 수확하였다. 수확된 바이러스의 역가는 formula of Reed and Muench방법을 사용하여 50% tissue culture infective dose (TCID50)을 계산하였다.
바이러스 상층액으로 RNA/DNA extraction kit(Intron)을 사용하여 각 바이러스의 핵산을 추출하고 -70℃에 보관하였다. 추출 과정은 kit의 매뉴얼을 따랐다.
-70℃에서 꺼내 녹인 RNA를 Maxime RT-PCR Premix kit(Intron, Republic of Korea)을 사용하여 One-step RT-PCR 과정을 진행하였다. 간단히 설명하면, RT-PCR Premix에 5 pmol의 forward 와 Reverse primer를 각각 1 ㎕, RNA template 3 ㎕, RNase-free water를 16 ㎕를 넣어 total 20 ㎕를 맞춘다. 조성을 맞춘 튜브를 GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystem)를 사용하여 RT-PCR을 시행하였다. RT-PCR 조건은 표 2과 같다. RT-PCR 시행 후 전기 영동하여 band를 확인하였다.
표 2. RT-PCR 반응조건
RT-PCR cycle Temperature(℃) Time
1 cycle RT-reaction 45 30 분
Inactivation of RTase 94 5 분
40 cycle Denaturation 94 30 초
Annealing 55 30 초
Extension 72 1 분
전기 영동 결과 구제역 7가지 혈청형에서 각각의 프라이머 세트를 적용하였을 때 혈청형간 비특이가 관찰되지 않았으며, 의도한 크기의 band를 확인할 수 있었다(도 2a, 도 2b). 또한 여러 혈청형이 혼재하여 존재할 때에도 각 혈청형 구별이 가능함이 증명되었다(도 3).
<시험예 2> 진단 프라이머의 민감도 측정 및 특이도 확인
FMDV는 혈청형별로 3×105 TCID50 바이러스 상층액을 RNA/DNA extraction kit (Intron)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 10배 단계 희석한 후 FMDV의 copy 수 계산을 위하여 one-step Primescript RT-PCR kit (TAKARA, Japan)와 ABI 7500 Real-time PCR System (Applied Biosystem, USA)를 사용하여 real-time RT-PCR을 시행하였다. 구제역 7가지 혈청형을 모두 확인하기 위한 프라이머로서는 3D 부분을 목적으로 하는 프라미어 sense 5'-GGA ACY GGG TTT TAY AAA CCT GTR AT-3'와 antisense 5'-CCT CTC CTT TGC ACG CCG TGG GA-3'를 사용하였다. 프로브(Probe)는 5'말단에는 FAM을, 3'말단에는 TAMRA를 라벨링한 5'-CCC ADC GCA GGT AAA GYG ATC TGT A-3'를 사용하였다. copy 수가 계산된 바이러스 핵산을 각 프라이머 세트에 적용하여 표 2에서와 같은 조건으로 One-step RT-PCR을 시행하였다. RT-PCR 시행후 전기 영동하여 확인되는 밴드를 통해 민감도를 확인하였다. 구제역 혈청형 감 별을 위한 세트 1(O, Asia1), 세트 2(A, C)를 적용하였을 때는 102∼103 copy까지 확인이 가능하였고, 세트 3를 사용하여 SAT type에 적용하였을 때는 103∼104 까지 확인이 가능하였다(도 4). 혈청형 별로 측정된 민감도를 정리하여 보면 표 3과 같다.
표 3. 프라이머 세트별 검출 한계
No. 진단대상 적용 바이러스 strain 검출한계
(RNA copy no.)
Set 1 O, Asia 1 O/SKR/2002 1 × 103
Asia 1/MOG/05 5 × 103
Set 2 A, C A22/IRQ/24/64 5 × 102
C3/Resende 5 × 102
Set 3 SAT 1, 2, 3 SAT 1/BOT 1/68 5 × 103
SAT 2/ZIM 5/81 5 × 104
SAT 3/4/81 5 × 103
<시험예 3> 몽골과 베트남 구제역 야외시료 적용을 통한 실증 시험
확립된 구제역 진단세트 중 세트 1(O, Aisa1), 세트 2(A, C)에 대하여 베트남과 몽골의 야외시료를 사용한 실증시험을 실시하였다. RNA 추출과 one-step RT-PCR은 <시험예 1> 의 과정을 그대로 따랐다.
베트남에서는 항원 ELISA 결과가 있는 패널을 사용하여 그 결과를 비교하였다(표 4). 항원 ELISA 양성시료에서 동일한 혈청형으로 판정되었고 (특이도 100%) 특히, 항원 ELISA에서 음성으로 판정한 시료에 대하여 O형 특이적 프라이머(primer)에서 양성으로 판정된 1개의 시료가 존재하였다(표 5).
몽골의 야외 가검패널 (표 5)을 사용하여 동일한 실험을 진행하였고 그 결과 를 양성, 음성만을 판별할 수 있는 Real-time RT-PCR과 비교하였다. 그 결과 혈청형 감별을 위한 유전자 진단세트를 적용하였을 때 혈청형 감별 특이도는 100%를 보였다(표 6).
다만 Real-time RT-PCR시 500 copy 이하로 측정된 2개 시료는 본 진단방법으로 진단할 수 없었다. 이 결과는 표 3의 세트별 검출 한계와 일치하였다. 본 발명에 대한 베트남과 몽골에서의 야외 실증 시험 결과 항원 ELISA보다 뛰어난 민감도와 100%의 혈청형 감별 특이도를 보여주었다.
표 4. 베트남에서의 야외시료 적용 결과
국가 진단법 프라이머 serotype 혈청형별 진단결과 (시료 수)c
O(25) Asia 1(6) 음성(5) 음성(1)b
베트남 유전자 동시
진단법		 set 1 Oa 25 0 0 1
Asia 1a 0 6 0 0
set 2 Aa 0 0 0 0
Oa 0 0 0 0
a 혈청형 감별 특이도 100%
b 민감도는 항원 ELISA보다 뛰어남. 항원 ELISA 음성시료가 set 1과 2에서 양성 판정
c 양성, 음성 및 혈청형 감별은 항원 ELISA 결과와 비교하였음
표 5. 몽골에서 제공한 가검시료 패널
연번 시료채취장소 등록일자 축종 채취조직
1 Bayan-Ulgii 2002.08 Cattle epithelium
2 Bayan-Ulgii 2002.08 Cattle epithelium
3 Hovd Erdeneburen 2002. Cattle epithelium
4 Dornogovi Sainshand 2004.02 Cattle epithelium
5 Dornogovi Sainshand 2004.02 Cattle epithelium
6 Dornogovi Sainshand 2004.02 Gazella heart tissue
7 Dornod Bayantumen 2005.08 Cattle epithelium
8 Dornod Bayantumen 2005.08 Cattle epithelium
9 Dornod Bayantumen 2005.08 Cattle epithelium
10 Ulaanbaatar Zaisan 2006.04 Cattle Probang samples
11 Ulaanbaatar Zaisan 2006.04 Cattle Probang samples
12 Ulaanbaatar Zaisan 2006.04 Cattle Probang samples
13 Ulaanbaatar Zaisan 2006.04 Cattle Probang samples
14 Ulaanbaatar Zaisan 2006.04 Cattle Probang samples
15 Dornod Bayantumen 2007.10.08 Gazella pharyngeal tissue
16 Dornod Bayantumen 2007.10.08 Gazella pharyngeal tissue
17 Dornod Bayantumen 2007.10.08 Gazella pharyngeal tissue
18 Dornod Bayantumen 2007.10.08 Gazella pharyngeal tissue
19 Dornod Bayantumen 2007.10.08 Gazella pharyngeal tissue
20 Dornod Bayantumen 2007.10.08 Gazella pharyngeal tissue
21 Cuhbaatar Asgat 2007.10.09 Gazella pharyngeal tissue
22 Cuhbaatar Asgat 2007.10.09 Gazella pharyngeal tissue
23 Cuhbaatar Asgat 2007.10.09 Gazella pharyngeal tissue
24 Cuhbaatar Asgat 2007.10.09 Gazella pharyngeal tissue
25 Cuhbaatar Asgat 2007.10.09 Gazella pharyngeal tissue
26 Dornogovi Sainshand 2007.10.11 Gazella pharyngeal tissue
27 Dornogovi Sainshand 2007.10.11 Gazella pharyngeal tissue
28 Dornogovi Sainshand 2007.10.11 Gazella pharyngeal tissue
29 Dornogovi Sainshand 2007.10.11 Gazella pharyngeal tissue
30 Dornogovi Sainshand 2007.10.11 Gazella pharyngeal tissue
31 Dornogovi Sainshand 2007.10.11 Gazella pharyngeal tissue
32 Dundgovi Deren 2007.10.14 Gazella pharyngeal tissue
33 Dundgovi Deren 2007.10.14 Gazella pharyngeal tissue
34 Dundgovi Deren 2007.10.14 Gazella pharyngeal tissue
35 Dundgovi Deren 2007.10.14 Gazella pharyngeal tissue
36 Dundgovi Deren 2007.10.14 Gazella pharyngeal tissue
37 Dundgovi Deren 2007.10.14 Gazella pharyngeal tissue
38 Dundgovi Deren 2007.10.14 Gazella pharyngeal tissue
39 Dundgovi Deren 2007.10.14 Gazella pharyngeal tissue
40 Dundgovi Deren 2007.10.14 Gazella pharyngeal tissue
41 Dundgovi Deren 2007.10.14 Gazella pharyngeal tissue
42 Ulaanbaatar 2007.10.17 Cattle tongue epthelium
43 Ulaanbaatar 2007.10.17 Cattle tongue epthelium
44 Ulaanbaatar 2007.10.17 Cattle tongue epthelium
45 Ulaanbaatar 2007.10.17 Cattle tongue epthelium
표 6. 몽골에서의 야외시료 적용 결과
국가 진단법 프라이머 serotype 혈청형별 진단결과 (시료 수)c
O(4) Asia 1(3) 음성(38)
몽골 유전자 동시
진단법		 set 2 Oa 2b 0 0
Asia 1a 0 3 0
set 3 Aa 0 0 0
Oa 0 0 0
a 혈청형 감별 특이도 100%
b Real-time RT-PCR에서 양성판정된 2개의 시료는 본 진단법의 검출한계를 벗어남.
c 양성, 음성 판정은 real-time PCR 결과를 토대로 하였음.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 구제역 혈청형 감별을 위한 유전자 진단법은 새롭게 디자인된 프라이머를 사용하여 7가지 혈청형을 전기영동상의 DNA size로 감별할 수 있으며, 시료의 RNA를 추출하여 One-step RT-PCR하는 방법으로 진단할 수 있다. 뿐만 아니라, 3개의 튜브에 동시에 RNA 시료를 넣어 동일한 조건에서 증폭을 진행하도록 설정되어 교차오염을 줄이면서도 간편하게 혈청형 감별이 가능하다. 따라서 본 진단방법을 킷트화할 경우 우리나라 및 주변의 아시아 국가들에서 간편한 사용법과 저렴한 비용으로 짧은 시간안에 구제역 혈청형을 감별해 낼 수 있다.
도 1은 종래의 프라이머(Vangrysperre and De Clercq., Arch. Virol. (1996)) 적용시의 전기영동 결과를 도시한 사진.
도 2a 및 도 2b는 본 발명에 의한 구제역 바이러스에 혈청형 감별 프라이머 적용시의 전기영동 결과를 도시한 사진.
도 3은 혼합 감염시 본 발명의 감별 프라이머를 적용한 결과를 도시한 사진.
도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 구제역 바이러스 적용시의 민감도 측정도를 도시한 사진이다.

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  11. 서열번호 1 내지 10을 사용하여 구제역 혈청형 O형과 Asia 1형, A형과 C형 및, SAT 1, 2, 3 형을 감별하는 One-step RT-PCR 법을 실시하도록 하는 것을 특징으로 하는 구제역 7가지 혈청형 감별을 위한 유전자 진단키트.
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