KR102332856B1

KR102332856B1 - E형 간염 바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102332856B1
Application number: KR1020190131629A
Authority: KR
Inventors: 노재영; 이진영
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2021-12-01
Also published as: KR20210047713A

Abstract

본 발명은 사람에게 E형 간염을 일으킬 수 있는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)를 검출하는 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 등온증폭법 (Loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 이용하여 E형 간염 바이러스를 높은 검출감도로 신속하게 확인 할 수 있는 E형 간염 바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

E형 간염 바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Hepatitis E virus, and use thereof}

세계보건기구(WHO)에 의하면, E형간염은 전 세계적으로 약 2천만명이 감염되고 약 330만명의 유증상자가 발생하며, 2015년에는 약 44,000명이 사망(치명율 약 3.3%)한 것으로 추정하고 있다. 중국, 인도 등 중앙·동남아시아, 중남미, 북아프리카 등 저개발국가가 주요 유행 국가로 알려져 있으나, 미국·일본 등 선진국에서도 육류, 가공식품을 통하여 산발적으로 발생하고 있다.

E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus, HEV)는 칼리시바이러스과(Caliciviridae Family)에 속하며, 크기가 30-34 nm 정도 되는 양성가닥 RNA 바이러스이다.

일반적으로 HEV는 장을 통해 감염되는 비-A형(non-A)/비-B(non-B)형 간염바이러스 병원체이다. 주로 오염된 물이나 식품을 섭취함으로써 전파된다. 오염된 식수가 주요 감염원으로 고려되어 왔지만 최근에는 식육을 포함한 식품 오염에 의한 발생 사례가 보고된 바 있다. 또한 HEV의 항체는 많은 동물 시료에서 검출되었으며, 이는 HEV 인수공통 측면의 가능성을 시사한다. 식품섭취를 통한 직접적인 인수공통 감염의 증거는 식품을 소화함으로써 HEV 간염에 걸린 환자에 의해 밝혀진 바 있다. 다른 예로, 우리나라에서는 2007년 여행력이 없는 여성에게서 중국에서 유행하는 바이러스와 일치하는 제4유전자형을 가진 E형 간염 바이러스가 검출된 바 있어 식품 및 식수 등이 해외반입 되면서 E형 간염 발생이 일어날 수 있음을 시사한다.

HEV에 의한 감염은 경구로 감염되며, 감염된 환자는 바이러스에 노출된 후 15∼60일(평균 40일) 잠복기를 지나서 피로, 복통, 식욕부진 등의 증상이 발생한 후 황달, 진한색 소변, 회색 변 등의 증상을 보인다. 급성 간염으로 만성질환으로 진행되지는 않으나, 일부는 치명성 급성 간염으로 사망하는 경우도 있으며 특히, 임신부, 간질환자, 장기이식환자와 같은 면역저하자의 경우는 치명율이 높아 주의가 필요하다. 특히, 임산부에게 감염이 되는 경우 임산부의 사망률과 태아의 치사율이 각각 20% 및 50%로 매우 높은 것으로 보고되고 있다. 현재까지 E형간염에 대한 특이적인 치료제는 없으며, 보존적 치료(휴식, 수액 보충 등)를 통해 대부분 회복되는 것으로 알려져 있다.

따라서, E형 간염 바이러스를 검출하여 간염을 정확하게 진단하는 것이 매우 중요한 의료적 과제이다. 그러나 상기 E형 간염 바이러스에 대한 배양법은 특별히 알려진 바가 없고, 기존의 기술에서 검출하기에는 민감도가 낮기 때문에 전 세계적으로 이와 관련된 연구에 많은 어려움을 겪고 있다. 특히, 바이러스성 식중독을 일으키는 소화기 바이러스에 대해 환자의 분변, 혈액 등의 가검물에서 병원체를 검출하는 전자현미경을 이용한 방법의 경우, 바이러스의 존재를 확인할 수 있으나, 형태학적 분석이 어렵다는 단점이 있다. 또한 현재 주로 사용되고 있는 분자생물학적 연구 기법인 polymerase chain reaction (PCR), reverse trancription polymerase chain reaction (이하, RT-PCR라 함)과 같은 유전자 검사법은 다수의 샘플을 동시에 감사하기에 부적합하며, 민감도가 낮아 단일 프라이머 쌍으로는 검출이 어렵고 nested RT-PCR을 통해 민감도를 높여야 검출이 가능하지만, 프라이머 제작 비용이 많이 들고 검출에 많은 시간이 소요되는 단점이 있다. 또한, 혈청학적 방법인 효소 면역 측정법 (Enzyme Immuno Assay; EIA)의 경우, 임상 양상이 서로 비슷한 바이러스의 구분이 가능하다는 장점이 있지만, 바이러스의 증식, 감염성 여부의 평가가 어렵고, 위음성 결과가 보고되어 정확도가 떨어지는 단점이 있다.

따라서, 이러한 문제점 없이 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)를 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있는 기술이 개발될 필요성이 존재한다.

대한민국 공개특허번호 제10-2012-0052801호

본 발명자들은 E형 간염을 일으킬 수 있는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)를 높은 민감도로 검출할 수 있도록 연구 노력한 결과, 신속하고 높은 검출감도로 E형 간염 바이러스를 진단할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 E형 간염 바이러스 외에 다른 종의 바이러스와는 반응하지 않는 종 특이성이 높고 단일 온도에서 유전자 증폭이 가능하므로 신속하면서도 높은 특이성 및 높은 검출감도로 E형 간염 바이러스를 검출할 수 있는 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 E형 간염 바이러스를 검출할 수 있는 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 이용하여 E형 간염 바이러스의 감염여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 진단용 키트 및 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 포함하는, E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 4의 염기서열은 상기 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)의 ORF2 유전자를 주형으로 설계 및 제작된 것이다.

또한, 본 발명은 상술된 프라이머 세트를 포함하는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함한다.

또한, 본 발명은 상술된 조성물을 포함하는, E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)를 검출하기 위한 진단용 키트를 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)는 GenBank accession number FJ763142.1이다.

또한, 본 발명은 대상시료로부터 RNA를 추출하는 단계; 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; 상기 cDNA를 주형으로, 상술된 프라이머 세트를 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 등온증폭법(LAMP)을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV) 진단방법을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인관측정 중 어느 하나를 통해 수행되는 것이다.

먼저, 본 발명의 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 E형 간염 바이러스 외에 다른 종의 바이러스와는 반응하지 않는 종 특이성이 높고 단일 온도에서 유전자 증폭이 가능하므로 신속하면서도 높은 특이성 및 높은 검출감도로 E형 간염 바이러스를 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 E형 간염 바이러스를 검출할 수 있는 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 포함하는 진단용 키트 및 진단 방법에 의하면, 빠르고 높은 검출강도를 가지면서도 정확하게 E형 간염 바이러스의 감염여부를 진단할 수 있어, 감염 환자를 대상으로 치료를 위한 빠른 처치가 가능하다.

본 발명의 이러한 기술적 효과는 이상에서 언급한 범위만으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 실시를 위한 구체적 내용의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 효과 역시 당연히 포함된다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 E형 간염 바이러스의 어닐링 온도별 등온증폭산물 전기영동 결과를 보여주는 것이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 실시예에 따른 E형 간염 바이러스와 참고 수인성 바이러스 10종을 포함한 총 11종의 등온증폭반응을 통해 프라이머 세트1 및 3의 특이성 결과를 보여주는 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 프라이머 세트의 검출감도를 확인하기 위하여 E형 간염 바이러스의 핵산을 단계희석법으로 희석 후 등온증폭반응을 통해 프라이머 세트의 검출감도를 보여주는 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 프라이머 세트의 조합으로 증폭된 반응산물의위양성 여부를 판별하기 위하여 증폭산물을 제한효소 처리한 후 전기 영동한 결과를 보여주는 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다.

본 발명에서 언급한 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우 '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성 요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.

구성 요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.

본 발명의 여러 구현예들 각각의 특징적인 부분들은 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합가능하고, 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 구현예들은 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시할 수도 있다.

본 발명에서 '프라이머'는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형 (template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머 레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명의 기술적 특징은 E형 간염 바이러스 외에 다른 종의 바이러스와는 반응하지 않는 종 특이성이 높고 단일 온도에서 유전자 증폭이 가능하므로 신속하면서도 높은 특이성 및 높은 검출감도로 E형 간염을 일으킬 수 있는 E형 간염 바이러스를 신속하고 높은 검출감도로 검출할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도를 제공하는 것에 있다.

즉, 본 발명자들은 단시간 내에 전문장비 없이 E형 간염을 일으킬 수 있는 E형 간염 바이러스를 현장에서 실시간으로 검출하기 위해 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하였는데, 등온증폭법은 일반적인 PCR 방법과 유사하나, PCR 방법은 반응 온도를 수십 회 이상 조절하여 표적 유전물질을 증폭하여 검출하기 때문에 중합효소연쇄반응기(thermocycler)와 같은 전문적인 장비가 필요하고, 온도 변화를 수십 초 내에 안정적으로 구현해야 하는 반면 등온증폭법은 반응 온도의 변화 없이, 단일 온도 (상온 내지 65℃ 이하의 고온)에서 표적 유전물질의 증폭이 가능하다는 장점을 가지고 있기 때문이다. 다시 말해 등온증폭법은 핵산말단가수분해효소(exonuclease) 기능을 가지고 있는 Bst. DNA 중합효소 (Bst. polymerase)를 사용함으로써 열에 의존하지 않고 DNA 이중나선 구조의 변성이 가능하기 때문에, 본 발명의 등온증폭법을 이용한 바이러스의 진단은 기존의 RT-PCR(polymerase chain reaction)과 달리 유전자를 증폭하기 위한 온도조절을 필요로 하지 않아 전문장비 없이 유전자를 증폭할 수 있으며 단시간 내에 고농도의 유전자 증폭이 가능하기 때문에 일반적으로 PCR에서는 구현이 어려운 현장진단에 용이하다.

따라서, 본 발명의 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)를 검출하기 위한 것으로서, 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 포함할 수 있다. 필요한 경우 본 발명의 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 4의 염기서열로만 구성될 수도 있음은 물론이다.

여기서, 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하는데, 이중 F3와 FIP는 유전자의 5' 방향에 결합하는 프라이머이며, B3와 BIP는 3' 방향에서 역방향으로 결합하는 프라이머이고, 이 중 FIP는 F2, F1c 염기서열, BIP는 B2, B1c 염기서열이 포함되어 있는 프라이머이다. 또한 등온증폭법에 사용되는 4종류의 프라이머는 구체적으로 외부 프라이머 (outer primer) 정방향 및 역방향, 내부 고리 프라이머 (inner loop primer) 정방향 및 역방향으로 구분될 수 있는데, 본 발명에 따른 등온증폭 반응용 프라이머 세트에 포함된 서열번호 1 내지 4의 염기서열은 일 구현예로서 서열번호 1의 외부 정방향 프라이머, 서열번호 2의 외부 역방향 프라이머, 서열번호 3의 내부 정방향 고리 프라이머, 서열번호 4의 내부 역방향 고리프라이머를 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트 즉 서열번호 1 내지 4의 염기서열은 전체 바이러스 서열이 아닌 E형 간염 바이러스의 ORF2 유전자 부위의 염기서열을 주형으로 하여 제작하였다. 이와 같이 본 발명에서는 capsid protien 유전자가 포함되어 있는 ORF2 염기서열을 주형으로 등온증폭 프라이머를 설계 및 제작 한 것이 특징인데, 일 구현예로서 E형 간염 바이러스(NCBI No. FJ763142.1)의 ORF2 유전자(5,000-7,238 nt)를 주형으로 등온증폭 프라이머를 설계 및 제작하였다.

본 발명의 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물은 프라이머 세트를 포함하는데, 필요한 경우 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 진단용 키트는 등온증폭 반응용 프라이머 조성물을 포함하여 수인성 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)를 검출할 수 있는데, E형 간염 바이러스는 GenBank accession number FJ763142.1일 수 있다.

또한, 본 발명의 진단방법은 대상시료로부터 RNA를 추출하는 단계; 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; 상기 cDNA를 주형으로, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 등온증폭법(LAMP)을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함한다. 여기서, 증폭 산물을 검출하는 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인관측정 중 어느 하나를 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 등온증폭 반응용 프라이머는 종 특이적 염기서열로부터 디자인된 프라이머로서, 실제 E형 간염 바이러스에 감염 되었는지 여부를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 이론적으로 합성된 E형 간염 바이러스 유전자도 검출 가능하며, 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비 특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 검출력이 우수하다. 또한, 본 발명의 등온증폭 반응용 프라이머를 이용한 반응은, 반응의 조건을 모든 바이러스 및 프라이머 조합에서 동일하게 하여 검출의 효율을 높일 수 있도록 설계되었다.

실시예 1

1. 바이러스 핵산 수집

등온증폭법의 특이성을 확인하기 위하여, 발명 대상 바이러스인 E형 간염 바이러스의전체 염기서열(NCBI No. FJ763142.1)중, ORF2에 위치한 capsid 유전자로 알려져 있는 염기서열 일부를(5,000-7,238 nt) 유전자 염기서열 합성을 통해 plasmid 형태로 확보하였다. 참고 바이러스 10종 [Aichivirus-A (AiV-A), Rotavirus (RV), enteric Adenovirus-41(AdV-41), Hepatitis A virus (HAV), Sapovirus (SV), Enterovirus 68 & 71 (EV), Human Astrovirus (HuAstV), Parechovirus A & Echovirus-5 (PeV), Norovirus (NoV) 및 Poliovirus (PoV)]은 바이러스로부터 RNA 추출 후 cDNA 합성 또는 유전자 염기서열 합성을 통해 plasmid 형태로 핵산을 수집하였다.

2. 등온증폭 반응용 특이적 프라이머 제작

E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)를 등온증폭법을 통하여 진단하기 위해, 프라이머 설계는 Primerexplorer V3 프로그램을 이용하여 설계 하였다. 등온증폭법을 수행하기 위해서는 4종류의 프라이머 (F3, B3, FIP, BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하며, 위와 같이 수집된 대상 바이러스 및 참고 바이러스 유전자의 염기서열을 비교하여 E형 간염 바이러스 특이적인 프라이머(세트1)를 제작하였다.

하기 표 1은 본 발명의 실시예에 따라 설계 제작된 등온증폭반응용 프라이머(LAMP 프라이머) 세트1의 염기서열을 나타낸 것이다.

프라이머				LAMP 프라이머 서열 (5'-3')
조합 번호	이름	구분	서열 번호	LAMP 프라이머 서열 (5'-3')
세트 1	HEV set1 F3	Outer	1	ACACGGTTTATGAAGGATCT
	HEV set1 B3	Outer	2	CGTTCTCAACTGAGGTGTA
	HEV set1 FIP	Inner	3	GAGAAGTGTGTCAGCAAGGTCTAATGGTGTTGGTGAGGTT
	HEV set1 BIP	Inner	4	AATTGATTTCGTCGGCTGGTAAGTTTCACTGTCGGCTC

비교예 1 및 2

실시예1과 동일한 방법을 사용하여 E형 간염 바이러스 특이적인 프라이머(세트2 및 세트3)를 제작하였다.

하기 표 2는 본 발명의 비교예1 및 2에 따라 각각 설계 제작된 등온증폭반응용 프라이머(LAMP 프라이머) 세트2 및 3의 염기서열을 나타낸 것이다.

프라이머				LAMP 프라이머 서열 (5'-3')
조합 번호	이름	구분	서열 번호	LAMP 프라이머 서열 (5'-3')
세트 2	HEV set2 F3	Outer	5	CGTTATGCTCTGCATTCATG
	HEV set2 B3	Outer	6	TCATAAACCGTGTAGCGG
	HEV set2 FIP	Inner	7	AGCTCAAGCGCGAAATCAAGGGTCACCTGTGAACTCTT
	HEV set2 BIP	Inner	8	ATACGCGCGTCTCTCGTTATGTTAACTCAGCAGTGCCA
세트 3	HEV set3 F3	Outer	9	CTTGATTTCGCGCTTGAG
	HEV set3 B3	Outer	10	AAACAAGGTAAGCGCTATC
	HEV set3 FIP	Inner	11	CAATTTATGGCGCGCACTACCGTAATTTGACACCTGGC
	HEV set3 BIP	Inner	12	CGATGGCACTGCTGAGTTAAAACACCATTAGTCCCTGTA

실시예 2

실시예 1에서 제작된 프라이머 세트(세트1)가 E형 간염 바이러스를 검출하는데 사용가능한지 확인하기 위하여, 등온증폭 반응용 프라이머 조성물(세트1)을 다음과 같이 제조하였다.

E형 간염 바이러스의 핵산은 E형 간염 바이러스(NCBI No. FJ763142.1)의 ORF2 유전자(5,000-7,238 nt)의 염기서열을 ㈜마크로젠에 의뢰하여 유전자 합성을 진행하였다. 해당 염기서열을 합성 후, pTOP Blunt V2 vector에 합성된 유전자를 삽입하여 동결건조된 형태로 제공받았다.

그 후, 10배 (10X) 등온증폭 반응버퍼 (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50% Glycerol, 0.1% Triton X-100) 2 uL, 2.5 mM dNTPs (각각 2.5 mM이 포함되어 있는 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 혼합물) 2 uL, 10 pmole 농도의 F3 및 B3 프라이머 2 uL, 20 pmole 농도의 FIP 및 BIP 프라이머 3 uL, 주형핵산으로 합성된 plasmid DNA 1 uL (1 ng/uL) 및 멸균증류수 3.5 uL를 반응 튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 등온증폭 반응 조성물을 95℃에서 10 분 및 4℃에서 1 분간 반응 시킨 후, Bst. polymerase (8 unit/uL) 1uL를 반응튜브에 첨가하여 최종적으로 등온증폭 반응용 프라이머조성물(세트1) 20 uL를 제조하였다.

비교예 3 및 4

실시예 1에서 제작된 프라이머 세트(세트1)가 아니라 각각 비교예 1 및 2에서 제작된 프라이머 세트(세트2 및 세트3)을 사용한 것을 제외하면 실시예2와 동일한 방법으로 비교예 등온증폭 반응용 프라이머조성물1(세트2) 및 비교예 등온증폭 반응용 프라이머조성물2(세트3)를 각각 20 uL씩 제조하였다.

실험예 1

실시예 2 및 비교예 3 및 4에서 제조된 등온증폭 반응용 프라이머조성물(세트1), 비교예등온증폭 반응용 프라이머조성물1 및 2(세트2 및 세트3)을 이용하여 E형 간염 바이러스의 주형 핵산을 대상으로 등온증폭 반응을 수행하였는데, 등온증폭반응은 60, 62 및 64℃에서 1시간 동안 수행하였다. 반응이 완료된 증폭산물 20 uL 중 5 uL를 1 uL의 6X loading dye와 혼합하여 1.2% agarose gel 에 전기영동 하여 유전자가 증폭 되었는지를 자외선 상에서 발색반응으로 확인하고 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1로부터, 비교예등온증폭 반응용 프라이머조성물 2(세트2)에서는 등온증폭반응이 확인되지 않았으나, 실시예1의 프라이머 세트1이 포함된 등온증폭 반응용 프라이머조성물(세트1) 및 비교예등온증폭 반응용 프라이머조성물 2(세트3)에서는negative control을 제외한 반응온도에서 모두 증폭하는 것을 확인할 수 있었다. 여기서 "60, 62, 64"는 등온증폭반응 온도를 나타낸 것이고, "N"은 negative control로서 E형 간염 바이러스 주형핵산으로 합성된 plasmid DNA를 포함하지 않은 시료이다.

실험예 2

실험예1에서 등온증폭반응이 확인된 실시예1에서 제조된 프라이머 세트1은 물론 비교예2에서 제조된 프라이머 세트3을 대상으로 이들 프라이머세트가 E형 간염 바이러스에 대해 특이적으로 등온 증폭되는지 확인하기 위해, 실시예 2에서 제조된 등온증폭 반응용 프라이머조성물(세트1) 및 비교예4에서 제조된 등온증폭 반응용 프라이머조성물2(세트3)를 이용하여 실시예 1에서 수집한 참고바이러스 10종을 포함하여 등온증폭 반응을 수행하였는데, 반응온도는 62℃로 실시하였다. 반응이 완료된 증폭산물 20 uL 중 5 uL를 1 uL의 6X loading dye와 혼합하여 1.2% agarose gel 에 전기영동 후 유전자가 증폭 되었는지 확인하고 그 결과를 도 2a(세트1) 및 도 2b(세트3)에 나타내었다.

도 2a 및 도 2b는 E형 간염 바이러스 및 참고 바이러스 10종의 핵산을 주형으로 사용하여 등온증폭반응을 통해 프라이머 세트 1 및 프라이머 세트 3의 E형 간염 바이러스의 특이적 반응을 확인한 것이다. 여기서, "HEV, AiV-A, RV-A, AdV-41, HAV, SV, EV, AstV, PeV, NoV 및 PoV"는 실시예 1에 표기된 대상 바이러스 및 참고 바이러스 10종의 약어를 나타낸 것이고, "N"은 negative control로서 주형 핵산 즉 E형 간염 바이러스의 plasmid DNA를 포함하지 않은 시료이다.

도 2a에 도시된 바와 같이, 프라이머 세트 1은 대상 바이러스인 E형 간염 바이러스에서만 등온증폭반응이 확인되어, E형 간염 바이러스를 특이적으로 증폭 할 수 있는 것이 확인되었다. 하지만, 도 2b에 도시된 바와 같이 프라이머 세트 3은 Echovirus에서 비특이 반응이 확인되어 E형 간염 바이러스를 특이적으로 증폭 할 수 없는 것이 확인되었다.

따라서, 실시예1에서 제작된 프라이머 세트1이 E형 간염 바이러스 주형핵산을 등온 증폭시키기에 적합한 프라이머 세트임을 알 수 있다.

실험예 3

실시예1에서 제조된 프라이머 세트1의 E형 간염 바이러스에 대한 검출민감도를 확인하기 위해, E형 간염 바이러스의 주형핵산인 plasmid DNA를 단계희석법으로 희석 후 등온증폭 반응을 수행하였다. 등온증폭반응용 프라이머 조성물은 실시예 2에서 제조된 등온증폭 반응용 프라이머조성물(세트1)을 사용하였으며, 반응온도는 60, 62, 64℃로 실시하였다. 반응이 완료된 증폭산물 20 uL 중 5 uL를 1.2% agarose gel 에 전기영동하여 유전자가 증폭 되었는지 확인하고 그 결과를 도 3에 도시하였다.

도면 3은 본 발명의 등온증폭 반응용 프라이머조성물(세트1)이 E형 간염 바이러스를 검출할 수 있는 검출민감도를 확인한 결과이다. 여기서 "10^-3부터 10^-7"은 주형 plasmid DNA의 희석 배율을 나타낸 것이며, "N"은 negative control로서 주형 plasmid DNA를 포함하지 않은 시료이다. 도 3으로부터, 제작된 프라이머 세트 1은 10^-3(100 pg/uL) 희석 배율 까지 아스트로 바이러스를 진단 할 수 있는 것이 확인되었다.

실험예 4

실시예1에서 제조된 프라이머 세트1의 등온증폭반응의 위양성 여부를 확인하기 위하여, 세트 1의 F3 (염기서열 1), B3 (염기서열 2) 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 다음과 같이 진행 하였다. PCR 조성물은 10배 (10X) PCR 반응 버퍼 (20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1% Triton X-100 및 50% glycerol) 2.5 uL, 10 mM dNTPs (각각 10 mM이 포함되어 있는 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 혼합물) 2 uL, 10 pmole 농도의 F3 및 B3 프라이머 1 uL, 주형 plasmid DNA 1 uL, HS Taq polymerase (2.5 units) 0.1 uL 및 멸균증류수 17.4 uL를 반응 튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 PCR 조성물을 94℃에서 5 분 간 반응 후 94℃ 30 초, 62℃ 30 초, 72℃ 45초로 35회 반복하였다. 최종적으로 72℃에서 3분간 반응 하여 PCR 반응을 마무리 하였다. 프라이머 세트 1 (염기서열 1 내지 4)의 증폭 염기서열 범위 내 처리 가능한 Hae III 제한효소 (5'-GG/CC-3')로 제한효소 처리를 진행하였다. 제한효소 처리는 증폭산물 5 uL, 제한효소 반응 버퍼 (50 mM Potassium Acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM Magnesium Acetate 및 100 ug/ml BSA) 1 uL, 제한효소 4 uL로 총 10 uL의 제한효소 처리 조성물을 제조 후 37℃에서 2시간 반응하였다. 반응이 완료된 산물 10 uL 전부를 1.2% agarose gel 에 전기영동 하여 등온증폭반응의 위양성 여부를 확인하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도면 4는 실시예1에서 제조된 프라이머 세트1의 등온증폭반응의 위양성 여부를 확인한 결과이다. 여기서 "Hae III"은 프라이머 세트 1의 F3, B3 프라이머를 이용한 PCR 증폭 산물을 Hae III 제한효소로 처리한 결과를 나타낸 것이다. 따라서, 도 4로부터 증폭산물을 Hae III로 제한효소 처리 할 경우 83 + 79 + 55 bp의 절단된 증폭산물이 확인되므로, 본 발명에서 설계된 프라이머 세트가 실제 E형 간염 바이러스의 ORF2에 위치한 capsid 유전자를 증폭한다는 것을 알 수 있다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

<110> DANKOOK UNIVERSITY <120> Primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Hepatitis E virus, and use thereof <130> DPP-2019-0103-KR <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer <400> 1 acacggttta tgaaggatct 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer <400> 2 cgttctcaac tgaggtgta 19 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer <400> 3 gagaagtgtg tcagcaaggt ctaatggtgt tggtgaggtt 40 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer <400> 4 aattgatttc gtcggctggt aagtttcact gtcggctc 38 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer <400> 5 cgttatgctc tgcattcatg 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer <400> 6 tcataaaccg tgtagcgg 18 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer <400> 7 agctcaagcg cgaaatcaag ggtcacctgt gaactctt 38 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer <400> 8 atacgcgcgt ctctcgttat gttaactcag cagtgcca 38 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer <400> 9 cttgatttcg cgcttgag 18 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer <400> 10 aaacaaggta agcgctatc 19 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer <400> 11 caatttatgg cgcgcactac cgtaatttga cacctggc 38 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer <400> 12 cgatggcact gctgagttaa aacaccatta gtccctgta 39

Claims

서열번호 1 내지 4의 염기서열을 포함하는 프라이머 세트로서,
상기 프라이머 세트는 GenBank accession number FJ763142.1인 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)에 특이적으로 결합되고,
상기 서열번호 1 내지 4의 염기서열은 상기 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)의 ORF2 유전자를 주형으로 설계 및 제작된 것을 특징으로 하는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트.
삭제
제 1 항의 프라이머 세트를 포함하는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물.
제 3 항에 있어서,
등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물.
제 3 항 또는 제 4 항의 조성물을 포함하는, E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)를 검출하기 위한 진단용 키트.
삭제
인체를 제외한 대상시료로부터 RNA를 추출하는 단계;
상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
상기 cDNA를 주형으로, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 등온증폭법(LAMP)을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및
증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV) 진단방법.
제 7 항에 있어서,
상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인관측정 중 어느 하나를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV) 진단방법.