KR102202688B1 - 로타바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사람에게 급성 위장염을 일으킬 수 있는 로타바이러스(Rotavirus;RV)를 높은 검출감도로 신속하게 확인 할 수 있는 로타바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 사람에게 급성 위장염을 일으킬 수 있는 로타바이러스(Rotavirus;RV)를 높은 검출감도로 신속하게 확인 할 수 있는 로타바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
수인성식품매개질환은 병원성미생물(바이러스) 또는 독성 물질에 오염된 물, 식품 등을 섭취하여 발생하는 모든 질환을 의미한다. 수인성식품매개질환은 원인 병원성 미생물이 경구를 통해 위장관에서 증식을 하면서 염증을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 주로 복통, 설사, 오심, 구토 등의 위장관과 관련된 증상을 보이는 것으로 보고되었다. 국내에서 유행하는 수인성식품매개질환 원인 바이러스는 노로바이러스, 로타바이러스, 콕사키바이러스, 아데노바이러스, 로타바이러스 등으로 보고되었다.
로타바이러스(Rotavirus)는 레오비리대(Reoviridae)과에 속하며 개발도상국이나 저개발국에서 급성소아장염 유발원인 중 가장 중요한 요인으로 알려져 있다. 로타바이러스는 항원적으로 서로 다른 6군 (A-F)으로 구성되어 있다. A, B, C군의 로타바이러스는 사람과 동물 모두에게서 나타나고 D, E, F군은 동물에서만 발견된다. 혈청별로 구분되는 군은 서로 공동의 또는 교차되는 항원을 가지고 있는데, 이들 중 A군은 로타바이러스의 존재가 처음 보고된 이후 가장 많이 연구되어 성격 규명이 잘 되어 있고, 사람에게서 분리된 균주들의 대부분을 차지하고 있다.
A군 로타바이러스(Group A rotavirus (RV))는 어린이 및 경제적으로 중요한 많은 동물 종(소, 돼지, 말, 남미 카멜리드(South American camelid) 등)의 새끼에서 심한 설사를 일으키는 주요 원인이다. 공중 건강 문제로서, RV는 개발도상국에서 심한 설사 관련 사망의 세 번째로 일반적인 원인인데(연간 2 백만명의 사망), 주로 5세 이하의 소아에게 급성 감염을 유발하며, 주요 증상은 구토, 발열, 설사 등으로 보고되고 있다. 한편, 어린 송아지와 같은 소비용 동물에서 RV에 의해 유발되는 설사는 예방 및 치료와 관련된 고비용을 초래한다.
종래의 로타바이러스 검출방법은 대변 검체 또는 혈액에서 혈청학적 방법인 효소 면역 측정법 (Enzyme Immuno Assay; EIA) 및 핵산증폭법을 이용한 특이 유전자 (VP4, VP6 또는 VP7)진단이 주로 사용되고 있는 것으로 보고되었다. 그러나, 효소 면역 측정법의 경우, 임상 양상이 서로 비슷한 바이러스의 구분이 가능하다는 장점이 있지만, 바이러스의 증식, 감염성 여부의 평가가 어렵고, 위음성 결과가 보고되어 정확도가 떨어지는 단점이 있다. 핵산증폭법 중 역전사중합효소연쇄반응(reverse-transcription polymerase chain reaction; RT-PCR)은 다른 방법들과 달리 신속하게 진단이 가능하다는 장점이 있으나, 반응 온도를 수십회 이상 조절하여 표적 유전물질을 증폭하여 검출하기 때문에 중합효소연쇄반응기(thermocycler)와 같은 전문적인 장비가 필요하고, 온도 변화를 수십 초 내에 안정적으로 구현해야 하는 어려움이 있다. 더욱이, 로타바이러스의 경우, 진단의 목적 보다는 유전형 결정이나 염기서열 결정을 위한 유전학적인 분석을 위해 사용되는 경우가 많다.
따라서, 이러한 문제점 없이 로타바이러스(Rotavirus:RV)를 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있는 기술이 개발될 필요성이 존재한다.
본 발명자들은 급성 위장염을 일으킬 수 있는 수인성 로타바이러스(Rotavirus:RV)를 높은 민감도로 검출할 수 있도록 연구 노력한 결과, 신속하고 높은 검출감도로 로타바이러스를 진단할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 로타바이러스 외에 다른 종의 바이러스와는 반응하지 않는 종 특이성이 높고 단일 온도에서 유전자 증폭이 가능하므로 신속하면서도 높은 특이성 및 높은 검출감도로 로타바이러스를 검출할 수 있는 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 로타바이러스를 검출할 수 있는 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 이용하여 로타바이러스의 감염여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 진단용 키트 및 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 포함하는, 로타바이러스(Rotavirus;RV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 4의 염기서열은 상기 로타바이러스(Rotavirus;RV)의 VP6 유전자를 주형으로 설계 및 제작된 것이다.
또한, 본 발명은 상술된 프라이머 세트를 포함하는 로타바이러스(Rotavirus;RV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 상술된 조성물을 포함하는, 로타바이러스(Rotavirus;RV)를 검출하기 위한 진단용 키트를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 로타바이러스는 GenBank accession number KF812690.1이다.
또한, 본 발명은 대상시료로부터 RNA를 추출하는 단계; 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; 상기 cDNA를 주형으로, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 등온증폭법(LAMP)을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 로타바이러스(Rotavirus;RV) 진단방법을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인관측정 중 어느 하나를 통해 수행된다.
먼저, 본 발명의 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 로타바이러스 외에 다른 종의 바이러스와는 반응하지 않는 종 특이성이 높고 단일 온도에서 유전자 증폭이 가능하므로 신속하면서도 높은 특이성 및 높은 검출감도로 로타바이러스를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 로타바이러스를 검출할 수 있는 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 포함하는 진단용 키트 및 진단 방법에 의하면, 빠르고 높은 검출강도를 가지면서도 정확하게 로타바이러스의 감염여부를 진단할 수 있어, 감염 환자를 대상으로 치료를 위한 빠른 처치가 가능하다.
본 발명의 이러한 기술적 효과는 이상에서 언급한 범위만으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 실시를 위한 구체적 내용의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 효과 역시 당연히 포함된다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 실시예에 따른 등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 로타바이러스의 등온증폭산물 전기영동 결과를 보여주는 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 로타바이러스와 참고 수인성 바이러스 9종을 포함한 총 10종의 등온증폭반응을 통해 프라이머 세트의 특이성 결과를 보여주는 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 프라이머 세트의 검출감도를 확인하기 위하여 로타바이러스의 핵산을 단계희석법으로 희석 후 등온증폭반응을 통해 프라이머 세트의 검출감도를 보여주는 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 프라이머 세트의 위양성 여부를 판별하기 위하여 증폭산물을 제한효소 처리 후 전기 영동한 결과를 보여주는 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 로타바이러스와 참고 수인성 바이러스 9종을 포함한 총 10종의 등온증폭반응을 통해 프라이머 세트의 특이성 결과를 보여주는 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 프라이머 세트의 검출감도를 확인하기 위하여 로타바이러스의 핵산을 단계희석법으로 희석 후 등온증폭반응을 통해 프라이머 세트의 검출감도를 보여주는 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 프라이머 세트의 위양성 여부를 판별하기 위하여 증폭산물을 제한효소 처리 후 전기 영동한 결과를 보여주는 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다.
본 발명에서 언급한 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우 '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성 요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.
구성 요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.
본 발명의 여러 구현예들 각각의 특징적인 부분들은 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합가능하고, 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 구현예들은 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시할 수도 있다.
본 발명에서 '프라이머'는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형 (template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머 레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.
그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
본 발명의 기술적 특징은 로타바이러스 외에 다른 종의 바이러스와는 반응하지 않는 종 특이성이 높고 단일 온도에서 유전자 증폭이 가능하므로 신속하면서도 높은 특이성 및 높은 검출감도로 급성 위장염을 일으킬 수 있는 로타바이러스를 신속하고 높은 검출감도로 검출할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도를 제공하는 것에 있다.
즉, 본 발명자들은 단시간 내에 전문장비 없이 급성 위장염을 일으킬 수 있는 로타바이러스를 현장에서 실시간으로 검출하기 위해 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하였는데, 등온증폭법은 기존의 RT-PCR(polymerase chain reaction)과 달리 유전자를 증폭하기 위한 온도조절을 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 유전자를 증폭할 수 있으며 단시간 내에 고농도의 유전자 증폭이 가능하기 때문이다.
따라서, 본 발명의 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 로타바이러스(Rotavirus:RV)를 검출하기 위한 것으로서, 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 포함할 수 있다. 필요한 경우 본 발명의 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 4의 염기서열로만 구성될 수도 있음은 물론이다.
여기서, 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하는데, 이중 F3와 FIP는 유전자의 5 방향에 결합하는 프라이머이며, B3와 BIP는 3 방향에서 역방향으로 결합하는 프라이머이고, FIP와 BIP는 F2(혹은 B2)와 F1c(혹은 B1c)의 염기서열을 포함하도록 하는 프라이머이다. 등온증폭법에 사용되는 4종류의 프라이머는 구체적으로 외부 프라이머 (outer primer) 정방향 및 역방향, 내부 고리 프라이머 (inner loop primer) 정방향 및 역방향으로 구분될 수 있는데, 본 발명에 따른 등온증폭 반응용 프라이머 세트에 포함된 서열번호 1 내지 4의 염기서열은 일 구현예로서 서열번호 1의 외부 정방향 프라이머, 서열번호 2의 외부 역방향 프라이머, 서열번호 3의 내부 정방향 고리 프라이머, 서열번호 4의 내부 역방향 고리프라이머를 포함하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트 즉 서열번호 1 내지 4의 염기서열은 전체 바이러스 서열이 아닌 로타바이러스의 VP6 유전자 부위의 염기서열(1-1,194)을 주형으로 하여 제작하였다. VP6 유전자는 로타바이러스의 주요한 외피항원으로 진단에 주로 사용되며 virion의 51%를 차지하는 매우 큰 protein으로 알려져 있다. 본 발명에서는 VP6 유전자를 주형으로 프라이머를 설계 및 제작 한 것이 특징이다.
본 발명의 로타바이러스(Rotavirus:RV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물은 프라이머 세트를 포함하는데, 필요한 경우 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 진단용 키트는 등온증폭 반응용 프라이머 조성물을 포함하여 로타바이러스(Rotavirus:RV)를 검출할 수 있는데, 로타바이러스는 GenBank accession number KF812690.1일 수 있다.
또한, 본 발명의 진단방법은 대상시료로부터 RNA를 추출하는 단계; 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; 상기 cDNA를 주형으로, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 등온증폭법(LAMP)을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함한다. 여기서, 증폭 산물을 검출하는 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인관측정 중 어느 하나를 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 등온증폭 반응용 프라이머는 종 특이적 염기서열로부터 디자인된 프라이머로서, 실제 로타바이러스에 감염 되었는지 여부를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 이론적으로 합성된 로타바이러스 유전자도 검출 가능하며, 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비 특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 검출력이 우수하다. 또한, 본 발명의 등온증폭 반응용 프라이머를 이용한 반응은, 반응의 조건을 모든 바이러스 및 프라이머 조합에서 동일하게 하여 검출의 효율을 높일 수 있도록 설계되었다.
실시예 1
1. 바이러스 핵산 수집
등온증폭법의 특이성을 확인하기 위하여, 로타바이러스의 RNA 핵산 [AMPLIRUNㄾ ROTAVIRUS RNA CONTROL MBC026 (Vircell, Spain)] 및 참고 바이러스 9종 [Sapovirus (SV), Hepatitis A virus (HAV), Aichivirus-A (AiV), Adenovirus-41 (AdV-41), Parvovirus-B19 (ParV), Coxsackievirus (CoxV), Enterovirus (EV), Norovirus (NoV) 및 Echovirus (EV)]의 유전자를 수집하였다.
2. 등온증폭 반응용 특이적 프라이머 제작
로타바이러스(RV)를 등온증폭법을 통하여 진단하기 위해, 프라이머 설계는 Primerexplorer V3 프로그램을 이용하여 설계 하였다. 등온증폭법을 수행하기 위해서는 4종류의 프라이머 (F3, B3, FIP, BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하며, 위와 같이 수집된 대상 바이러스 및 참고 바이러스 유전자의 염기서열을 비교하여 로타바이러스 특이적인 프라이머(세트1)를 제작하였다.
하기 표 1은 본 발명의 실시예에 따라 설계 제작된 등온증폭반응용 프라이머(LAMP 프라이머) 세트1의 염기서열을 나타낸 것이다.
비교예 1 내지 3
실시예1과 동일한 방법을 사용하여 로타바이러스 특이적인 프라이머(세트2 내지 세트4)를 제작하였다.
하기 표 2는 본 발명의 비교예1 내지 3에 따라 각각 설계 제작된 등온증폭반응용 프라이머(LAMP 프라이머) 세트2 내지 4의 염기서열을 나타낸 것이다.
실시예 2.
실시예 1에서 제작된 프라이머 세트(세트1)가 로타바이러스를 검출하는데 사용가능한지 확인하기 위하여, 등온증폭 반응용 프라이머 조성물(세트1)을 다음과 같이 제조하였다.
먼저, 로타바이러스의 RNA 1uL (10,000 copies)를 주형으로, 반응버퍼(Takara, 일본) 4uL, dNTPmixture (10 mM each) 2uL, RNase inhibitor (10 U/uL) 1uL, Oligo (dt) 20 primer (10 pmole/uL) 1uL, ReverseTra Aceㄾ 1uL 및 탈이온 증류수 10 uL로, 총 부피를 20uL로 상보적 DNA(cDNA)를 합성하였다.
그 후, 10배 (10X) 등온증폭 반응버퍼 (20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% 및 Triton X-100) 2 uL, 10 mM dNTPs (각각 10 mM이 포함되어 있는 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 혼합물) 0.5 uL, 10 pmole 농도의 F3 및 B3 프라이머 0.5 uL, 10 pmole 농도의 FIP 및 BIP 프라이머 2 uL, 주형 cDNA 1 uL (100 copies/uL) 및 멸균증류수 10.5 uL를 반응 튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 등온증폭 반응 조성물을 95℃에서 10 분 및 4℃에서 1 분간 반응 시킨 후, Bst. polymerase (8 unit/uL) 1uL를 반응튜브에 첨가하여 최종적으로 등온증폭 반응용 프라이머조성물(세트1) 20 uL를 제조하였다.
비교예 4 내지 6
실시예 1에서 제작된 프라이머 세트(세트1)가 아니라 각각 비교예 1 내지 3에서 제작된 프라이머 세트(세트2 내지 세트4)를 사용한 것을 제외하면 실시예2와 동일한 방법으로 비교예 등온증폭 반응용 프라이머조성물1(세트2), 비교예 등온증폭 반응용 프라이머조성물2(세트3) 및 비교예 등온증폭 반응용 프라이머조성물3(세트4)를 각각 20 uL씩 제조하였다.
실험예 1
실시예 2 및 비교예 4 내지 6에서 제조된 등온증폭 반응용 프라이머조성물(세트1), 비교예등온증폭 반응용 프라이머조성물1 내지 3(세트2 내지 세트4)을 이용하여 로타바이러스의 주형 핵산을 대상으로 등온증폭 반응을 수행하였는데, 등온증폭반응은 60 및 63℃에서 1시간 동안 수행하였다. 반응이 완료된 증폭산물 20 uL 중 4 uL를 1.2% agarose gel 에 전기영동 하여 유전자가 증폭 되었는지를 자외선 상에서 발색반응으로 확인하고 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1로부터, 실시예1의 프라이머 세트1이 포함된 등온증폭 반응용 프라이머조성물(세트1)는 negative control을 제외한 60 및 63℃의 반응온도에서 증폭하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 비교예등온증폭 반응용 프라이머조성물1 내지 3(세트2 내지 세트4)의 경우 negative control에서 등온증폭반응이 확인되었다. 여기서 "60, 63"는 등온증폭반응 온도를 나타낸 것이고, "N"은 negative control로서 로타바이러스 주형핵산을 포함하지 않은 시료이다.
실험예 2
실험예1에서 등온증폭반응이 확인된 실시예1에서 제조된 프라이머 세트1을 대상으로 프라이머세트1이 로타바이러스에 대해 특이적으로 등온 증폭되는지 확인하기 위해, 실시예 2에서 제조된 등온증폭 반응용 프라이머조성물(세트1)를 이용하여 실시예 1에서 수집한 참고바이러스 9종을 포함하여 등온증폭 반응을 수행하였는데, 반응온도는 60℃로 실시하였다. 반응이 완료된 증폭산물 20 uL 중 4 uL를 각각 1.2% agarose gel에 전기영동 하여 유전자가 증폭 되었는지 확인하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 로타바이러스의 주형 핵산 및 참고 바이러스 9종의 핵산을 주형으로 사용하여 등온증폭반응을 통해 프라이머 세트 1의 로타바이러스의 특이적 반응을 확인한 것이다. 여기서 "RV, HAV, SV, AiV, AdV-41, ParV, CoxV, EV, NoV 및 EchoV"는 실시예 1에 표기된 대상 바이러스 및 참고 바이러스 9종의 약어를 나타낸 것이고, "N"은 negative control로서 로타바이러스의 주형 핵산을 포함하지 않은 시료이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 프라이머 세트 1은 대상 바이러스인 로타바이러스에서만 등온증폭반응이 확인되어, 로타바이러스를 특이적으로 증폭 할 수 있는 것이 확인되었다.
따라서, 실시예1에서 제작된 프라이머 세트1이 로타바이러스 주형핵산을 등온 증폭시키기에 적합한 프라이머 세트임을 알 수 있다.
실험예 3
실시예1에서 제조된 프라이머 세트1의 로타바이러스에 대한 검출민감도를 확인하기 위해, 로타바이러스의 주형핵산(cDNA)을 단계희석법으로 희석 후 등온증폭 반응을 수행하였다. 등온증폭반응용 프라이머 조성물은 실시예 2에서 제조된 등온증폭 반응용 프라이머조성물(세트1)을 사용하였으며, 반응온도는 60℃로 실시하였다. 반응이 완료된 증폭산물 20 uL 중 4 uL를 1.2% agarose gel 에 전기영동하여 유전자가 증폭 되었는지 확인하고 그 결과를 도 3에 도시하였다.
도면 3은 본 발명의 등온증폭 반응용 프라이머조성물(세트1)이 로타바이러스을 검출할 수 있는 검출민감도를 확인한 결과이다. 여기서 "100 부터 10-6"은 주형 핵산인 cDNA의 희석 배율을 나타낸 것이며, "N"은 negative control로서 주형 핵산을 포함하지 않은 시료이다. 도 3으로부터, 제작된 프라이머 세트 1은 10-2 (10 pg/uL) 희석 배율 까지 로타바이러스을 진단 할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4
실시예1에서 제조된 프라이머 세트1의 등온증폭반응의 위양성 여부를 확인하기 위하여, 세트 1의 F3 (염기서열 1), B3 (염기서열 4) 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 다음과 같이 진행 하였다. PCR 조성물은 10배 (10X) PCR 반응 버퍼 (20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1% Triton X-100 및 50% glycerol) 2.5 uL, 10 mM dNTPs (각각 10 mM이 포함되어 있는 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 혼합물) 2 uL, 10 pmole 농도의 F3 및 B3 프라이머 1 uL, 주형 cDNA (100 copies/uL) 1 uL, HS Taq polymerase (2.5 units) 0.1 uL 및 멸균증류수 17.4 uL를 반응 튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 PCR 조성물을 94℃에서 5 분 간 반응 후 94℃ 30 초, 62℃ 30 초, 72℃ 45초로 35회 반복하였다. 최종적으로 72℃에서 3분간 반응 하여 PCR 반응을 마무리 하였다. 세트 1 (염기서열 1 내지 4)의 증폭 염기서열 범위 내 처리 가능한 Mwo I 제한효소 (5'-GCNNNNN/NNGC-3')로 제한효소 처리를 진행하였다. 제한효소 처리는 증폭산물 2 uL, 제한효소 반응 버퍼 (50 mM Potassium Acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM Magnesium Acetate 및 100 ug/ml BSA) 1 uL, 제한효소 4 uL 및 멸균증류수 3 uL로 총 10 uL의 제한효소 처리 조성물을 제조 후 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응이 완료된 산물 10 uL 전부를 1.2% agarose gel에 전기영동 하여 등온증폭반응의 위양성 여부를 확인하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도면 4는 실시예1에서 제조된 프라이머 세트1의 등온증폭반응의 위양성 여부를 확인한 결과이다. 여기서 "Mwo I"은 프라이머 세트 1의 F3, B3 프라이머를 이용한 PCR 증폭 산물을 Mwo I으로 제한효소 처리한 결과를 나타낸 것이다. 증폭산물을 Mwo I으로 제한효소 처리 할 경우 32 + 174 bp의 절단된 증폭산물이 확인되며, 설계된 프라이머 세트가 실제 로타바이러스의 VP6 유전자를 증폭한다는 것이 확인되었다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
<110> DANKOOK UNIVERSITY
<120> Primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction
for detecting Rotavirus, and use thereof
<130> DPP-2018-0188-KR
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F3 primer
<400> 1
aatgcgtcca ccaaacatga c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B3 primer
<400> 2
gtggaaatac tggtccaact 20
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIP primer
<400> 3
ctgcagactc aatacgtaac gtcattattt ccgcaagcac aac 43
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIP primer
<400> 4
gtgaatcagt gcttgcggta ctcttgacgt actgcgg 37
Claims (8)
- 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 포함하는 프라이머 세트로서,
상기 프라이머 세트는 GenBank accession number KF812690.1인 로타바이러스(Rotavirus;RV)에 특이적으로 결합하고,
상기 서열번호 1 내지 4의 염기서열은 상기 로타바이러스(Rotavirus;RV)의 VP6 유전자를 주형으로 설계 및 제작된 것을 특징으로 하는 로타바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트.
- 삭제
- 제 1 항의 프라이머 세트를 포함하는 로타바이러스(Rotavirus;RV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물.
- 제 3 항에 있어서,
등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 로타바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물.
- 제 3 항 또는 제 4 항의 조성물을 포함하는, 로타바이러스(Rotavirus;RV)를 검출하기 위한 진단용 키트.
- 삭제
- 인체를 제외한 대상시료로부터 RNA를 추출하는 단계;
상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
상기 cDNA를 주형으로, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 등온증폭법(LAMP)을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및
증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 로타바이러스(Rotavirus;RV) 진단방법.
- 제 7 항에 있어서,
상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인관측정 중 어느 하나를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 로타바이러스 진단방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020190023430A KR102202688B1 (ko) | 2019-02-27 | 2019-02-27 | 로타바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020190023430A KR102202688B1 (ko) | 2019-02-27 | 2019-02-27 | 로타바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Publications (2)
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| KR102202688B1 true KR102202688B1 (ko) | 2021-01-12 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| CN112094949A (zh) * | 2020-09-30 | 2020-12-18 | 上海予泉生物科技有限公司 | 一种人a组轮状病毒的rpa-lfd检测引物和探针、核酸试纸条检测试剂盒及应用 |
Family Cites Families (1)
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| KR102019950B1 (ko) | 2015-02-27 | 2019-09-09 | 중앙대학교 산학협력단 | 로타바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스 판별용 키트 |
-
2019
- 2019-02-27 KR KR1020190023430A patent/KR102202688B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Hyeon 등, The Korean Journal of Microbiology, Vol. 47, No. 3, 페이지 117-123 (2011.06.)* |
| Malik 등, Indian J. Virol., Vol. 24, No. 2, 페이지 265-271 (2013.07.26.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| KR20200104718A (ko) | 2020-09-04 |
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