KR102019950B1 - 로타바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스 판별용 키트 - Google Patents

로타바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스 판별용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 백신형 로타바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스 판별용 키트에 관한 것으로 더욱 자세하게는 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트와 이를 포함하는 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스의 판별용 키트 그리고 이를 이용하여 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스를 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 프라이머는 임상 시료에서 백신형 로타바이러스를 특이적이고, 민감하며, 빠르고 쉽게 검출 할 수 있다. 그로 인해 로타바이러스 감염에 대한 빠르고 정확한 진단 내릴 수 있으며, 로타바이러스 감염 환자의 약물의 오남용을 막을 수 있어 효과적이다.

Description

로타바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스 판별용 키트{Novel primer set for detecting rotavirus and kit to distinguish wild rotavirus and vaccine rotavirus using the same}
본 발명은 백신형 로타바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스 판별용 키트에 관한 것으로 더욱 자세하게는 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트와 이를 포함하는 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스의 판별용 키트 그리고 이를 이용하여 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스를 판별하는 방법에 관한 것이다.
장내 감염으로 인한 어린이 위장염은 선진국과 개발 도상국 모두에서 흔하게 나타난다. 1973년 이후에 발견된 로타바이러스는 전세계적으로 5세 미만의 어린이에게서 심각한 위장염을 일으키는 주요 요인으로 꼽힌다. 로타바이러스의 감염으로 인해 매년 45 만명이 사망에 이르며, 사망자는 대부분 아프리카와 아시아의 개발도상국에 분포한다.
이에, 최근 두 가지 로타바이러스 백신이 유럽과 미국에서 각각 허가받았으며, 이외의 다른 여러 국가에서도 상업적으로 사용되고 있다. 첫째로 RotarixTM는 인간 89-12(G1P[8]) 로타바이러스 균주를 약독화시킨 1가 백신이며, 둘째로 RotaTeq®은 소의 G6P7[5]의 로타바이러스에 인간 G1, G2, G3, G4 및 P[8] 유전형을 포함하는 인간-소 재조합의 5가 백신이다.
한편, 점차 백신을 접종하는 유아가 증가함에 따라 백신형 로타바이러스의 배출(shedding) 사례가 늘고 있다. 백신을 접종한 유아의 분변으로부터 백신형 로타바이러스가 검출되었으며, 분변을 통해 형제자매간에 로타바이러스 감염이 유발되는 사례가 보고되고 있다. 또한 로타바이러스 백신을 접종한 유아의 분변에서 재조합 변이주가 발견되기도 하였다. 즉, 이러한 백신형 로타바이러스의 배출은 로타바이러스의 순환을 야기하며, 백신형 로타바이러스의 재조합 변이주를 유발한다. 따라서, 백신형 로타바이러스의 배출을 판별하여 로타바이러스의 순환을 추적평가하는 연구가 요구되고 있는 실정이다.
또한, 현재까지는 위장염에 걸린 어린이 환자로부터 위장염의 원인이 백신형 로타바이러스에 의한 것인지에 대한 정밀한 검사를 실시하지 않았으나, 보다 정확한 진단과 처방을 위하여 로타바이러스의 균주 유형을 판별하는 것이 중요해지고 있다. 덧붙여, 최근 활발히 백신이 개발되면서, 임상적으로 백신형 로타바이러스 와 야생형 로타바이러스를 판별하는 실험이 활발히 이루어지고 있어, 쉽고 빠르게 판별해야 할 필요성이 대두되고 있다.
기존의 로타바이러스성 위장염의 진단 방법은 대변 시료에서 로타바이러스 그룹 VP6 단백질을 효소면역분석법을 기반으로 검출하는데, 이 방법을 통해 로타바이러스가 백신형 균주인지 야생형 균주인지는 구별하기는 어려웠다. 또한, 백신형 로타바이러스에 감염되었는지 구분하기 위한 방법으로 DNA 염기서열 분석법, 제한효소 분석법 등이 있지만, 이러한 방법은 많은 시간과 비용이 소요된다. 따라서, 간편하고 신속하며, 저렴한 비용으로 백신형 로타바이러스와 야생형 로타바이러스를 판별하는 방법의 개발이 요구되어 왔다.
이에 본 발명자들은 효소면역분석법을 이용하여 로타바이러스 순환 유전자형의 병인을 식별하기 위해 두 백신으로부터 유래한 균주를 분석하였고, 마침내 백신형 로타바이러스를 야생형 로타바이러스로부터 신속하고 정확하게 구분할 수 있는 프라이머 및 이를 이용한 판별 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 백신형 로타바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 백신형 로타바이러스 검출용 프라이머 세트와 야생형 로타바이러스 검출용 프라이머를 포함하는 야생형 로타바이러스 및 백신형 로타바이러스의 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 백신형 로타바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스를 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 백신형 로타바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트와 야생형 로타바이러스 검출용 프라이머를 포함하는 야생형 로타바이러스 및 백신형 로타바이러스 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 시료의 RNA를 분리하는 단계; 및 (b) (a)단계에서 준비한 RNA를 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하는 단계를 포함하는 백신형 로타바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 시료의 RNA를 분리하는 단계; (b) (a)단계에서 준비한 RNA를 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트와 야생형 로타바이러스 검출용 프라이머로 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스를 판별하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
달리 규정되지 않는 한, 본 발명에 사용된 기술적 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "배출(shedding)"은 바이러스가 세포 외부로 배출되는 것을 의미한다. 바이러스는 숙주세포가 자손을 복제할 환경이 아니라고 판단하면, 여러 가지 방법으로 숙주세포를 떠나는데, 이를 바이러스의 배출(viral shedding)이라고 한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "판별"은 판단하여 구별하는 것을 의미하며, 특히 본 발명에서는 백신형 로타바이러스와 야생형 로타바이러스를 판단하고 이를 구별하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "RotaTeq®"은 소의 G6P7[5]의 로타바이러스에 인간 G1, G2, G3, G4 및 P[8] 유전형을 포함하는 인간-소 재조합의 5가 백신을 의미한다.
본 발명에서 용어 "프라이머"란 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 백신형 로타바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 백신형 로타바이러스는 RotaTeq® 백신 로타바이러스인 것을 특징으로 한다. 상기 RotaTeq® 백신 로타바이러스로는 WI79-9 (GenBank Accession No. GU_565060), SC2-9 (GenBank Accession No. GU_565071), WI78-8 (GenBank Accession No. GU_565082), BrB-9 (GenBank Accession No. GU_565093) 및 WI79-4 (GenBank Accession No. GU_565049)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 RotaTeq® 백신은 5가 사람-소 로타바이러스 재배열 백신으로 사람에게서 분리된 로타바이러스 RNA 분절 중 1개와 소에서 분리한 로타바이러스(Wista calf3: WC3, G6P7[5]) RNA 분절 중 10개를 재배열하여 만든 백신이다. 4개의 재배열 바이러스 주의 G 혈청형은 사람에게서 유래하여 G1, G2, G3와 G4를, 나머지 1개는 P 혈청형을 결정하는 사람에게서 유래한 RNA 분절로 P1A[8]을 발현하게 하여 G1P[5], G2P[5], G3P[5], G4P[5]와 G6P[8]이 들어있는 5가 백신이다.
본 발명의 상기 프라이머 세트는 소의 NSP3 유전자를 기반으로 디자인한 것임을 특징으로 한다. NSP3 유전자는 로타바이러스 RNA의 3' 말단에 위치하며, 11 RNA 조각을 복제하고 조합하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 잘 보존된 염기서열이다. 본 발명에서는 소의 NSP3 유전자를 기반으로 본 발명의 프라이머를 개발하였다.
본 발명의 상기 프라이머 세트는 백신형 로타바이러스에 민감하고, 특이적이어서, 백신형 로타바이러스를 정확도 높게 검출할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 백신형 로타바이러스에 특이적으로 PCR 산물이 합성되도록 하기 위하여 개발되었다. 본 발명에서 백신형 로타바이러스에 특이적이라는 의미는 해당 프라이머가 백신형 로타바이러스의 유전체 서열로부터 특이적인 PCR 산물을 합성할 수 있음을 의미하며, 백신형 로타바이러스에 대해서 공통적으로 작용해야 하고, 다른 유사 종 또는 야생형 로타바이러스의 핵산과의 반응은 일어나지 않아야 한다.
본 발명의 일실시예에서는 소의 NSP3 유전자를 기반으로 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트와, 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트를 디자인 하였으나, 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트보다 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트가 백신형 로타바이러스를 더욱 특이적으로 검출할 수 있다(도 2 참조).
본 발명의 일실시예에서는 백신형 로타바이러스를 농도별로 하여 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 2-6 ng/㎕의 RNA 농도에서 민감하게 백신형 로타바이러스를 검출할 수 있다는 것을 확인하였다(도 3 참조).
상기 프라이머는 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism) 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 분석에 적합하도록 디자인될 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트와 야생형 로타바이러스 검출용 프라이머를 포함하는 야생형 로타바이러스 및 백신형 로타바이러스 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 야생형 로타바이러스 검출용 프라이머는 서열번호 5 내지 26으로 이루어진 프라이머 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
야생형 로타바이러스 검출용 프라이머는 서열번호 5 및 6으로 이루어진 Beg9 및 End9 프라이머 세트, 서열번호 6 및 7로 이루어진 End9 및 aBT1 프라이머 세트, 서열번호 6 및 8로 이루어진 End9 및 aCT2 프라이머 세트, 서열번호 6 및 9로 이루어진 End9 및 aET3 프라이머 세트, 서열번호 6 및 10으로 이루어진 End9 및 aDT4 프라이머 세트, 서열번호 6 및 11로 이루어진 End9 및 aAT8 프라이머 세트, 서열번호 6 및 12로 이루어진 End9 및 aFT9 프라이머 세트, 서열번호 6 및 13으로 이루어진 End9 및 G12 프라이머 세트, 서열번호 14 및 15로 이루어진 G10-F 및 G10-R 프라이머 세트, 서열번호 5 및 16으로 이루어진 End9 및 DT6 프라이머 세트, 서열번호 17 및 18로 이루어진 Con3 및 Con2 프라이머 세트, 서열번호 17 및 19로 이루어진 Con3 및 1T-1 프라이머 세트, 서열번호 17 및 20으로 이루어진 Con3 및 2T-1 프라이머 세트, 서열번호 17 및 21로 이루어진 Con3 및 3T-1 프라이머 세트, 서열번호 17 및 22로 이루어진 Con3 및 4T-1 프라이머 세트, 서열번호 17 및 23으로 이루어진 Con3 및 5T-1 프라이머 세트, 서열번호 24 및 25로 이루어진 C1 및 C4 프라이머 세트, 서열번호 24 및 26으로 이루어진 C1 및 C3 프라이머 세트 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
로타바이러스 검출시 VP7, VP4 단백질을 기반으로 프라이머가 제작된다. VP7 단백질의 경우 로타바이러스의 G 유전자형을 결정하며, VP4 단백질의 경우 로타바이러스의 P 유전자형을 결정한다. 따라서, VP7 단백질을 기반으로하여 로타바이러스 검출시, 1st PCR에서 Beg9 및 End9 프라이머를 사용한 후, 유전자형 분석을 위하여 2nd semi-nested PCR을 실시한다. 이 때 사용되는 프라이머는 End9 프라이머와 G 타입 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10 또는 12에 각각 특이적인 aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9, G10 또는 G12 프라이머 세트 및 Beg9 프라이머와 G 타입 6 에 특이적인 DT6 프라이머 세트를 사용한다.
한편, VP4단백질을 기반으로하여 로타바이러스 검출할 때에는 1st PCR에서 Con3 및 Con2 프라이머 세트를 사용한 후, 유전자형 분석을 위하여 2nd semi-nested PCR을 실시한다. 이 때 사용되는 프라이머는 on3와 P[8], P[4], P[6], P[9], P[10]에 각각 특수한 프라이머 1T-1, 2T-1, 3T-1, 4T-1, 5T-1가 사용된다.
본 발명의 일실시예에서는 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 세트와 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 세트로 실험하였다. 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 세트는 Beg9와 End9로 표시되는 프라이머 세트로 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스를 구분하지 않고 비특이적으로 PCR 산물을 생산하며, 생산되는 PCR 산물의 크기는 1063bp이다. 상기 Beg9와 End9로 표시되는 프라이머 세트를 추가적으로 포함하여, 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스의 교차 감염여부를 판별할 수 있다.
본 발명의 백신형 로타바이러스는 RotaTeq® 백신 로타바이러스인 것을 특징으로 한다. 상기 RotaTeq® 백신 로타바이러스로는 WI79-9 (GenBank Accession No. GU_565060), SC2-9 (GenBank Accession No. GU_565071), WI78-8 (GenBank Accession No. GU_565082), BrB-9 (GenBank Accession No. GU_565093) 및 WI79-4 (GenBank Accession No. GU_565049)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 RotaTeq® 백신은 5가 사람-소 로타바이러스 재배열 백신으로 사람에게서 분리된 로타바이러스 RNA 분절 중 1개와 소에서 분리한 로타바이러스(Wista calf3: WC3, G6P7[5]) RNA 분절 중 10개를 재배열하여 만든 백신이다. 4개의 재배열 바이러스 주의 G 혈청형은 사람에게서 유래하여 G1, G2, G3와 G4를, 나머지 1개는 P 혈청형을 결정하는 사람에게서 유래한 RNA 분절로 P1A[8]을 발현하게 하여 G1P[5], G2P[5], G3P[5], G4P[5]와 G6P[8]이 들어있는 5가 백신이다.
본 발명의 상기 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 소의 NSP3 유전자를 기반으로 디자인한 것임을 특징으로 한다. NSP3 유전자는 로타바이러스 RNA의 3말단에 위치하며, 11 RNA 조각을 복제하고 조합하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 잘 보존된 염기서열이다. 본 발명에서는 소의 NSP3 유전자를 기반으로 본 발명의 프라이머를 개발하였다.
본 발명의 상기 키트는 PCR용 키트로서, 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 세트 및 역전사 반응과 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함한다. 상기 키트에서 증폭반응을 수행하기 위한 시약은 역전사효소, DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명은 (a) 시료의 RNA를 분리하는 단계; 및 (b) (a)단계에서 준비한 RNA를 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하는 단계를 포함하는 백신형 로타바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 시료는 백신형 로타바이러스 감염을 판별하고자 하는 개체의 생체시료인 것을 특징으로 한다. 개체의 생체시료로는 점액, 타액, 인후 세척액, 코 세척액, 척수액, 가래, 뇨, 정액, 땀, 분변, 혈장, 혈액, 기관지폐포액(broncheoalveolar fluid), 질액, 눈물 및 조직 시료일 수 있으며, 바람직하게는 분변일 수 있다.
상기 시료로부터 RNA를 추출하는 것은 다양한 방법에 의해 RNA를 추출할 수 있다. 이는 추출한 RNA를 분석하여 백신형 로타바이러스를 검출하기 위한 것이기 때문에 상기 시료에서 어떠한 방법으로 추출하는지는 특별히 제한하지 않으며 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명은 (a) 시료의 RNA를 분리하는 단계; (b) (a)단계에서 준비한 RNA를 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트와 야생형 로타바이러스 검출용 프라이머로 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 시료는 로타바이러스 감염을 판별하고자 하는 개체의 생체시료인 것을 특징으로 한다. 개체의 생체시료로는 점액, 타액, 인후 세척액, 코 세척액, 척수액, 가래, 뇨, 정액, 땀, 분변, 혈장, 혈액, 기관지폐포액(broncheoalveolar fluid), 질액, 눈물 및 조직 시료일 수 있으며, 바람직하게는 분변일 수 있다.
상기 시료로부터 RNA를 추출하는 것은 다양한 방법에 의해 RNA를 추출할 수 있고, 이는 추출한 RNA를 분석하여 백신형 로타바이러스와 야생형 로타바이러스를 판별하기 위한 것이기 때문에 상기 시료에서 어떠한 방법으로 추출하는지는 특별히 제한하지 않으며 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있다.
상기 (b)단계에서의 야생형 로타바이러스 검출용 프라이머로는 서열번호 5 내지 26으로 이루어진 프라이머 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
야생형 로타바이러스 검출용 프라이머는 서열번호 5 및 6으로 이루어진 Beg9 및 End9 프라이머 세트, 서열번호 6 및 7로 이루어진 End9 및 aBT1 프라이머 세트, 서열번호 6 및 8로 이루어진 End9 및 aCT2 프라이머 세트, 서열번호 6 및 9로 이루어진 End9 및 aET3 프라이머 세트, 서열번호 6 및 10으로 이루어진 End9 및 aDT4 프라이머 세트, 서열번호 6 및 11로 이루어진 End9 및 aAT8 프라이머 세트, 서열번호 6 및 12로 이루어진 End9 및 aFT9 프라이머 세트, 서열번호 6 및 13으로 이루어진 End9 및 G12 프라이머 세트, 서열번호 14 및 15로 이루어진 G10-F 및 G10-R 프라이머 세트, 서열번호 5 및 16으로 이루어진 End9 및 DT6 프라이머 세트, 서열번호 17 및 18로 이루어진 Con3 및 Con2 프라이머 세트, 서열번호 17 및 19로 이루어진 Con3 및 1T-1 프라이머 세트, 서열번호 17 및 20으로 이루어진 Con3 및 2T-1 프라이머 세트, 서열번호 17 및 21로 이루어진 Con3 및 3T-1 프라이머 세트, 서열번호 17 및 22로 이루어진 Con3 및 4T-1 프라이머 세트, 서열번호 17 및 23으로 이루어진 Con3 및 5T-1 프라이머 세트, 서열번호 24 및 25로 이루어진 C1 및 C4 프라이머 세트, 서열번호 24 및 26으로 이루어진 C1 및 C3 프라이머 세트 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
로타바이러스 검출시 VP7, VP4 단백질을 기반으로 프라이머가 제작된다. VP7 단백질의 경우 로타바이러스의 G 유전자형을 결정하며, VP4 단백질의 경우 로타바이러스의 P 유전자형을 결정한다. 따라서, VP7 단백질을 기반으로하여 로타바이러스 검출시, 1st PCR에서 Beg9 및 End9 프라이머를 사용한 후, 유전자형 분석을 위하여 2nd semi-nested PCR을 실시한다. 이 때 사용되는 프라이머는 End9 프라이머와 G 타입 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10 또는 12에 각각 특이적인 aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9, G10 또는 G12 프라이머 세트 및 Beg9 프라이머와 G 타입 6에 특이적인 DT6 프라이머 세트를 사용한다.
한편, VP4단백질을 기반으로하여 로타바이러스 검출할 때에는 1st PCR에서 Con3 및 Con2 프라이머 세트를 사용한 후, 유전자형 분석을 위하여 2nd semi-nested PCR을 실시한다. 이때 사용되는 프라이머는 Con3와 P[8], P[4], P[6], P[9], P[10]에 각각 특수한 프라이머 1T-1, 2T-1, 3T-1, 4T-1, 5T-1가 사용된다.
상기 (b) 단계에서의 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)은 당업계에 알려진 여러 가지 PCR 방법을 통해 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스를 판별할 수 있으나, 바람직하게는 여러 프라이머 세트를 동시에 사용하여 다수의 표적 RNA를 하나의 반응액 안에서 증폭하는 방법인 다중 역전사 중합효소연쇄반응법(Multiplex reverse transcript RT-PCR)을 사용한다.
본 발명의 일실시예에는 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 세트와 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 세트를 동시에 사용하여 다수의 표적 유전자를 하나의 반응액 안에 증폭하는 방법인 다중 역전사 중합효소연쇄반응법을 사용하였다. 다중 역전사 중합효소연쇄반응 결과에서 555bp 밴드의 유무를 확인함으로써 백신형 로타바이러스와 야생형 로타바이러스를 판별할 수 있다.
상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물을 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 역전사 반응, PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에서 백신형 로타바이러스와 야생형 로타바이러스를 판별하는 방법으로는 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였을 경우, 555bp의 밴드가 나타나면 백신형 로타바이러스가 검출되었다고 판단하며, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였을 경우, 1062bp의 밴드가 나타나면 백신형 또는 야생형 로타바이러스가 검출되었다고 판단할 수 있다. 즉, 555bp의 밴드가 나타나지 않지만, 1062bp에는 밴드가 나타날 경우, 야생형 로타바이러스에 감염된 것으로 판단할 수 있으며, 555bp와 1062bp의 밴드가 모두 나타날 경우, 백신형 로타바이러스에만 감염되었거나, 백신형 로타바이러스와 야생형 로타바이러스 모두에 감염되었다고 판단할 수 있다.
본 발명의 프라이머를 이용하여 백신형 로타바이러스와 야생형 로타바이러스를 판별할 수 있는 방법으로는, PCR(Polymerase Chain Reaction) 분석, DNA 시퀀싱(DNA sequencing), 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, PCR-RFLP(restriction fragment length polymerphism) 분석, RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism), 노던 하이브리다이제이션(Northern hybridization) 서던 하이브리다이제이션(Southern hybridization) 및 웨스턴 하이브리다이제이션(Western hybridization) 등과 같은 당업계에 공지된 다양한 DNA 다형성 분석을 이용하여 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 프라이머 세트는 당업계에 알려진 PCR 방법을 통해 백신형 로타바이러스와 야생형 로타바이러스를 판별할 수 있으나, 바람직하게는 여러 프라이머 세트를 동시에 사용하여 다수의 표적 RNA를 하나의 반응액 안에서 증폭하는 방법인 다중 역전사 중합효소연쇄반응을 사용한다. 이 때, 프라이머의 상호작용을 계산하여 프라이머가 다이머를 형성하지 않는 프라이머 조합을 만들어야 하며, 여러 PCR 산물의 크기가 전기영동 상에서 충분히 구별될 수 있도록 설계해야 한다.
본 발명의 프라이머 세트는 추가적인 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)의 성공 유무를 확인하기 위한 표시자(marker)로서의 프라이머가 포함될 수 있다. 증폭산물의 밴드가 나타나면 중합효소반응이 성공적으로 수행되었음을 의미하며 표시자가 나온 상태에서 다른 PCR 산물이 검출되지 않은 경우에는 음성으로 판정하는 것이 바람직하다.
본 발명의 백신형 로타바이러스 검출용 프라이머는 로타바이러스 감염 환자가 야생형 로타바이러스에 감염되었는지, 백신형 로타바이러스에 감염되었는지 쉽고, 정확하며, 빠르고, 민감하게 판별한다. 즉, 환자의 로타바이러스 유형까지 정확하게 진단할 수 있어 그에 적절한 처방을 내릴 수 있다. 따라서, 잘못된 진단에 따른 환자의 약물의 오남용을 방지할 수 있다는 점에서 효과적이며, 산업상 이용가능성이 높다.
따라서, 본 발명은 백신형 로타바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 야생형로타바이러스와 백신형 로타바이러스 판별용 키트에 관한 것으로 더욱 자세하게는 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트와 이를 포함하는 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스의 판별용 키트 그리고 이를 이용하여 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스를 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 프라이머는 임상 시료에서 백신형 로타바이러스를 특이적이고, 민감하며, 빠르고 쉽게 검출 할 수 있다. 그로인해 로타바이러스 감염에 대한 빠르고 정확한 진단 내릴 수 있으며, 로타바이러스 감염 환자의 약물의 오남용을 막을 수 있어 효과적이다.
도 1은 순환 인간 로타바이러스 균주와 RotaTeq® WI79-9(GU565057) 백신 균주의 소 NSP3 로타바이러스의 프라이머 결합 위치를 개략적으로 다중 정렬한 것이다.
도 2는 서열번호 1 및 2로 이루어지는 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 세트(도면 A)와 서열번호 3 및 4로 이루어지는 NSP3F-B2/NSP3R-B2 프라이머 세트(도면 B)의 특이성을 실험한 결과이다(1; 백신 stock으로부터 세포배양에 적합하게 변형된(cell-culture adapted) 백신 바이러스, 2; 세포배양에 적합하게 변형된 백신 바이러스 셰딩, 3; 세포배양에 적합하게 변형되지 않은(non cell-culture adapted) 백신 바이러스 셰딩, 4-10; 세포배양에 적합하게 변형된 야생형 바이러스 G1, G2, G3, G4, G9, G11 및 G12, M; 1kb DNA ladder).
도 3은 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 세트의 민감도를 측정한 실험이다.
도 4A는 여러 가지 시료에 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행한 후 전기영동을 실시한 사진이다(1; 백신 stock으로부터 세포배양에 적합하게 변형된(cell-culture adapted) 백신 바이러스, 2; 세포배양에 적합하게 변형된 백신 바이러스 셰딩, 3-5; 세포배양에 적합하게 변형되지 않은(non cell-culture adapted) 백신 바이러스 셰딩, 6-12; 세포배양에 적합하게 변형된 야생형 바이러스 G1, G2, G3, G4, G9, G11 및 G12, 13-17; 세포배양에 적합하게 변형되지 않은 야생형 바이러스 G1, G2, G3, G4 및 G9, M; 1kb DNA ladder).
도 4B는 여러 가지 시료에 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머와 Beg9/End9 프라이머 혼합물을 이용하여 RT-PCR을 수행한 후 전기영동을 실시한 사진이다(1; 백신 stock으로부터 세포배양에 적합하게 변형된(cell-culture adapted) 백신 바이러스, 2; 세포배양에 적합하게 변형된 백신 바이러스 셰딩, 3; 세포배양에 적합하게 변형되지 않은(non cell-culture adapted) 백신 바이러스 셰딩, 4-7; 백산바이러스와 야생형 균주 G1(4번 레인), G2(5번 레인), G3(6번 레인) 또는 G4(7번 레인)가 공동감염된 것, 8-11; 야생형 균주 G1(8번 레인), G2(9번 레인), G3(10번 레인) 또는 G4(11번 레인), M; 1kb DNA ladder).
도 5는 2011년과 2013년에 검출된 RotaTeq®및 RotarixTM 백신 균주(G1, G6, P[8])로부터 유래한 로타바이러스의 VP4- 및 VP7-캡시드 코딩 유전자 염기서열을 기반으로 작성한 계통수이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험 방법>
1. 로타바이러스 샘플
알려진 RotaTeq® 백신 바이러스는 다음 두 가지 방법으로 얻었다. 1) 상업적으로 판매되는 RotaTeq® 백신 보관용 균주(중앙 대학교 병원, 서울, 한국); 그리고 2) 임상샘플과 미공개된 2012-2014년 데이터로부터 세포배양에 적합하게 변형된(cell-culture adapted) 백신 바이러스 셰딩(shedding, 분비물)(n = 8)과 세포배양에 적합하게 변형되지 않은(non cell-culture adapted) 백신 바이러스 셰딩(n = 31). 알려진 야생형 바이러스는 2010년부터 2014년까지 동정된 균주(G1, n=10; G2, n=10; G3, n=4, G4, n=3, G9, n=3; G11, n=1; G12, n=2)와 동정되지 않은 균주(G1, n=10; G2, n=10; G3, n=10, G4, n=10, G9, n=10)를 포함한 우리 실험실에서 확인된 다른 로타바이러스 유전자형에서 얻었다.
MA104 세포는 한국 세포주 은행에서 얻었고 5 % CO2의 존재 하에 37 ℃에서 5 %의 소태아혈청(FBS; Gibco BRL)과 0.1 %의 젠타마이신(Gentamicine Reagent Solution, Gibco BRL)을 포함한 최소필수배지알파(MEM-alpha; Gibco BRL)에서 배양하였다. 선택된 로타바이러스 양성 샘플들은 인산완충식염수(PBS; pH 7.4)에 10배 희석시켰고 10분 동안 10,000g에서 원심분리하여 불순물을 제거하였다. PBS로 희석된 분변 상층액을 10 ㎍/㎖의 트립신 250(Becton Dickinson, Sparks, MD, USA)을 37 ℃에서 30분 동안 처리하고, 0.45 μm의 멸균 주사기 필터(Corning Costar, Corning, NY, USA)를 사용하여 여과하였다. 그 후 트립신(5 ㎍/㎖)의 존재 하에 MEM-α 배지에서 배양하였다. 배양은 회전되는 유리튜브 안에서 하였으며, 배양 중 MA104 세포에 로타바이러스를 접종하였다. 배양된 세포들은 5 - 7일 정도 감염된 이후에 채취하였고, 그 후 세포변성효과가 나타날 때까지 MA104 세포를 두었다. 그 다음, 세포 사멸 이후 배양액에 남아있는 로타바이러스를 RT-PCR로 분석하였다.
2. 바이러스 RNA 추출
바이러스의 이중가닥 RNA는 제조업체의 지시에 따라 트리졸 시약(Gibco BRL Life Technologies)을 사용하여 추출하였다. 간략하게 설명하면, 0.25ml의 바이러스 배지에 0.2ml 클로로포름을 첨가하여 분리한 파지와 트리졸 시약 0.75ml를 혼합하였다. 4℃ 에서 15분 동안 12,000g에서 원심분리한 뒤, 액상의 파지 0.5ml를 수집하였다. 수용액에 있는 RNA는 동일양의 이소프로판을 첨가하여 침전시켰다. 뒤이어 4 ℃에서 10분 동안 12,000g에서 원심분리 하였다. 그리고 나서 추출된 RNA는 75 % 에탄올 1ml로 한번 세척하였고 5 - 10분 동안 건조시켰다. 마지막으로, 추출된 RNA는 RNA 분해 효소가 없는 증류수 20ml로 재현탁시켰고, 사용할 때까지 -80 ℃에서 저장되었다.
3. 다중 역전사 중합효소연쇄반응법 (Multiplex reverse transcript RT- PCR ) 개발
3-1. 올리고뉴클레오티드 프라이머 디자인
올리고뉴클레오티드 프라이머는 다섯개의 RotaTeq® 로타바이러스 균주 [WI79-9 (GU565060), SC2-9 (GU565071), WI78-8 (GU565082), BrB-9 (GU565093), WI79-4 (GU565049)]의 NSP3 유전자의 보존된 서열 영역과 GenBank 데이터베이스에서 최근 발견되는 인간 로타바이러스 균주 G1(103주), G2(75주), G3(69주), G4(41주), G5(5주), G8(19주), G9(169주), G10(3주), G11(4주) 및 G12(60주)에 대한 NSP3 유전자 염기서열 정보를 기반으로 디자인하였다(도 1 참조). CLUSTAL-X 2.1 프로그램은 상기 로타바이러스 군주의 NSP3 유전자 서열을 비교하는데 사용하였으며, 백신형 로타바이러스 균주에 특이적인 프라이머세트로, 서열번호 1 및 2로 나타나는 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 세트와, 서열번호 3 및 4로 나타나는 NSP3F-B2/NSP3R-B2 프라이머 세트를 디자인 하였다. 프라이머에 관한 정보는 하기 [표 1]에 나타내었다. 프라이머의 이량체 형성은 PubMed NCBI 블라스트 소프트웨어를 이용하여 측정하였으며, 모든 프라이머는 상업적으로 합성된 것을 구매하였다. 10 pmol의 프라이머는 DEPC가 처리된 증류수에서 재현탁하여 사용하였으며, 보관은 -20 ℃에서 실시하였다.
서열번호 Primer Sequence
(5'-3')		 Sense Position Amplicon
(bp)		 Reference
1 NSP3F-B TGGCCGATACTAGAACTACAGA + 288-308 555 This study
2 NSP3R-B TGATTACATCAATGGAATTTAGC - 842-820
3 NSP3F-B2 CATGTTTCAGTGTGAAGAGAGC + 390-411 453 This study
4 NSP3R-B2 TGATTACATCAATGGAATTTAGC - 842-820
5 Beg9 GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG + 1-28 1062 Gouvea etal.(1990)
6 End9 GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG - 1062-1036
7 aBT1 CAAGTACTCAAATCAATGATGG + 314-335 749 Gouvea etal .(1990)
8 aCT2 CAATGATATTAACACATTTTCTGTG + 411-435 652 Gouvea etal .(1990)
9 aET3 CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG + 689-709 374 Gouvea etal .(1990)
10 aDT4 CGTTTCTGGTGAGGAGTTG + 480-498 583 Gouvea etal .(1990)
11 aAT8 GTCACACCATTTGTAAATTCG + 178-198 885 Gouvea etal .(1990)
12 aFT9 CTAGATGTAACTACAACTAC + 757-776 306 Gouvea etal .(1990)
13 G12 CCGATGGACGTAACGTTGTA + 548-567 307 Banerjee etal.
(2007)
14 G10-F ATGTATGGTATTGAATATACCAC + 51-71 882 Iturriza etal .
(2004)
15 G10-R AACTTGCCACCATTTTTTCC - 914-932
16 DT6 GATTCTACACAGGAACTAG + 499-481 500 Gouvea etal .(1994)
17 Con3 TGGCTTCGCCATTTTATAGACA + 11-32 876 Gentsch etal .
(1992)
18 Con2 ATTTCGGACCATTTATAACC - 868-887
19 1T-1 TCTACTTGGATAACGTGC - 339-356 345 Gentsch etal .
(1992)
20 2T-1 CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC - 474-494 483 Gentsch etal .
(1992)
21 3T-1 TGTTGATTAGTTGGATTCAA - 259-278 267 Gentsch etal .
(1992)
22 4T-1 TGAGACATGCAATTGGAC - 385-402 391 Gentsch etal .
(1992)
23 5T-1 ATCATAGTTAGTAGTCGG - 575-594 584 Gentsch etal .(1992)
24 C1 CTCGATGCTACTACAGAATCAG + 994-1015 356 Gouvea etal .(1991)
25 C4 GGGATCATCCACGTCATGCG - 1330-1349
26 C3 AGCCACATAGTTCACATTTCATCC - 1320-1297 327 Gouvea etal .(1991)
3-2. Reverse transcript (RT)-PCR
추출된 RNA 5 ㎕는 메틸설폭사이드 2 ㎕의 존재 하에 5분 동안 97 ℃에서 변성시켰다. OneStep Multiplex RT-PCR 분석에는 Qiagen OneStep RT-PCR 키트(Qiagen, Westburg, Germany)를 사용하였고, 프라이머로는 NSP3F-B 와 NSP3R-B 프라이머 세트 또는 NSP3F-B/NSP3R-B, Beg9/End9가 혼합된 프라이머 세트를 사용하였다. 다른 모든 필요한 구성요소들이 최적 농도로 포함하여 총 25 ㎕ PCR 혼합물을 준비하였다. 간략하게, cDNA는 42 ℃에서 40분간 반응하여 수득하였다. PCR은 35cycle(1분간 94 ℃ 1분간 52 ℃, 1분간 72 ℃)을 수행하였으며 cDNA가 증폭된 후, 각각의 PCR 산물의 3 ㎕를 1.2 % SeaKem LE 아가로스 겔(FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA)에 로딩하였다. 그리고 ethidium bromide로 염색하였다. 겔은 GelDoc XR 이미지 분석 시스템(BioRad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 시각화하였다.
4. 프라이머의 특이성 분석
NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 세트와 NSP3F-B2/NSP3R-B2 프라이머 세트를 백신 stock으로부터 세포배양에 적합하게 변형된(cell-culture adapted) 백신 바이러스, 세포배양에 적합하게 변형된 백신형 로타바이러스, 세포배양에 적합하게 변형되지 않은(non cell-culture adapted) 백신형 로타바이러스, 세포배양에 적합하게 변형된 야생형 바이러스 G1, G2, G3, G4, G9, G11 및 G12에 각각 처리하여 역전사 중합효소연쇄반응을 실시하였다.
5. 프라이머의 민감도 분석
NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 세트의 민감도를 분석하기 위하여, 백신 stock으로부터 세포배양에 적합하게 변형된 (cell-culture adapted) 백신 바이러스에서 추출한 RNA를 순차적으로 희석하여 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8 및 2-9ng/㎕ 로 준비하였다. 그 후, 준비된 백신 바이러스 RNA에 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 세트를 넣어 역전사 중합효소연쇄반응을 실시하였다.
6. 로타바이러스 임상시료에서의 적용
6-1. 임상시료 수집
총 1,106개의 대변 샘플들은 2011년 3월부터 2013년 2월까지 중앙 대학교 병원(서울, 한국)에서 급성 위장염으로 입원한 한국 아이들로부터 수집하였다. 모든 샘플들은 인산완충식염수(pH 7.4)로 10배 희석시켰고, 10분 동안 10,000g에서 원심분리하여 정화하였다. 모든 분변 샘플들은 중앙대학교 의과대학 심사위원회(Protocol #2009-13)에 의해 승인된 프로토콜을 사용하여 분석하였다.
6-2. G/P 유전자형 분석
유전자형에 대한 RT-PCR 분석은 초기 변성단계에서 5분 동안 97 ℃ 온도 조건에서 Qiagen OneStep RT-PCR 키트(Qiagen, Westburg, 독일)를 사용하여 수행하였다. 그룹 A 로타바이러스의 경우, VP7 유전자는 전술한 조건하에서 Beg9와 End9 프라이머들을 사용하는 dsRNA게놈에서 증폭하였다. G 유전자형 분석은 End9 프라이머와 G 타입 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10, 12에 각각 특이적인 aBT1, aCT2, aET3, aDT4, aAT8, aFT9, G10, G12 프라이머 세트 및 Beg9 프라이머와 G 타입 6에 특이적인 DT6 프라이머 세트를 사용하여 수행하였다. G유전형(H1, C, and A pools)에 대한 세 가지 추가적인 프라이머 세트들은 또한 ELISA 후 타입이 지정되지 않은 채로 남아있는 시료들을 분석하기 위해 사용되었다. VP4의 RT-PCR의 경우, 프라이머 세트들 Con3와 Con2은 Gentsch(Gentsch, et al., J Clin Microbiol. 30:1365-1373, 1992)에 의해 기술된 조건하에서 사용되었다. P 유전자형 분석의 경우, semi-nested PCR을 실시하였으며, 프라이머 Con3와 P[8], P[4], P[6], P[9], P[10]에 각각 특수한 프라이머 1T-1, 2T-1, 3T-1, 4T-1, 5T-1를 사용하였다. 그룹C 로타바이러스의 경우, VP6 유전자에 대한 RT-PCR로 프라이머 세트 C1과 C4를 사용하였고, 그 후 프라이머 세트 C1 과 C3를 사용하여 semi-nested PCR을 실시하였다. 각각의 PCR산물은 1.2 %의 SeaKem LE 아가로스 겔(FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA)로 분리하였다. 그 후, ethidium bromide로 염색하였다. 겔은 GelDoc XR 이미지 분석시스템(BioRad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 시각화하였다.
6-3. 제작한 프라이머를 이용한 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스 판별
임상시료로부터 로타바이러스 유전자형 G 타입 1, 2, 3, 4 ,6 및 P 타입 [8] 로타바이러스들을 대상으로 제작한 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 세트를 이용하여 백신형 로타바이러스를 검출하였다.
6-4. 뉴클레오티드 서열 분석
NSP3-F/NSP3-R 프라이머 세트를 이용하여 검출된 백신형 로타바이러스 샘플들은 VP7 및 VP4 유전자 염기서열 분석으로 백신 바이러스 유무를 재확인하였다. RT-PCR에 사용된 프라이머 세트는 BigDye 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트와 자동 디옥시리보 핵산(DNA) 시퀀서(Model 3730, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용한 내부 유전자 단편의 염기 서열을 분석에 이용되었다. 그 결과로 합성된 유전자는 CLUSTAL_X 1.81 program30 과 Lasergene 소프트웨어 (DNASTAR; Madison, WI, USA)를 사용하여 정렬하였으며, NCBI GenBank 에서 로타바이러스 서열과 비교 분석하였다.
6-5. 계통 분석
로타바이러스 백신 균주로부터 분리한 VP7과 VP4 유전자의 뉴클레오티드 배열은 기존의 백신 균주로부터 온 VP7과 VP4 유전자의 서열뿐만 아니라 GenBank 데이터베이스에서 비교 가능한 다른 기준 균주들과도 비교하였다. 계통수는 the PHYLIP suite(Felsenstein et al. PHYLIP (Phylogeny inference package) version 3.5c. Department of Genetics, University of Washington., 1993)의 이웃-결합 알고리즘(Saitou and Nei, Mol Biol Evol.4:406-425. 1987)을 사용하여 만들었고, 진화거리는 Jukes 등에 의해 기술된 모델(Jukes and Cantor, Academic Press, New York. 21132, 1969)을 기반으로 하였다. 나무 구조형태는 PHYLIP suite에서 나온 SEQBOOT 와 CONSENSE 프로그램으로 인접결합을 1000회 반복하는 부트스트랩 재샘플링 방법을 사용하여 평가되었다.
<실험 결과>
1. 프라이머의 특이성 확인
NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 세트와 NSP3F-B2/NSP3R-B2 프라이머 세트를 백신형 균주(도 2, 1-3레인)와 야생형 균주(도 2, 4-10레인)에 각각 처리하여 프라이머 특이성을 확인하였다. 그 결과 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 세트를 이용한 도 2A에서는 야생형 균주(도 2A, 4-10레인)에서는 밴드가 형성되지 않았다. 반면, NSP3F-B2/NSP3R-B2 프라이머 세트를 이용한 도 2B에서는 야생형 균주 중 G3(도 2B, 6 레인)에 희미한 밴드가 형성된 것을 확인할 수 있었다.
결과적으로 서열번호 3 및 4로 나타나는 NSP3F-B2/NSP3R-B2 프라이머 세트는 야생형 로타바이러스 균주에 대한 특이성이 떨어지는 것으로 확인하여, 서열번호 1 및 2로 나타나는 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 세트를 선택하여 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스를 판별하는 실험에 사용하였다.
2. 프라이머의 민감도 확인
NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 세트의 민감도를 확인한 결과 시료의 농도가 2-1 ng/㎕ 일 때부터 2-6 ng/㎕ 농도까지 검출되는 것을 확인하였다(도 3 참조). 즉, 2-6 ng/㎕ 농도 이상의 로타바이러스 RNA를 가지는 시료라면 본 발명의 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 세트를 이용하여 백신형 로타바이러스 또는 야생형 로타바이러스를 판별할 수 있는 것으로 확인되었다.
3. 백신형 로타바이러스와 야생형 로타바이러스의 구별 가능성 확인
소의 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 특이성을 G1, G2, G3, G4, G9, G11 및 G12 유전자형을 포함하는 야생형 로타바이러스와 백신 균주를 이용하여 측정하였다. 예상한 바와 같이, RT-PCR을 수행한 후에, 555bp DNA 단편은 백신 바이러스에서 성공적으로 증폭되었으나(도 4A, 1-5 레인), 야생형 바이러스에서는 증폭되지 못하였다(도 4A, 6-17 레인).
또한, 백신형 로타바이러스의 배출을 판별하기 위하여 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머와 Beg9/End9 프라이머를 혼합하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, VP7 유전자의 1062bp DNA 단편이 백신 균주 및 야생형 로타바이러스에서 모두 성공적으로 증폭되었다(도 4B, 1-11 레인). 반면 소 NSP3 유전자의 555bp DNA 단편은 오직 백신 균주에서만 성공적으로 증폭되었다(도 4B, 1-7 레인).
PCR 산물의 염기서열 분석은 백신형 균주의 NSP3 유전자와 동일한 것으로 조사되었다. 1069bp와 555bp인 밴드를 모두 나타내는 것은 백신형 로타바이러스가 감염되었거나 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스 모두가 공동감염되었음을 나타낸다. 대조적으로 1062bp의 밴드만을 나타내는 것은 야생형 로타바이러스만 감염되었음을 나타낸다. 이러한 결과는 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머가 백신형 로타바이러스에 특이적으로 작용한다는 것을 의미한다.
4. 임상 시료에서의 적용
수집한 임상시료로부터 로타바이러스 유전자형 G타입 1, 2, 3, 4, 6 및 P 타입 [8]이 검출된 시료들을 대상으로 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 세트를 이용한 역전사 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 그 결과 백신형 로타바이러스가 검출되었으며, 검출된 샘플들의 VP7 및 VP4 유전자 염기서열 분석을 통하여 백신형 로타바이러스를 확인하였다. VP7 및 VP4 유전자를 나타내는 계통수는 본 발명에서 NSP3F-B/NSP3R-B 프라이머 세트를 이용하여 검출된 백신 균주의 비교에 기반하여 작성되었다. 예상한 바와 같이, 이들 균주는 도 5와 같이 나타났다.
본 발명의 신규한 프라이머는 임상 시료에서 백신형 로타바이러스를 특이적이고, 민감하며, 빠르고 쉽게 검출 할 수 있다. 그로인해 로타바이러스 감염에 대한 빠르고 정확한 진단 내릴 수 있으며, 로타바이러스 감염 환자의 약물의 오남용을 막을 수 있어 산업상 이용 가능성이 높다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Novel primer set for detecting rotavirus and kit to distinguish wild rotavirus and vaccine rotavirus using the same <130> NP14-0121 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSP3F-B <400> 1 tggccgatac tagaactaca ga 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSP3R-B <400> 2 tgattacatc aatggaattt agc 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSP3F-B2 <400> 3 catgtttcag tgtgaagaga gc 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSP3R-B2 <400> 4 tgattacatc aatggaattt agc 23 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beg9 <400> 5 ggctttaaaa gagagaattt ccgtctgg 28 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> End9 <400> 6 ggtcacatca tacaattcta atctaag 27 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aBT1 <400> 7 caagtactca aatcaatgat gg 22 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aCT2 <400> 8 caatgatatt aacacatttt ctgtg 25 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aET3 <400> 9 cgtttgaaga agttgcaaca g 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aDT4 <400> 10 cgtttctggt gaggagttg 19 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aAT8 <400> 11 gtcacaccat ttgtaaattc g 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aFT9 <400> 12 ctagatgtaa ctacaactac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G12 <400> 13 ccgatggacg taacgttgta 20 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G10-F <400> 14 atgtatggta ttgaatatac cac 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G10-R <400> 15 aacttgccac cattttttcc 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DT6 primer <400> 16 gattctacac aggaactag 19 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Con3 <400> 17 tggcttcgcc attttataga ca 22 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Con2 <400> 18 atttcggacc atttataacc 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1T-1 <400> 19 tctacttgga taacgtgc 18 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2T-1 <400> 20 ctattgttag aggttagagt c 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3T-1 <400> 21 tgttgattag ttggattcaa 20 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4T-1 <400> 22 tgagacatgc aattggac 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5T-1 <400> 23 atcatagtta gtagtcgg 18 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1 <400> 24 ctcgatgcta ctacagaatc ag 22 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4 <400> 25 gggatcatcc acgtcatgcg 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C3 <400> 26 tggcttcgcc atttnataga ca 22

Claims (12)

  1. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 백신형 로타바이러스 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 백신형 로타바이러스는 RotaTeq® 백신 로타바이러스인 것을 특징으로 하는 백신형 로타바이러스 검출용 프라이머 세트.
  3. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트와 야생형 로타바이러스 검출용 프라이머를 포함하는 야생형 로타바이러스 및 백신형 로타바이러스 판별용 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 야생형 로타바이러스 검출용 프라이머는 서열번호 5 내지 26으로 이루어진 프라이머 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 야생형 로타바이러스 및 백신형 로타바이러스 판별용 키트.
  5. 제3항에 있어서, 상기 백신형 로타바이러스는 RotaTeq® 백신 로타바이러스인 것을 특징으로 하는 야생형 로타바이러스 및 백신형 로타바이러스 판별용 키트.
  6. (a) 시료의 RNA를 분리하는 단계;
    (b) (a)단계에서 준비한 RNA를 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하는 단계를 포함하는 백신형 로타바이러스를 검출하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 시료는 분변 시료인 것을 특징으로 하는 백신형 로타바이러스를 검출하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)은 다중 역전사 중합효소연쇄반응법(Multiplex reverse transcript RT-PCR)인 것을 특징으로 하는 백신형 로타바이러스를 검출하는 방법.
  9. (a) 시료의 RNA를 분리하는 단계;
    (b) (a)단계에서 준비한 RNA를 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트와 야생형 로타바이러스 검출용 프라이머로 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)단계의 PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스를 판별하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 시료는 분변 시료인 것을 특징으로 하는 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스를 판별하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 야생형 로타바이러스 검출용 프라이머는 서열번호 5 내지 26으로 이루어진 프라이머 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스를 판별하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)은 다중 역전사 중합효소연쇄반응법(Multiplex reverse transcript RT-PCR)인 것을 특징으로 하는 야생형 로타바이러스와 백신형 로타바이러스를 판별하는 방법.
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