KR101707992B1 - 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돼지 생식기호흡기 증후군 바이러스 진단용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 단일 튜브 네스티드 RT-PCR(STN-RT-PCR)을 수행할 경우, 단일 튜브에 RT-PCR 및 Nested PCR을 연속으로 수행하기 때문에 시료의 오염 가능성 및 위양성 발생 가능성이 낮고, 경제적인 장점이 있다. 또한, 상기 프라이머 세트를 이용할 경우, 민감도 및 검출 효율성이 높아 효과적으로 PRRSV를 진단할 수 있어, 돼지 번식장애질병, 호흡기질병 및 소모성질병 등 돼지에서 발생하는 질병의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법{Composition for diagnosing porcine reproductive and respiratory syndrome virus and method for diagnosing the same}
본 발명은 돼지 생식기호흡기 증후군 바이러스 진단용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
돼지 생식기호흡기증후군(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)은 전세계적으로 양돈업이 성행하는 대부분의 국가에서 발생하고 있는 질병으로서, 임신돈의 번식장애와 모든 일령의 돼지에서 호흡기질병을 유발하는 질병으로 양돈산업에 막대한 경제적 손실을 입히고 있으며, 국내 양돈업에 끼치는 직접적인 손실액은 연간 1,000억원 이상인 것으로 추정되고 있다. 상기 PRRS의 원인체인 돼지 생식기호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)는 높은 유전적 변이속도와 항원적 다양성을 갖는다. 상기 PRRSV는 유전적 및 항원적 특성이 구별되는 2개의 유전자형(genotype)으로 유럽형(type 1) 및 북미형(type2)이 있다. 과거에는 대륙(북미 및 유럽)별로 발생하는 유전형이 일정하였지만, 현재 우리나라를 포함한 대부분의 국가에서 상기 2개의 유전자형 PRRSV가 동시에 발생하고 있다. 또한, 농장 및 개체에 따라 각 유전자형의 바이러스가 단독 감염되기도 하지만 2 가지 유전형의 바이러스가 혼합 감염되어 있는 경우도 많다.
이러한 PRRS의 피해를 방지하기 위해서는, 신속 정확하게 PRRSV 감염 여부를 진단할 수 있는 효과적인 진단법의 개발 및 적용이 필수적이다. 특히, 상기 2가지 유전자형의 PRRSV가 복합 감염되는 상황을 고려할 때, 상기 2가지 유전자형의 PRRSV를 신속하게 감별 및 진단할 수 있는 진단법의 개발 및 적용이 시급한 실정이다.
PRRSV의 진단은 임상증상 관찰과 실험실 진단을 통하여 이루어진다. 실험실 진단법으로는 항체검사법과 항원검사법이 있으나 바이러스의 특성 등 추가조사를 위하여 바이러스 항원검사법을 주로 이용하고 있으며, 그 중 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR), nested RT-PCR, real time RT-PCR 등의 유전자진단법은 특이도와 민감도가 높고, 야외시료에서 신속하게 PRRSV의 유전형을 감별 및 진단할 수 있기 때문에 가장 널리 이용되고 있다.
상기 Real time RT-PCR 방법은 실시간으로 증폭산물의 양을 확인할 수가 있고, 특이도 및 민감도가 기존 RT-CR 방법보다 높아서 여러 실험실에서 PRRSV의 진단법으로 이용되고 있다. 그러나 real time RT-PCR 방법은 고가의 장비와 시약을 필요로 하며, 숙련된 전문 검사인력을 필요로 하기 때문에 일반 실험실에서 일상적으로 이용하기에는 한계가 있다. 특히 특이 프라이머와 프로브를 이용하기 때문에 높은 특이도를 가지기는 하지만 PRRSV와 같이 유전전 변이가 심한 바이러스인 경우 검출 대상이 되는 유전자 염기서열 부위에 변이가 발생할 경우 이러한 PRRSV 변이주를 검출할 수 없는 단점이 있으며, 기존 RT-PCR법이나 nested PCR 방법과 동일하게 증폭된 유전자의 오염에 의한 오진 가능성이 여전히 상존하고 있다.
또한, 상기 RT-PCR 방법은 기존의 역전사(RT)와 중합효소증폭반응(PCR) 과정을 접목한 방법으로 PRRSV와 같은 RNA 바이러스 진단에 널리 사용되고 있다. 그러나 1차 증폭과정을 거치는 RT-PCR로는 높은 민감도로 PRRSV를 검출할 수 없기 때문에 1차 증폭된 PCR 증폭산물을 대상으로 내부 프라이머(inner primer) 세트를 이용하여 2차적으로 내부 유전자를 재증폭하는 nested PCR 방법이 개발되었고, 이 방법을 이용할 경우에는 기존의 RT-PCR방법에 비하여 높은 민감도로 PRRSV를 검출할 수가 있다. 그러나 상기 방법은 1차 RT-PCR 과정과, 2차 nested PCR과정을 거치기 때문에, 2개의 튜브에서 실시하는 2단계의 과정을 거치게 됨으로써 실험시간과 경비가 많이 드는 단점이 있다. 또한, 1차 RT-PCR을 수행한 후, 2차 nested PCR을 수행하기 이전에 PCR 반응을 중단한 다음, 튜브 뚜껑을 열고 반응 시액을 2차적으로 혼합한 다음, 다시 nested PCR 과정을 수행하는 절차로 구성되어 있기 때문에 시험절차가 번거로울 뿐만 아니라 튜브를 열고 닫는 과정 중에 증폭된 유전자 등이 오염될 수 있으며, 이로 인한 오증폭 및 오진의 가능성이 여전히 존재한다. 이러한 오진은 PRRS 진단실 또는 실험자의 PCR 진단법에 대한 불신을 초래할 뿐만 아니라 PRRS 방역에 있어 큰 문제점으로 대두되고 있다.
이에 본 발명자는 PRRSV를 신속하고 특이적으로 진단하기 위해 연구를 지속한 결과, PRRSV의 ORF 6 및 ORF 7 유전자를 표적으로 하는 유럽형 또는 북미형 PRRSV 진단용 프라이머 세트를 제작하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 단일 튜브 네스티드 RT-PCR(STN-RT-PCR)를 수행할 경우, 시료의 오염 가능성 및 위양성 발생 가능성이 낮고, 경제적이며, 민감도 및 검출 효율성이 높아 효과적으로 유럽형 또는 북미형 PRRSV를 진단할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 돼지 생식기호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 PRRSV 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 PRRSV 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 프라이머 세트를 이용한 PRRSV 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 제1프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 제2프라이머 세트를 포함하는, 돼지 생식기호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 5 및 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 제3프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 제4프라이머 세트를 포함하는, PRRSV 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 PRRSV 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 PRRSV 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 시료의 RNA를 추출하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 추출된 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 제 1 프라이머 세트; 또는 서열번호 5 및 6로 표시되는 염기서열로 이루어진 제 3 프라이머 세트;를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)을 수행하는 단계; c) 상기 b) 단계의 반응물을 주형으로 하고, 서열번호 3 및 4로 표시되는염기서열로 이루어진 제 2 프라이머 세트; 또는 서열번호 7 및 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 제 4 프라이머 세트;를 이용하여 Nested PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, PRRSV 진단방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 단일 튜브 네스티드 RT-PCR(STN-RT-PCR)을 수행할 경우, 단일 튜브에 RT-PCR 및 Nested PCR을 연속으로 수행하기 때문에 시료의 오염 가능성 및 위양성 발생 가능성이 낮고, 경제적인 장점이 있다. 또한, 상기 프라이머 세트를 이용할 경우, 민감도 및 검출 효율성이 높아 효과적으로 PRRSV를 진단할 수 있어, 돼지 번식장애질병, 호흡기질병 및 소모성질병 등 돼지에서 발생하는 질병의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 STN-RT-PCR에 사용된 프라이머 세트의 제작과정을 모식화한 것을 나타낸 도이다.
도 2는 유럽형(A) 및 북미형(B) PRRSV에 대한 STN-RT-PCR용 프라이머 세트의 최적 어닐링 온도를 실험한 결과를 나타낸 도이다(레인 M : 100bp ladder, 레인 1: 50도, 레인 2: 53도, 레인 3: 56도, 레인 4: 59도, 레인 5: 62도, 레인 6: 65도, 레인 7: 67도, 레인 8: 68도).
도 3은 유럽형(A) 및 북미형(B) PRRSV에 대한 STN-RT-PCR용 프라이머 세트간의 최적 농도 비율을 실험한 결과를 나타낸 도이다(레인 M : 100bp ladder, 레인 1: 1:1, 레인 2: 1:2, 레인 3: 1:4, 레인 4: 1:5).
도 4는 유럽형(A) 및 북미형(B) PRRSV에 대한 STN-RT-PCR 조건 중 최적 증폭 회수를 실험한 결과를 나타낸 도이다(레인 M : 100bp ladder, 레인 1: 101 TCID50/㎖, 레인 2 : 100 TCID50/㎖, 레인 3 : 10-1 TCID50/㎖, 레인 4 : 10-2 TCID50/㎖, 레인 5 : 10-3 TCID50/㎖, 레인 6 : 10-4 TCID50/㎖, 레인 7 : 음성 대조군).
도 5는 STN-RT-PCR에 사용된 시약의 조성과 반응 조건을 나타낸 도이다.
도 6은 Two-step RT-PCR, one-step RT-PCR, two tube nested RT-PCR 및 STN-RT-PCR의 실험과정을 비교한 도이다(A: two-step RT-PCR, B: one-step RT-PCR, C: two-tube nested RT-PCR, D: STN-RT-PCR).
도 7은 STN-RT-PCR을 이용한 북미형 PRRSV의 특이적인 검출(A) 및 유럽형 PRRSV의 특이적인 검출(B) 결과를 나타낸 도이다 (M : 100 bp DNA ladder, 레인 1 : 유럽형 PRRSV, 레인 2 : 북미형 PRRSV, 레인 3 : 유럽형 및 북미형 PRRSV 혼합, 레인 4 : 돼지 서코바이러스 2, 레인 5: 돼지 파보바이러스, 레인 6 : 돼지 콜레라 바이러스, 레인 7 : 돼지 인플루엔자 서브타입 H1N1, 레인 8 : 돼지 인플루엔자 서브타입 H1N2, 레인 9 : 돼지 인플루엔자 서브타입 H3N2. N : 음성대조군).
도 8은 북미형 PRRSV에 대한 STN-RT-PCR 검출 민감도(A) 및 북미형 PRRSV에 대한 Two-tube nested RT-PCR 검출 민감도(B)를 확인한 결과를 나타낸 도이다(M : 100 bp DNA ladder, 레인 1 : 101 TCID50/㎖, 레인 2 : 100 TCID50/㎖, 레인 3 : 10-1 TCID50/㎖, 레인 4 : 10-2 TCID50/㎖, 레인 5 : 10-3 TCID50/㎖, 레인 6 : 10-4 TCID50/㎖, N : 음성 대조군).
도 9는 유럽형 PRRSV에 대한 STN-RT-PCR 검출 민감도(A) 및 유럽형 PRRSV에 대한 Two-tube nested RT-PCR 검출 민감도(B)를 확인한 결과를 나타낸 도이다(M : 100 bp DNA ladder, 레인 1 : 101 TCID50/㎖, 레인 2 : 100 TCID50/㎖, 레인 3 : 10-1 TCID50/㎖, 레인 4 : 10-2 TCID50/㎖, 레인 5 : 10-3 TCID50/㎖, 레인 6 : 10-4 TCID50/㎖, N : 음성 대조군).
도 10은 북미형 PRRSV에 대한 STN-RT-PCR 검출 민감도(A) 북미형 PRRSV에 대한 One-step RT-PCR 검출 민감도(B)를 확인한 결과를 나타낸 도이다(M : 100 bp DNA ladder, 레인 1 : 101 TCID50/㎖, 레인 2 : 100 TCID50/㎖, 레인 3 : 10-1 TCID50/㎖, 레인 4 : 10-2 TCID50/㎖, 레인 5 : 10-3 TCID50/㎖, 레인 6 : 10-4 TCID50/㎖, N : 음성 대조군).
도 11은 유럽형 PRRSV에 대한 STN-RT-PCR 검출 민감도(A) 및 유럽형 PRRSV에 대한 One-step RT-PCR 검출 민감도(B)를 확인한 결과를 나타낸 도이다(M : 100 bp DNA ladder, 레인 1 : 101 TCID50/㎖, 레인 2 : 100 TCID50/㎖, 레인 3 : 10-1 TCID50/㎖, 레인 4 : 10-2 TCID50/㎖, 레인 5 : 10-3 TCID50/㎖, 레인 6 : 10-4 TCID50/㎖, N : 음성 대조군).
본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 제1프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 제2프라이머 세트를 포함하는, 돼지 생식기호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 PRRSV는 유럽형(European, genotype 1)인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 서열번호 5 및 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 제3프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 제4프라이머 세트를 포함하는, PRRSV 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 PRRSV는 북미형(north American, genotype 2) 인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 "유럽형" 및 "북미형"은 PRRSV 유전자의 차이에 따라 2개의 유전자형으로 구분된 것으로, 두 가지 유전자형 사이에는 대략 50~70%의 염기서열 상동성과 50~80%의 아미노산 상동성을 보이고 있으며 각각의 유전자형 내에서 염기서열은 평균 12.5~15% 그리고 최대 21~30%의 유전적 차이가 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트에는 상기 PRRSV를 증폭시킬 수 있는 서열이 모두 포함되며, 당업계에 공지된 방법에 의하여 디자인할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 PRRSV의 ORF(open reading frame) 6 또는 ORF 7 유전자를 표적으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 "ORF 6" 및 "ORF 7"은, PRRSV의 9개의 오버랩핑(verlapping)된 open reading frame(ORF: 1a, 1b, 2a, 3, 4, 5, 6 and 7)에 포함되며, 상기 ORF6 및 ORF7는 PRRSV의 3개 주요 구조 단백질인 glycosylated envelope protein(GP5, 25 kDa), unglycosylated membrane protein(M, 18 kDa) 및 nucleocapsid protein (N, 15 kDa)을 코딩한다.
상기 프라이머 세트는 단일 튜브 네스티드 RT-PCR(Single-tube nested Reverse Transcription PCR)용인 것이 바람직하며, 이를 이용할 경우 단일 튜브에 RT-PCR 및 Nested PCR을 연속으로 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, "단일 튜브 네스티드 RT-PCR"은 기존에 바이러스 검출법에 사용되어 왔던 Real time RT-PCR, Two-step RT-PCR, one-step RT-PCR 및 two-tube nested RT-PCR 등의 문제점을 개선한 진단 방법이다. 상기 Real time RT-PCR은 유전적 변이가 심한 바이러스의 변이주를 검출할 수 없는 단점이 있고, 고가의 장비, 시약 및 숙련된 전문 검사인력을 필요로 하기 때문에 일반 실험실에서 일상적으로 이용하기에는 한계가 있다. Two-step RT-PCR법은 RT 수행하여 cDNA를 제작한 후, 다시 PCR을 수행하여 튜브를 교체해야 하는 번거로움이 있고, 상기 과정 중 증폭 산물이 오염될 가능성이 있는 단점이 있다. one-step RT-PCR법은 RT-PCR만을 수행하는 것으로, nested PCR을 수행하지 않아, 검출하고자 하는 바이러스에 대한 민감성 및 특이성이 낮은 단점이 있다. Two-tube nested RT-PCR법은 첫번째 PCR 산물을 수득한 후, 여기에 내부 프라이머 세트를 넣고, 새로운 튜브에 nested PCR을 수행하여 최종 PCR 산물을 수득하는 방법으로, 튜브를 2개 이상 사용해야 하며, 튜브 교체 시, 오염 가능성이 매우 높은 가능성이 있으며, 시간이 오래 걸린다.
따라서, 상기 검출법의 단점을 개선하기 위하여, 본 발명의 단일 튜브 네스티드 RT-PCR(STN-RT-PCR)법은, 1차 RT-PCR을 수행한 후, 동일 튜브 내에서 2차 nested PCR을 수행하는 것으로, 검출하고자 하는 바이러스에 대한 민감성 및 특이성이 높고, 단일 튜브에 상기 과정을 연속적으로 수행하기 때문에, 반응시약을 첨가하거나 혼합하기 위한 목적 등으로 실험 중간에 반응을 중단하거나 튜브 뚜껑을 열지 않고, 연속적으로 실험을 수행하는 것이 특징이다. 따라서, 시료의 오염 가능성이 낮고, 경제적이며, 신속하고 빠르게 바이러스를 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, PRRSV의 ORF 6 또는 ORF 7 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트를 제작하였다. 유럽형 PRRSV를 STN-RT-PCR법을 이용하여 진단하기 위하여, 607 bp의 크기로 제작된 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트는 1차 RT-PCR에 이용되었고, 443 bp의 크기로 제작된 서열번호 3 및 4 프라이머 세트는 2차 nested PCR에 이용하였다. 또한, 북미형 PRRSV를 STN-RT-PCR을 이용하여 진단하기 위하여, 605 bp의 크기로 제작된, 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 세트는 1차 RT-PCR에 이용되며, 328 bp의 크기로 제작된 서열번호 7 및 8 프라이머 세트는 2차 nested PCR에 이용하였다.
상기 제작된 프라이머를 이용하여, 유럽형 또는 북미형의 PRRSV을 검출하기 위하여, 단일 튜브에 50℃에서 30분간의 역전사(RT) 과정을 거친 후, 95℃에서 15분간 처리하고, 15회전의 1차 RT-PCR 과정(변성 과정 95℃ 30초, 어닐링 과정 65℃ 30초, 연장 과정 72℃ 30초)를 수행한 다음, 40회전의 2차 nested PCR 과정(변성 과정 95℃ 30초, 어닐링 과정 45℃ 30초, 연장 과정 72℃ 30초)를 수행한 후, 72℃에서 10분간 최종 반응하였다. 그 결과, PRRSV의 북미형 및 유럽형을 혼합한 시료를 적용했어도 북미형 또는 유럽형을 각각 특이적으로 검출함을 확인하였다. 또한 다른 돼지 바이러스을 검출하지 않음을 확인하였다. 또한, 튜브를 2개 이상 사용하는 일반적인 바이러스 진단 방법인 Two-step nested RT-PCR과 민감성 및 검출 효율성에서 차이가 없고, nested PCR을 수행하지 않는 One-step RT-PCR과 비교했을 때, 약 1000배이상의 민감성이 있고, 검출 효율성이 약 3배이상 차이가 있어, 본 발명의 STN-RT-PCR을 이용하여 유럽형 또는 북미형의 PRRSV을 검출 시, 민감성 및 검출 효율성이 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 PRRSV 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 PRRSV 진단용 조성물을 포함하는, PRRSV 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 "키트"는 상기 프라이머 세트 이외에 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 용기, PCR 반응용 버퍼 및 RNA 중합효소 등을 함유하는 용기를 포함한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있으며, 상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 포함하며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은 a) 시료의 RNA를 추출하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 추출된 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 제 1 프라이머 세트; 또는 서열번호 5 및 6로 표시되는 염기서열로 이루어진 제 3 프라이머 세트;를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)을 수행하는 단계;
c) 상기 b) 단계의 반응물을 주형으로 하고, 서열번호 3 및 4로 표시되는염기서열로 이루어진 제 2 프라이머 세트; 또는 서열번호 7 및 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 제 4 프라이머 세트;를 이용하여 Nested PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, PRRSV 진단방법을 제공한다.
상기 a) 단계의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 정액 및 체액에서 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, PRRSV가 검출될 수 있는 시료이면 어느 것이나 사용 가능하고, 이에 제한되지 않는다.
상기 b) 단계 및 c) 단계는 단일 튜브에서 연속적으로 수행되는 것이 바람직하다.
상기 b) 단계의 RT-PCR 수행 시 어닐링(annealing) 온도와 상기 c) 단계의 Nested PCR 수행시 어닐링 온도 차이가 13℃ 이상 20℃이하이나, 바람직하게는 15℃ 이상 20℃이하이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 d) 단계의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 상기 증폭 산물 검출할 수 있는 것이면 당업계에 공지된 어느것이나 사용 가능하고, 이에 제한되지 않는다.
상기 PRRSV는 유럽형 또는 북미형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 및 생검조직에서 RNA의 추출
PRRSV 및 생검조직에서 RNA의 추출을 하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, PRRSV의 표준균독주로서 LMY(NCBI accession number DQ473474) 및 Lelystad(NCBI accession number M96262)이 사용되었으며, 공시바이러스는 농림축산검역본부에서 분양 받아 사용하였다. 야외 시료는 PRRSV 이환 돼지로부터 혈액(혈청) 및 조직(폐장, 림프절)을 채취하였고, 조직은 세절하고 PBS(phosphate buffered saline)을 이용하여 10% 유제액을 만든 후, Precellys24 (Bertin technologies, France)을 이용하여 파쇄하였다. 그 후, 8,000rpm에서 10분간 원심 분리하고 상층액을 채취하여 -20℃에 보관하여 사용하였다. 혈청시료는 채취 혈액으로부터 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 채취한 다음, -20℃에 보관하여 사용하였다. 시판 RNA 추출키트(Inclone biotech, Korea)를 이용하여 모든 혈청 및 조직시료의 RNA를 추출한 다음, 추출 RNA 시료를 -20?에 보관하여 사용하였다.
실시예 2. PRRSV의 유럽형(type 1) 및 북미형(type 2)을 특이적으로 증폭하는 단일 튜브 네스티드 RT-PCR(single-tube nested Reverse Transcription PCR, STN-RT-PCR)용 프라이머 세트의 설계
PRRSV의 유럽형 및 북미형을 특이적으로 증폭하는 STN-RT-PCR용 프라이머 세트를 설계하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 2005년에서 2013년 사이에 NCBI Genbank에 등록된 유럽형(type 1) 및 북미형(type 2) PRRSV의 유전자 염기서열 정보를 확보한 후, 유전자 염기서열 분석프로그램인 DNASTAR® Lasergene(DNASTAR Inc., USA)을 이용하여 분석하였다. 그 중, 가장 변이가 적고 안정적인 PRRSV의 ORF(open reading frame) 6 및 7 유전자 부위를 탐색하여 유럽형 및 북미형 PRRSV를 각각 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 선발하였다.
유럽형 PRRSV인 경우, 1차 RT-PCR에서 예상되는 증폭산물이 607 bp의 크기가 되도록 EU-F1(서열번호 1)과 EU-R1(서열번호 2) 프라이머를 제작하였고, 2차 nested PCR에서 예상되는 증폭산물이 443 bp의 크기가 되도록, 그리고 EU-F2(서열번호 3)과 EU-R2(서열번호 4) 프라이머를 제작하였다. 또한, 북미형(type 2) PRRSV인 경우에는 1차 RT-PCR에서 예상되는 증폭산물이 605 bp의 크기가 되도록 NA-F1(서열번호 5) 및 NA-R1(서열번호 6) 프라이머를 제작하였고, 2차 nested PCR에서 예상되는 증폭산물이 328 bp 크기가 되도록 NA-F2(서열번호 7)과 NA-R2(서열번호 8) 프라이머를 제작하였다(Bioneer, Korea).
또한 유럽형 및 북미형의 PRRSV 유전자를 증폭하는 1차 RT-PCR용 프라이머 세트의 어닐링(anneling) 온도가 65℃가 되도록 하고, 1차 증폭된 PRRSV DNA을 주형으로 하는 2차 nested PCR의 프라이머 세트의 어닐링 온도를 45℃가 되도록 하여 1차 RT-PCR 및 2차 nested PCR의 결과에 각 프라이머 세트가 미치는 영향이 최소화되도록 설계하였다. 하기와 같이, 설계된 각 프라이머를 도 1 및 표 1에 나타내었다.
Type Name Sequence 5’-3’ 서열번호 종류 Size(bp) Genome
position		 Reference strain
(Genbank no.)
유럽형
(Type1)		 EUF1 CAGCTTCACAGAGTCATGGAAGTT 1 1차 RT-PCR 607 14341-14364 Lelystad
(M96262)
EUR1 CGAATCAGGCGCACTGTATGAG 2 14926-14947
EUF2 CCTTGGCCGGCGATACAT 3 2차 nested PCR 443 14392-14409
EUR2 CGATTGCAAGCAGAGG 4 14819-14834
북미형
(Type2)		 NAF1 TACTCAGCCATAGAAACCTGGA 5 1차 RT-PCR 605 14630-14651 LMY
(DQ473474)
NAR1 GGATCAGGCGCACAGTATGATG 6 15213-15234
NAF2 ATAACAACGGCAAGCA 7 2차 nested PCR 328 14896-14911
NAR2 ACAGTATGATGCGTAGGC 8 15206-15223
실시예 3. STN-RT-PCR의 증폭 조건 확인 및 PRRSV에 대한 특이성 검정
상기 실시예 2에서 제작한 각 프라이머를 첨가한 단일 튜브를 이용하여 1차 RT-PCR 및 2차 nested PCR을 수행하는 STN-RT-PCR의 증폭 조건을 확인하고, PRRSV에 대한 특이성을 검정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, STN-RT-PCR 반응액은 총 25 ㎕로서, Inclone one-step RT-PCR premix, 각 10 pmol의 프라이머 1 ㎕ 및 상기 실시예 1의 주형 RNA 5 ㎕를 첨가하여 구성하였다. 또한, STN-RT-PCR의 최적 증폭 조건을 확립하기 위하여, 각 프라이머의 어닐링 온도, 각 프라이머 세트의 적정 농도 및 적정 증폭회수(cycle)의 조합을 탐색하였다.
구체적으로, 프라이머의 최적화된 어닐링 온도를 결정하기 위하여, RT-PCR용 프라이머의 어닐링 온도를 50, 53, 56, 59, 62, 65, 67 및 68℃로 나누고, gradient PCR을 수행하여, RT-PCR용 프라이머 세트와 nested PCR 프라이머 세트의 염기서열 어닐링 온도를 15℃ 이상 차이나게 하여, 각 프라이머 세트에 의한 반응이 동시에 진행되지 않는 온도를 탐색하였다(도 2 참조). 또한, STN-RT-PCR 과정에 최적화된 프라이머의 농도를 설정하기 위하여, RT-PCR용 프라이머 세트와 nested PCR 프라이머 세트간의 농도 비율이 각 1:1, 1:2, 1:4 및 1:5가 되도록 한 후, 최적의 증폭 효율을 유도할 수 있는 조건을 탐색하였다(도 3 참조). 또한, 1차 RT-PCR과 2차 nested PCR을 통하여 가장 적합한 증폭효율을 유도할 수 있는 증폭 회수의 조합을 확정하기 위하여, 1차 RT-PCR 및 2차 nested PCR의 증폭횟수를 15회에서 40회로 각기 다르게 조합한 후, STN-RT-PCR을 실시하여 최적의 증폭효율을 갖는 증폭조건을 탐색하였다(도 4 참조)
따라서, 최종적으로 STN-RT-PCR의 반응 조건은, 도 5에 나타낸 바와 같이, 50?에서 30분간의 역전사(RT) 과정을 거친 후, 95℃에서 15분간 처리하고, 15회전의 1차 RT-PCR 과정(변성 과정 95℃ 30초, 어닐링 과정 65℃ 30초, 연장 과정 72℃ 30초)를 수행한 다음, 40회전의 nested PCR 과정(변성 과정 95℃ 30초, 어닐링 과정 45℃ 30초, 연장 과정 72℃ 30초)를 수행한 후, 72℃에서 10분간 최종 반응하였다. 이의 개략적인 과정을 도 6에 나타내었다. 유전자 증폭기는 SimpliAmp (Applied Biosystems, USA)를 사용하였으며, 증폭된 유전자 산물은 1.5% agarose gel 상에서 전기영동을 수행하여 분리하였고, Neogreen(Neo science, Seoul, Korea)로 DNA의 염색을 실시하였다. PCR 증폭 여부와 증폭산물의 크기는 Nabi system (Neo science, Seoul, Korea)을 이용하여 관찰하였고, DNA size marker 로는 100 bp DNA ladder (Inclone, Seoul, Korea)를 사용하여 확인하였다. 그 결과를 도 2 내지 도 7에 나타내었다.
도 2 내지 4에 나타낸 바와 같이, STN-RT-PCR 반응의 최적 조건을 확립하기 위하여 각 프라이머의 어닐링 온도, 각 프라이머 세트의 적정 농도, 적정 증폭회수(cycle)의 조합을 탐색한 결과, 어닐링 온도는 1차 RT-PCR에서는 65℃로, 2차 nested PCR에서는 45℃로 수행했을 때 가장 좋은 증폭반응이 나타남을 확인하였다. 또한, 각 프라이머 세트의 농도는, 1차 RT-PCR용 외부 프라이머(outer primer) 세트의 농도가 0.1μM이고, 2차 nested PCR용 내부 프라이머(innrer primer) 세트의 농도가 0.8μM일 때 가장 좋은 증폭 반응이 나타남을 확인하였다. 또한, 증폭반응 회수는, 1차 RT-PCR은 15회를, 2차 nested PCR은 40회를 수행하였을 때 가장 좋은 증폭반응이 나타남을 확인하였다.
또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, PRRSV의 북미형 및 유럽형을 혼합한 시료를 적용했을 때(레인 3), 상기 실시예 2에서 제작한 프라이머를 이용하여 STN-RT-PCR을 수행 시, 북미형 또는 유럽형 PRRSV를 각각 특이적으로 검출함을 확인하였다.
또한, 돼지 써코바이러스((Porcine circovirus type 2, PCV2, 레인 4), 돼지 파보바이러스(porcine parvovirus, 레인 5), 돼지 콜레라 바이러스(classical swine fever virus, 레인 6), 돼지 인플루엔자 서브타입 H1N1(swine influenza subtype H1N1, 레인 7), 돼지 인플루엔자 서브타입 H1N2(swine influenza subtype H1N2, 레인 8) 및 돼지 인플루엔자 서브타입 H3N2(swine influenza subtype H3N2, 레인 9)를 검출하지 않아, 본 발명의 STN-RT-PCR을 이용 시, PRRSV의 북미형 또는 유럽형만을 특이적으로 검출함을 확인하였다.
실시예 4. STN-RT-PCR 및 two-tube nested RT-PCR의 PRRSV 검출 민감도 비교
STN-RT-PCR 및 two-tube nested RT-PCR의 PRRSV 검출 민감도를 비교하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 표준 PRRSV 유럽형 및 북미형의 PRRSV 역가가 103 TCID50/㎖인 것을 연속적으로 10배씩 희석한 후, 주형 RNA로 각각 사용하여 삼반복으로 STN-RT-PCR 및 two-tube nested RT-PCR 실험을 수행하였다.
STN-RT-PCR 과정은 상기 표 1의 프라이머를 이용하여 실시예 3의 도 5와 같은 조건으로 수행하였다. two-tube nested RT-PCR은 도 6에 나타난 바와 같이, RT-PCR을 진행하고, 첫번째 PCR 산물을 수득한 후, 여기에 내부 프라이머 세트를 넣고, 새로운 튜브에 nested PCR을 수행하여 최종 PCR 산물을 수득하는 방법으로, 튜브를 2개 이상 사용해야 하는 일반적인 바이러스 검출 방법이다. two-tube nested RT-PCR는 1차 RT-PCR 및 2차 nested PCR을 각각의 튜브에서 분리하여 실시하였다. 1차 RT-PCR의 반응액으로는 총 25 ㎕으로, Inclone one-step RT-PCR premix, 각각 10 pmol의 프라이머와 주형 RNA 5㎕를 첨가하였다. 반응조건으로는 유럽형 PRRSV를 검출하기 위하여 outer primer 세트(EUF1(서열번호 1), EUR1(서열번호 2))를, 북미형 PRRSV를 검출하기 위하여 out primer 세트(NAF1(서열번호 5), NAR1(서열번호 6))를 각각의 튜브에 넣은 후, 50℃에서 30분간 RT과정을 거친 후 전-변성(pre-denaturation)을 95℃에서 15분간 1회 수행한 후에 95℃에서 20초로 변성 과정을 수행하고, 65℃에서 30초로 어닐링 과정, 72℃에서 30초로 연장 과정을 35회 반복하고, 72℃에서 10분간 후-연장(post-extension)을 실시하였다. 2차 nested PCR의 반응액으로는 총 25㎕으로, Inclone Ex TB premix, 북미형 및 유럽형을 검출하기 위한 각 nested primer 10 pmol을 첨가하고 1차 RT-PCR을 통하여 증폭된 증폭산물을 주형으로 하여 1㎕를 첨가하였다. 반응조건으로는 pre-denaturation을 95℃에서 2분간 1회 수행한 후에, 95℃에서 20초의 변성 과정, 45℃에서 30초의 어닐링 과정, 72℃에서 30초의 연장 과정으로 35 회 반복하고, 72℃에서 10분간 후-연장 과정을 실시하였다. 유전자 증폭기는 SimpliAmp(Applied Biosystems, USA)를 사용하였다. 증폭된 유전자 산물은 1.5% 아가로스 겔 상에서 전기영동을 수행하여 분리하였고, Neogreen(Neo science, Seoul, Korea)로 DNA의 염색을 실시하였다. PCR 증폭 여부와 증폭산물의 크기는 Nabi system(Neo science, Seoul, Korea)을 이용하여 관찰하였고, DNA 사이즈 마커로는 100 bp DNA ladder(Inclone, Seoul, Korea)를 사용하였다. STN-RT-PCR 및 two-tube nested RT-PCR의 PRRSV 검출 민감도 비교한 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여STN-RT-PCR을 수행할 경우, 유럽형 또는 북미형의 PRRSV 역가가 모두 10-3 TCID50/㎖ 이상에서 증폭되는 것을 확인하였다.
따라서, PRRSV를 진단함에 있어서, 단일 튜브에 1차 RT-PCR 및 2차 nested PCR을 수행하는 본 발명의 STN-RT-PCR 방법은, 튜브를 2개 이상 사용하는 일반적인 바이러스 진단 방법인 Two-step nested RT-PCR과 민감성에서 차이가 나지 않음을 확인하였다.
실시예 5. STN-RT-PCR 및 One-step RT-PCR의 PRRSV 검출 민감도 비교
STN-RT-PCR 및 One-step RT-PCR의 PRRSV 검출 민감도를 비교하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
다 구체적으로, 표준 PRRSV 유럽형 및 북미형의 PRRSV 역가가 101 TCID50/㎖인 것을 연속적으로 10배씩 희석한 후, 주형 RNA로 각각 사용하여 삼반복으로 STN-RT-PCR 및 One-step RT-PCR 실험을 수행하였다.
STN-RT-PCR 과정은 상기 표 1의 프라이머를 이용하여 실시예 3의 도 5와 같은 조건으로 수행하였다. One-step RT-PCR은 유럽형과 북미형의 PRRSV를 구분하지 않고 검출할 수 있는 RT-PCR 방법으로서, nested PCR을 수행하지 않는다. One-step RT-PCR은 도 6에 나타낸 바와 같이, 정방향(5'-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3', 서열번호 9) 및 역방향(5'-TCGCCCTAATTGAATAGGTGA-3', 서열번호 10)의 프라이머를 이용하였다. One-step RT-PCR 반응액으로는 총 25 ㎕으로, Inclone one-step RT-PCR premix, 각 10 pmol의 프라이머와 주형 RNA 5㎕를 첨가하였다. 반응조건은, 50℃에서 30분간의 역전사(RT) 과정을 거친 후, 95℃에서 15분간 처리하였고, RT-PCR 과정(변성 과정 95℃ 30초, 어닐링 과정 55℃ 30초, 연장 과정 72℃ 30초)를 40회전 수행 후 72℃에서 10분간 최종 반응하였다(J H Sur, ea al., J.Clin.Microbiol., 34(9):2280-2286, 1996). 유전자 증폭기는 GeneAmp 2700(Applied Biosystems, USA)를 사용하였다. 증폭된 유전자 산물은 1,5% 아가로스 겔 상에서 전기영동을 수행하여 유전자 단편을 분획하였고, NEO green(NEO science, Korea)로 염색하였고, 증폭산물의 크기는 Gel Doc EQ(Bio Rad, USA)을 이용하여 관찰하였고, DNA 사이즈 마커로는 100 bp DNA ladder(Inclone, Seoul, Korea)를 사용하였다. STN-RT-PCR 및 One-step RT-PCR의 PRRSV 검출 민감도를 비교한 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.
도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여STN-RT-PCR을 수행할 경우, 표준 PRRSV 유럽형 또는 북미형의 PRRSV 역가가 10-3 TCID50/㎖ 이상에서 증폭되는 것을 확인하였다. 그러나, One-step RT-PCR에서는 100 TCID50/㎖ 이상에서 증폭되는 것을 확인하였다.
따라서, PRRSV를 진단함에 있어서, 단일 튜브에 1차 RT-PCR 및 2차 nested PCR을 수행하는 본 발명의 STN-RT-PCR 방법은, nested PCR을 수행하지 않는 One-step RT-PCR 방법보다 약 1000배이상 민감성이 높음을 확인하였다.
실시예 6. 임상시료에서 STN-RT-PCR, Two-tube nested RT-PCR 및 One-step RT-PCR의 PRRSV 검출 효율성 비교
임상시료에서 STN-RT-PCR, Two-tube nested RT-PCR 및 One-step RT-PCR의 PRRSV 검출 효율성 비교하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, PRRSV 감염이 확인된 양돈장에서 채취한 돼지 폐장 및 혈액 시료 60개에서 추출한 RNA를 대상으로, PRRSV의 ORF 6 및 ORF 7 유전자 검출을 실시하였다.
STN-RT-PCR 과정은 상기 표 1의 프라이머를 이용하여 실시예 3의 도 5와 같은 조건으로, Two-tube nested RT-PCR 과정은 상기 실시예 4와 같은 조건으로, One-step RT-PCR 과정은 상기 실시예 5와 동일한 조건으로 PRRSV 검출 효율성을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
Sample STN-RT-PCR Two-tube
nested RT-PCR		 One-step RT-PCR
No. of
positive(%)		 No. of
negative(%)		 No. of
positive(%)		 No. of
negative(%)		 No. of
positive(%)		 No. of
negative(%)
Lung
(n=30)		 30 0 30 0 11 19
Blood
(n-30)		 30 0 30 0 10 20
Total 60(100.0) 0 60(100.0) 0 21(35%) 39(65%)
표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 STN-RT-PCR을 수행할 경우, 모든 시료에서 PRRSV의 ORF 6 및 ORF 7 유전자가 100% 검출됨을 확인하였다. 그러나, One-step RT-PCR을 수행할 경우, 양성 검출률이 35%에 불과하여, 본 발명의 STN-RT-PCR을 수행할 경우에 비해 약 3배 이상의 차이가 나타남을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 STN-RT-PCR법이 임상시료에서 PRRSV를 검출하는데 있어 매우 유용함을 확인하였다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for diagnosing porcine reproductive and respiratory syndrome virus and method for diagnosing the same <130> Knu1-241 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EUF1 Primer for European genotype <400> 1 cagcttcaca gagtcatgga agtt 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EUR1 Primer for European genotype <400> 2 cgaatcaggc gcactgtatg ag 22 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EUF2 Primer for European genotype <400> 3 ccttggccgg cgatacat 18 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EUR2 Primer for European genotype <400> 4 cgattgcaag cagagg 16 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NAF1 Primer for North American genotype <400> 5 tactcagcca tagaaacctg ga 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NAR1 Primer for North American genotype <400> 6 ggatcaggcg cacagtatga tg 22 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NAF2 Primer for North American genotype <400> 7 ataacaacgg caagca 16 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NAR2 Primer for North American genotype <400> 8 acagtatgat gcgtaggc 18 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for One-step RT-PCR <400> 9 atggccagcc agtcaatca 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for One-step RT-PCR <400> 10 tcgccctaat tgaataggtg a 21

Claims (15)

  1. 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 제1프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 제2프라이머 세트를 포함하는, 돼지 생식기호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 진단용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 PRRSV는 유럽형(European, genotype 1)인 것을 특징으로 하는, PRRSV 진단용 프라이머 세트.
  3. 서열번호 5 및 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 제3프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 제4프라이머 세트를 포함하는, PRRSV 진단용 프라이머 세트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 PRRSV는 북미형(North American, genotype 2)인 것을 특징으로 하는, PRRSV 진단용 프라이머 세트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 단일 튜브 네스티드 RT-PCR(Single-tube nested Reverse Transcription PCR)용 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, PRRSV 진단용 프라이머 세트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단일 튜브 네스티드 RT-PCR은 단일 튜브에 RT-PCR 및 Nested PCR을 연속으로 수행하는 것을 특징으로 하는, PRRSV 진단용 프라이머 세트.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 PRRSV의 ORF(open reading frame) 6 또는 ORF 7 유전자를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는, PRRSV 진단용 프라이머 세트.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, PRRSV 진단용 조성물.
  9. 제8항의 PRRSV 진단용 조성물을 포함하는, PRRSV 진단용 키트.
  10. a) 시료의 RNA를 추출하는 단계;
    b) 상기 a) 단계에서 추출된 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 제 1 프라이머 세트; 또는 서열번호 5 및 6로 표시되는 염기서열로 이루어진 제 3 프라이머 세트;를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)을 수행하는 단계;
    c) 상기 b) 단계의 반응물을 주형으로 하고, 서열번호 3 및 4로 표시되는염기서열로 이루어진 제 2 프라이머 세트; 또는 서열번호 7 및 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 제 4 프라이머 세트;를 이용하여 Nested PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    d) 상기 c) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, PRRSV 진단 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 a) 단계의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 정액 및 체액에서 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, PRRSV 진단 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 b) 단계 및 c) 단계는 단일 튜브에서 연속적으로 수행되는 것을 특징으로 하는, PRRSV 진단 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 b) 단계의 RT-PCR 수행 시 어닐링(annealing) 온도와 상기 c) 단계의 Nested PCR 수행시 어닐링 온도 차이가 13℃ 이상 20℃이하인 것을 특징으로 하는, PRRSV 진단 방법.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 d) 단계의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, PRRSV 진단 방법.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 PRRSV는 유럽형 또는 북미형인 것을 특징으로 하는, PRRSV 진단 방법.

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