CN110607398A

CN110607398A - 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒

Info

Publication number: CN110607398A
Application number: CN201910856765.8A
Authority: CN
Inventors: 王林; 吴迪; 张启龙; 高晓龙; 栗云鹏; 张玮; 杜鹃; 李蕊; 程汝佳; 王培�; 韦海涛; 宋彦军; 周德刚; 刘晓冬
Original assignee: BEIJING MUNICIPAL CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: BEIJING MUNICIPAL CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2019-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2039-09-11
Also published as: CN110607398B

Abstract

本发明公开了一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的RT‑LAMP试剂盒。本发明的试剂盒中包含了针对猪流行性腹泻病毒M基因设计的引物组合，所述引物组合中包含了一对外引物、一对内引物和一条环引物。利用本发明制备的RT‑LAMP试剂盒可实现对猪流行性腹泻病毒的高灵敏度和高特异性检测，检测最低限为2copies/μL，同时操作简便，成本较低，可以实现对多种流行病毒株成功进行检测，适于在疫情预爆发时现场快速诊断疫病，及时控制疫情。

Description

一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的RT-LAMP试剂盒

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒的 RT-LAMP试剂盒。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起猪的一种以严重腹泻、呕吐、脱水为主要临床特征的高度接触性消化道传染病。此病多发于冬季12月份至翌年4月份，在夏季也可发生。各种年龄的猪都易感，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100％，尤其哺乳仔猪受害最严重，病死率平均为50％。

猪流行性腹泻的潜伏期为5～8天。发病初期猪的临床症状不明显，只出现少食或不食现象，体温正常，持续1～2天后，发病猪出现水样腹泻，粪便呈酸性，有的出现呕吐，呕吐多发生在吃食或吃奶后。大多数乳猪病初仍然吮乳，后因水样腹泻不止，3～4天后开始脱水衰竭而死亡，病死率平均为 50％，但有时会高达100％。架子猪或育肥期间猪只爆发急性猪流行性腹泻时，所有的猪只在一周内表现为腹泻，食欲稍减退，精神沉郁，粪便呈现水样，大多数猪只在7～10天后康复，病死率仅为1％～3％，且这种死亡常见于腹泻早期或发生腹泻之前。母猪发病后常出现精神委顿、厌食和持续腹泻(约 1周)等现象，一般逐渐恢复正常，少数伴发流产等症状。

传统的PEDV检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、猪流行性腹泻病毒抗原检测、血清学诊断与分子生物学诊断。目前最常用分子生物学诊断方法有常规PCR和荧光定量PCR等。传统的PEDV检测方法存在需要使用高成本仪器设备，试验所需时间较长等不足。RT-PCR和Real-time RT-PCR虽然较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是对于操作人员的分子生物学技术背景要求很高，试剂成本很贵，难以在基层实际生产中普及应用。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，能在等温(60～65℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行大量的核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点；在灵敏度、特异性和检测范围等指标上也能媲美甚至优于PCR技术，且该方法不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

LAMP的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型 DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15～60分钟内实现10⁹～10¹⁰倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。LAMP方法的优势除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，在应用阶段对仪器的要求低，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可，不像普通PCR方法需要进行凝胶电泳观察结果，是一种适合现场、基层快速检测的方法。

荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的RT-LAMP试剂盒是在LAMP 技术的基础上添加了荧光，无需后续的电泳检测，直接在仪器上检测荧光或者肉眼判定，提高了检测的灵敏度。

虽然目前有一些研究者针对猪流行性腹泻病毒开发了基于LAMP的检测方法，但上述方法中依然存在着检测灵敏度相对较低、无法实现对多种不同的流行病毒株同时检测的不足，严重制约着在它们在实际检测中的应用。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、荧光可视化的RT-LAMP试剂盒，适用于多种不同的猪流行性腹泻病毒株的快速、精确地检测。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于检测猪流行性腹泻病毒的特异性引物组合，包括一对特异性外引物，一对特异性内引物和一条环引物，其核苷酸序列分别为：

外引物F3：TCTGCATTCCAGTGCTTGG(SEQ ID NO.1)；

外引物B3：CCCAACCAGTGCCAGATG(SEQ ID NO.2)；

内引物FIP:

CCTGTACGCCAGTAGCAACCTTTGGTGTAACGCTAACACTCC(SEQ ID NO.3)；

内引物BIP:

TGCCTGATTTCGTCACAGTCGCAACGACCAACACGTCCATAG(SEQ ID NO.4)；

环引物LB：CCCTCTACAAACAATGTACCACTAA(SEQ ID NO.5)。

第二方面，本发明提供了猪流行性腹泻病毒的特异性引物组合在制备检测试剂中的应用，所述检测试剂优选为试剂盒，所述试剂盒优选为RT-LAMP 试剂盒，本发明的试剂盒适用于水浴锅、PCR仪、恒温金属浴、恒温扩增仪等一系列恒温扩增设备。

第三方面，本发明提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和操作简单的检测猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，其中包含一对特异性外引物、一对特异性内引物和一条环引物，所述引物的核苷酸序列分别为：

外引物F3：TCTGCATTCCAGTGCTTGG；

外引物B3：CCCAACCAGTGCCAGATG；

内引物FIP：

CCTGTACGCCAGTAGCAACCTTTGGTGTAACGCTAACACTCC；

内引物BIP：

TGCCTGATTTCGTCACAGTCGCAACGACCAACACGTCCATAG；

环引物LB：CCCTCTACAAACAATGTACCACTAA。

进一步的，本发明的试剂盒还包含病毒总RNA提取试剂和检测试剂。

所述病毒总RNA提取试剂含有TRIzol、氯仿或异戊醇、和异丙醇。

所述检测试剂包括无RNA酶的蒸馏水、RT-LAMP反应液、阴性质控标准品和阳性质控标准品；所述RT-LAMP反应液包含RT-LAMP预混液、酶溶液和荧光目视检测试剂。

本发明的试剂盒中，所述RT-LAMP反应液的配方(一个反应体系中 RT-LAMP反应液20μL)为：

1、RT-LAMP预混液(18μL)：2×反应缓冲液12.5μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP246)、5μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L的内引物FIP 1μL、40μmol/L的内引物BIP 1μL、20 μmol/L的环引物LB 1μL、无RNA酶的蒸馏水0.5μL；

2、酶溶液1μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP246)；

3、荧光目视检测试剂1μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号 SLP221)。

本发明的试剂盒中，所述阳性质控标准品为含有猪流行性腹泻病毒经典株病毒基因组RNA的提取液，阴性质控标准品为无RNA酶蒸馏水。

本发明的试剂盒，所述RT-LAMP反应液(一个反应体系中RT-LAMP反应液20μL)的替代配方为：

1、RT-LAMP预混液(16.5μL)：10×Thermopol buffer 2.5μL、50mmol/L MgSO₄ 3.5μL溶液、5.0mmol/L甜菜碱溶液2.5μL、10mmol/L dNTPs 3μL、5 μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L的内引物FIP 1 μL、40μmol/L的内引物BIP 1μL、20μmol/L的环引物LB 1μL。

2、酶溶液:8.0U/μL的Bst DNA聚合酶1μL和10U/μL AMV逆转录酶0.5 μL。

3、荧光目视检测试剂：10mmol/L MnCl₂溶液1.5μL、1.0mmol/L的钙黄绿素溶液0.5μL。

本发明的试剂盒，其工作程序为：

(1)在RT-LAMP专用反应试管里，配制RT-LAMP反应体系；RT-LAMP 反应体系25μL配方为：RT-LAMP反应液20μL，待测样品RNA模板为5μL；

(2)将配置好、分装完毕的反应试管置于恒温测定装置中，在65℃下恒温45分钟。

(3)分析数据，显示检测结果。

第四方面，本发明提供了一种检测猪流行性腹泻病毒的方法，该方法包括利用本发明中第一方面的引物组合或第三方面的试剂盒对猪流行性腹泻病毒进行检测。

本发明的检测方法可用于临床样品中病毒的检测，也可用于动物饲料、饮水等环境中的病毒检测，此外，本发明的方法还可用于实验室用途。

本发明提供的试剂盒在猪疫病检测和预防中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明试剂盒检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：呈现绿色或有特定扩增曲线(2)阴性对照：呈现橘黄色或无特定扩增曲线；待测样本结果判定：(1)阳性：呈现绿色或有特定扩增曲线。(2)阴性：呈现橘黄色或无特定扩增曲线。

本发明的发明人经过大量的探索和尝试，通过调整Tm值、GC含量、 dG临界值、扩增长度及片段区域等参数，最终设计并筛选出用于检测猪流行性腹泻病毒的最佳引物组合，本发明的引物组合相对于备选的其他引物及现有技术中已知的引物而言，在病毒检测方面具有更高的灵敏度、特异性和准确性，能够更好的实现对猪流行性腹泻病毒的检测。

利用本发明的引物组合所制备的试剂盒，具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、操作简便等优点，最低检测限在2copies/μL，比实时荧光定量PCR低10倍，但操作上相对于后者更简便，成本也更低，由于在病毒疫情爆发初期病毒载量较低，因此本发明的试剂盒特别适于在疫情预爆发时现场快速诊断疫病，及时控制疫情。

本发明的引物组合是在对多种不同流行病毒株M基因多序列比对基础上，针对其保守区域而进行设计的，从而可以实现对多种流行病毒株的同时检测，适用范围更广，检测结果也更准确。

附图说明

图1.本发明引物组合的扩增效果验证。

图2a与图2b分别为本发明的引物组合制备的试剂盒检测结果与 Real-time PCR法检测灵敏度检测结果对比。其中图2a为利用本发明的引物组合进行RT-LAMP的检测结果，管1为2×10⁴copies/μL，管2为2×10³ copies/μL，管3为2×10²copies/μL，管4为2×10¹copies/μL，管5为2×10 copies/μL，管6为2×10^-1copies/μL，管7为12×10^-2copies/μL，管8为阴性对照。图2b为Real-time PCR检测结果，管1(对应扩增曲线1，下同) 为2×10⁴copies/μL，管2为2×10³copies/μL，管3为2×10²copies/μL，管 4为2×10¹copies/μL，管5为阳性对照，管6为2×10⁰copies/μL，管7为2 ×10^-1copies/μL，管8为阴性对照。

图3.本发明的引物组合制备的试剂盒特异性检测结果。其中管1为 PEDV CV777株，管2为PEDV AJ1102株，管3为PEDV ZJ08株，管4为欧洲型PRRSV LV株，管5为猪瘟病毒，管6为猪圆环病毒2型，管7为猪伪狂犬病病毒，管8为猪健康细胞培养物。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 LAMP引物的设计与验证

1、引物的设计

根据Genbank已发表的猪流行性腹泻病毒基因序列，包括经典毒株 CV777(GenBank:AF353511.1)，PEDV变异毒株AJ1102(Genbank: JX188454.1)，PEDV变异毒株AH2012(Genbank:KC210145.1)、PEDV变异毒株JXNC1302(Genbank:KJ526109.1)、PEDV变异毒株FJ-CL(Genbank: KJ646593.1)、PEDV变异毒株FJ-ZP(Genbank:KJ646609.1)、PEDV变异毒株GD-1(Genbank:JX647847.1)，通过多序列比对鉴定保守区域，运用在线生物软件(http://primerexplorer.jp/)，通过调整Tm值、GC含量、dG 临界值、扩增长度和片段区域等参数值，设计适用于RT-LAMP的特异性外引物和内引物，通过实验筛选出最佳的外引物和内引物后，在此引物组的基础上设计最佳的环引物，最终得到本发明的引物组合(表1)。

表1引物序列

2、引物的筛选及验证

(1)毒株与试剂

PEDV：PEDV CV777株、PEDV AJ1102株，PEDV AH2012株、JXNC1302 株、FJ-CL株、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪蓝耳病毒JXA1 株、猪伪狂犬病病毒由本实验室保存。LAMP扩增试剂购自荣研生物科技(中国)有限公司。

(2)在实时浊度测定仪器(LA-320C)上使用设计的引物组合(表1)进行LAMP扩增，扩增反应体系(25μL)为：

RT-LAMP预混液(18μL)：2×反应缓冲液12.5μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP246)、5μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物 B3 1μL、40μmol/L的内引物FIP1μL、40μmol/L的内引物BIP 1μL、20μmol/L 的环引物LB 1μL、无RNA酶的蒸馏水0.5μL；

酶溶液1μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP246)；

荧光目视检测试剂1μL(购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP221)；

RNA样品5μL；

扩增反应工作程序为：65℃，120min。

(3)扩增结果如图1所示，PEDV CV777株(编号1)、PEDV变异株AJ1102 (编号2)、PEDV变异株AH2012(编号3)、PEDV变异株JXNC1302(编号4)、PEDV变异株FJ-CL(编号5)均在30min内检出，猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪健康细胞培养物(编号6-8)在120min内均未检出。结果表明，本发明的引物组合具有较高的扩增效率和特异性。

实施例2在实时浊度测定仪器上检测猪流行性腹泻病毒的 RT-LAMP方法退火温度的优化

1、选择引物组合为：实施例1表1中的引物组合。

2、RT-LAMP扩增反应体系如实施例1，即RT-LAMP预混液18μL，酶溶液1μL，荧光目视检测试剂1μL，RNA 5μL。

3、在Loopamp仪上进行扩增，设置58℃，60℃，63℃，65℃四个温度。

4、分析结果：结果显示，65℃条件下扩增效果最好，选择65℃作为本发明的引物组合的扩增温度。

实施例3病毒RNA提取

1、样品采集：采集病死猪或发病猪粪便、小肠及其内容物，采集的样品 2～8℃保存，送实验室检测(要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料)。

2、样品处理：每份样品分别处理。

(1)组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。

(2)阳性对照处理：取阳性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

(3)阴性对照处理：取阴性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

3、病毒RNA的提取

(1)取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，室温静置3～5min。

(2)将液体吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱)，13000rpm离心30s。

(3)弃去收集管中液体，加入600μL洗液，13000rpm离心30s。

(4)重复步骤(3)。

(5)弃去收集管中液体，13000rpm空柱离心2min，以除去残留的洗涤液。

(6)将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，向柱中央加入洗脱液50μL，室温静置1min，13000rpm离心30s，离心管中液体即为模板RNA。

实施例4使用制备的RT-LAMP试剂盒检测猪流行性腹泻病毒

1、荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的RT-LAMP试剂盒的组装

用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签，标示名称、批号、生产日期、有效期等。

规格及数量(48T/盒)。

溶液A(RNase Free dH₂O)1支，500μL；溶液B(RT-LAMP预混液)1支， 864μL；溶液C(酶反应液)1支48μL，溶液D(荧光目视检测剂)1支， 48μL；溶液E(阳性质控标准品)1支，40μL；阳性质控标准品使用基因组 RNA为阳性模板，使用Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)稀释后冷冻保存。将检验合格的阳性对照制剂按40μL定量分装。使用RNase Free dH₂O 为阴性对照。

上述RT-LAMP预混液一个检测反应18μL的配方为：2×反应缓冲液 12.5μL、5μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L 的内引物FIP 1μL、40μmol/L的内引物BIP 1μL、20μmol/L的环引物LB 1 μL、无RNA酶的蒸馏水0.5μL。

2、实验流程

(1)使用时，在18μL的RT-LAMP预混液中加入1μL酶反应液、1μL 荧光目视检测剂和5μL的RNA模板，得到25μL的RT-LAMP反应体系，用于反应。

(2)将配置好、分装完毕的反应试管置于实时浊度测定仪器中在65℃下恒温45分钟。

(3)分析数据，显示检测结果。

3、结果分析和判定

实施例5灵敏度检验

1、模板的制备：将PEDV CV777株的M基因片段合成质粒，质粒原浓度经数字PCR定量为2×10⁴copies/μL,进行10倍倍比稀释，分别进行 RT-LAMP和Real-time PCR扩增，检测灵敏度。

2、RT-LAMP反应体系：RT-LAMP预混液18μL，酶反应液1μL，荧光目视检测剂1μL，模板5μL，总体积25μL。反应程序为：65℃45min。

3、Real-time PCR反应体系：按照猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-PCR 检测试剂盒(购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，生产批号 PED20180927p)进行操作。反应体系是：无菌无核酸酶水7μL，RT-PCR反应液12.5μL，酶混合液1μL，荧光探针2.5μL，模板2μL，总体积25μL。反应程序为：42℃5min，95℃10s；循环95℃5s，60℃35s，循环数为 40。在每次循环第二步(60℃35s)收集荧光信号(报告基团“FAM”，淬灭基团“None”)。

4、检测结果如图2a和图2b所示，RT-LAMP检测结果显示，管1-管5 均为阳性(显示绿色)，即该方法的检测最低限为2copies/μL(图2a)，比 Real-time PCR检测灵敏度高出10倍。

实施例6特异性检验

1、用本发明制备的试剂盒按照实施例4表述的方法分别检测PEDV CV777株、PEDVAJ1102株，PEDV ZJ08株(分别对应管1、管2和管3)；猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪蓝耳病毒JXA1株，猪伪狂犬病病毒等提取的基因组，验证反应体系的特异性。

2、检测结果如图3所示，从该图可以看出，本发明的试剂盒可以成功检测出PEDVCV777株、PEDV AJ1102株，PEDV ZJ08株(分别对应管1、管 2和管3)；猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪蓝耳病毒JXA1 株，猪伪狂犬病病毒，均未检出(分别对应管4、管5、管6、管7和管8)，结果表明本发明的引物组合制备的试剂盒具有良好的特异性。

实施例7临床样品检测

1、用本发明的试剂盒和实施例5中的实时荧光定量RT-PCR方法同时检测30份临床样品(其中22份为阴性样本，8份为阳性样品)，分析两种检测结果的符合率。

2、检测结果显示，用所建立的RT-LAMP方法与荧光定量RT-PCR方法检测结果一致(表2)，符合率为100％。但RT-LAMP扩增时间比荧光定量 RT-PCR短，RT-LAMP扩增时间为45min，荧光定量RT-PCR扩增时间约为 80min。

表2 RT-LAMP与荧光定量RT-PCR方法检测结果

以上检测结果证明了本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、检测方便快捷、结果准确可靠。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京市动物疫病预防控制中心

<120> 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒株的RT-LAMP试剂盒

<130> 20190811

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctgcattcc agtgcttgg 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccaaccagt gccagatg 18

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgtacgcc agtagcaacc tttggtgtaa cgctaacact cc 42

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgcctgattt cgtcacagtc gcaacgacca acacgtccat ag 42

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccctctacaa acaatgtacc actaa 25

Claims

1.一种检测猪流行性腹泻病毒的RT-LAMP引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：

外引物F3：TCTGCATTCCAGTGCTTGG；

外引物B3：CCCAACCAGTGCCAGATG；

内引物FIP:

CCTGTACGCCAGTAGCAACCTTTGGTGTAACGCTAACACTCC；

内引物BIP:

TGCCTGATTTCGTCACAGTCGCAACGACCAACACGTCCATAG；

和环引物LB：CCCTCTACAAACAATGTACCACTAA。

2.权利要求1所述的引物组合在制备检测猪流行性腹泻病毒的RT-LAMP试剂盒的应用。

3.一种检测猪流行性腹泻病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物组合。

4.根据权利要求3所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含了RNA提取试剂。

5.根据权利要求3所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含了RT-LAMP反应液，所述反应液中包含RT-LAMP预混液、酶溶液和荧光目视检测试剂。

6.根据权利要求5所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP预混液中包含反应缓冲液、外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LB、无RNase酶蒸馏水。

7.根据权利要求3-6任一项所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含阴性质控标准品和/或阳性质控标准品。

8.一种检测猪流行性腹泻病毒的RT-LAMP方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的引物组合或权利要求3-7任一项所述的RT-LAMP试剂盒检测猪流行性腹泻病毒的步骤。

9.权利要求1所述的引物组合或权利要求3-7任一项所述的RT-LAMP试剂盒在检测猪流行性腹泻病毒中的应用。