CN111979355A

CN111979355A - 一种大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法

Info

Publication number: CN111979355A
Application number: CN202010898385.3A
Authority: CN
Inventors: 陈新华; 郭睿; 何天良
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2020-08-31
Filing date: 2020-08-31
Publication date: 2020-11-24

Abstract

本发明公开了一种大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法，本发明以大黄鱼虹彩病毒LYCIV中的Laminin‑like保守区序列作为扩增靶序列，设计合成了一对特异性引物及对应的TaqMan探针，建立了LYCIV TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法，并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒，本发明引物和探针的序列如下：正向引物F：5’‑CGCTTGACCAAACAATCTTC‑3’；反向引物R：5’‑ATGAGCAATGGCGACCC‑3’；荧光探针Q：5’‑6‑FAM–CTTCTTCTGTTGCTGACTGTGGCGTGTACTC‑BHQ1‑3’。

Description

一种大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及大黄鱼虹彩病毒的检测方法，特别涉及大黄鱼虹彩病毒（LargeYellow Croaker Iridovirus，LYCIV）的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法。

背景技术

大黄鱼虹彩病毒（Large Yellow Croaker Iridovirus，LYCIV）是虹彩病毒科细胞肿大病毒属的成员，夏季高水温期为大黄鱼虹彩病毒病主要流行季节，高发期水温25℃-28℃，该病主要危害体长10cm左右的当年春苗，蔓延迅速，半个月内死亡率可达30%-50%。对于病毒性疫病，尚没有特效的治疗方法，病毒的早期检测和诊断仍是最重要的防治手段。因此，建立快速灵敏实用的大黄鱼虹彩病毒PCR检测技术，不仅有助于及时对大黄鱼虹彩病毒进行诊断、监控和防治，减少经济损失，而且也是今后加强科学养殖管理，建立苗种检疫体系所必须的。

目前，对大黄鱼虹彩病毒的检测主要采用透射电镜（Transmission ElectronMicroscope，TEM）观察和常规聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）检测等技术方法。但这些方法有的耗时长，操作繁琐，有的准确率不高，灵敏度低。而TaqMan探针法荧光定量PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、TaqMan探针与DNA模板的高特异性杂交和光谱技术的敏感性及定量分析的优点，克服了常规PCR定性检测特异性差、准确率和灵敏度低的不足，极大地提高了检测的特异性、准确性和灵敏性。当前，荧光定量PCR技术已广泛应用于各种病毒的检测，如呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒等，但还未见TaqMan探针法荧光定量PCR应用于大黄鱼虹彩病毒检测的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可特异性检测大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法。

本发明所述大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒设有盒体、裂解液、吸附液、洗涤液、荧光定量PCR反应液、阳性对照和阴性对照。

所述大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒的制备方法如下：

1）制备盒体；

2）配制检测试剂：

裂解液：终浓度5mol/L盐酸胍，0.1mol/L EDTA，去离子水定容至1L，pH为8.0；

吸附液：由玻璃粉、浓硝酸与水组成，其中玻璃粉、浓硝酸与水的配比为1g：（5~6）mL：（10~12）mL，其中玻璃粉以质量计算，浓硝酸和水以体积计算，所述浓硝酸的质量分数可为55%~70%；

洗涤液：终浓度0.1mol/L 氯化钠，1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，去离子水定容至1L，pH为7.5，再加入等体积的无水乙醇；

荧光定量PCR反应液：每19 μL中包含2×定量PCR预混液10μL（TaKaRa Premix Ex Taq(probe PCR）），正向引物F 0.4 μL，反向引物R 0.4 μL，6-FAM和BHQ1两端荧光标记的探针Q0.8 μL，双蒸水7.4 μL；

阴性对照：灭菌超纯水；

阳性对照：重组质粒pMD18-T-LYCIV-Laminin-like。

3）将裂解液2、吸附液3、洗涤液4、操作说明书5、荧光定量PCR反应液6、阴性对照7、阳性对照8，置入盒体1内（参见图1），即得大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒。

在步骤2）中，所述阳性对照的制备方法为：

（1）引物设计，具体方法为：

根据已公开的大黄鱼虹彩病毒基因组序列（GenBank登录号AY779031），采用PrimerPremier 5设计能特异性鉴别大黄鱼虹彩病毒的正向引物F和反向引物R：

正向引物F（SEQID NO: 1）5’-CGCTTGACCAAACAATCTTC-3’

反向引物R（SEQID NO: 2）5’-ATGAGCAATGGCGACCC-3’

（2）重组质粒pMD18-T-LYCIV-Laminin-like的构建步骤为：

使用本发明设计的大黄鱼虹彩病毒Laminin-like基因引物，以大黄鱼虹彩病毒检测阳性的大黄鱼内脏组织样品DNA为模板，经过PCR反应，获得一段152 bp的Laminin-like基因片段（SEQID NO:3），然后将PCR产物电泳目的条带使用Gel Extraction Kit（OMEGA，USA）切胶回收并连接到pMD18-T载体（TaKaRa, Dalian, China）上，转化至Trans1-T1 PhageResistant化学感受态细胞（TransGen Biotech，China）中，筛选阳性克隆并测序验证；

Laminin-like基因片段序列如下：

cgcttgacca aacaatcttc acatccgtct ctcgaggtac cccgcagctg agggtggtcgtctggttgtc gatttccagg ttatagaagg tggtggcgtg agtacacgcc acagtcagca acagaagaagtagcagggtc gccattgctc at。

（3）阳性对照的制备

提取构建好的pMD18-T-LYCIV-Laminin-like质粒，用分光光度计检测质粒的质量和浓度，按照如下公式计算出目的基因的拷贝数，然后用灭菌超纯水稀释成浓度为1×10⁸拷贝/μL，即为阳性对照。将该浓度质粒继续做10倍系列稀释，得1×10⁷-1×10²拷贝/μL质粒，用于制作标准曲线。

。

在步骤2）中，所述荧光定量PCR反应液中的荧光探针Q序列如下：

荧光探针Q（SEQID NO: 4）5’-CTTCTTCTGTTGCTGACTGTGGCGTGTACTC-3’

荧光探针Q（SEQID NO: 4）5’端标记6-FAM荧光基团，荧光探针3’端标记能够淬灭荧光基团所发射荧光信号的淬灭基团BHQ1。

本发明所述大黄鱼虹彩病毒的检测方法包括以下步骤：

1）选取待测样品，加入裂解液进行裂解；第1次离心，收集上清，加吸附液，混匀，静置后，第2次离心，收集沉淀物，用洗涤液洗涤沉淀物后，再第3次离心，再收集沉淀物，加水充分悬浮沉淀物，即得PCR模板；

2）将步骤1）所得PCR模板1 μL加入PCR反应液中进行荧光定量PCR反应，设立阳性对照和阴性对照，PCR反应的程序为：95 ℃ 25 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，收集荧光信号，45个循环；

3）PCR反应结束后，分析可视化荧光定量分析软件中扩增曲线，以标准曲线中Ct值大小判断病毒的有无。阴性对照应无Ct值，阳性对照Ct值 < 35，且出现S型典型扩增曲线。待测样品Ct值 ≤ 35且出现典型扩增曲线，可判定为阳性；若待测样品无扩增曲线，或Ct值 >35，可判定为阴性。

在步骤1）中，所述第1次离心可为12,000 rpm，第1次离心时间可为3 min;所述静置时间可为5 min，静置期间摇匀1-3次；所述第2次离心可为10,000 rpm，第2次离心时间可为15 s；第3次离心可为10,000 rpm，第3次离心时间可为30 s。

本发明以大黄鱼虹彩病毒LYCIV中的Laminin-like保守区序列作为扩增靶序列，设计合成了一对特异性引物及对应的TaqMan探针，建立了LYCIV TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法，并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒，经试用，该试剂盒的检测灵敏度为100拷贝/μL，模板制备时间约30 min，半个工作日即可得到准确的结果，无非特异性扩增，适用于LYCIV感染的苗种、成鱼的检疫，及水质环境的监测。

附图说明

图1是大黄鱼虹彩病毒（LYCIV）TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒横截面剖视图（即盒内设置的组成及位置示意图）。在图1中，各标记为：1：盒体、2：裂解液、3：吸附液、4：洗涤液、5：操作说明书、6：荧光定量PCR反应液、7：阴性对照、8：阳性对照。

图2为实施例2利用LYCIV的Laminin-like基因引物和探针进行的特异性检测的扩增曲线，可见除了在构建的质粒标准品中形成“S”型扩增曲线，在同科蛙病毒（TFV）和同属传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）中均未能扩增，在正常鱼组织中亦未能扩增。

图3为实施例2利用LYCIV的Laminin-like基因引物和探针进行的灵敏度检测的标准曲线， R²为标准曲线相关系数，Eff%为基因扩增效率。每个质粒模板加样5 μL，故从左到右检测浓度依次为5×10²、5×10³、5×10⁴、5×10⁵、5×10⁶、5×10⁷、5×10⁸，即灵敏度为100拷贝/μL。

图4为实施例4初步应用批量检测大黄鱼虹彩病毒的标准曲线。黑色为标准品，灰色为具有大黄鱼虹彩病毒疑似症状的样本及对应模板的10-1,000倍稀释的待检样本，R²为标准曲线相关系数，Eff%为基因扩增效率。

具体实施方式

实施例1 pMD18-T-LYCIV-Laminin-like质粒构建

1）从获取到的样品中提取病毒模板：取约15 mg（1/2米粒大小）样品，滴入10滴裂解液（约300 μL）并用牙签掏碎；12,000 rpm离心3 min，将上清液转至新管，加入20 μL吸附液并混匀；室温放置5 min后，10,000 rpm离心15 s，弃上清，滴入10滴洗涤液于沉淀中，并使沉淀充分悬浮；10,000 rpm离心30s，去上清；加20 μL无菌水，充分悬浮沉淀；10,000 rpm离心30 s，吸取上清液2 μL用于PCR实验。

2）引物设计和质粒构建

（1）结合生物信息学手段，对细胞肿大病毒属病毒的基因组序列进行分析，确定了以LYCIV-Laminin-like基因保守区序列作为扩增靶序列，并设计了一对特异性引物，其序列为：

正向引物F（SEQID NO: 1）5’-CGCTTGACCAAACAATCTTC-3’

反向引物R（SEQID NO: 2）5’-ATGAGCAATGGCGACCC-3’

（2）PCR扩增，使用如下体系进行PCR：

2×PCR预混液 25 μL

正向引物F 1 μL

反向引物R 1 μL

组织DNA模板 2 μL

灭菌超纯水 21μL

PCR反应程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32个循环；72 ℃5 min。

（3）扩增后的PCR产物，经胶回收后连接至pMD18-T载体，构建pMD18-T-LYCIV-Laminin-like质粒，并经测序进行序列验证。

实施例2 特异性及灵敏度检测

1）特异性检测

分别用pMD18-T-LYCIV-Laminin-like质粒，传染性脾肾坏死病毒模板，蛙病毒模板，正常大黄鱼肾组织模板按TaqMan探针法荧光定量PCR反应体系进行PCR扩增，分析可视化荧光定量分析软件中扩增曲线，并依据标准曲线中检测样品所对应的Ct值大小判断病毒有无。实验结果（参见图2）说明该TaqMan探针法荧光定量PCR能特异性检测大黄鱼虹彩病毒，同时未能检出同科蛙病毒（TFV）和同属传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）。

2）灵敏度检测

将阳性对照质粒及10倍系列稀释质粒，即浓度1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝数/μL作为TaqMan探针法荧光定量PCR模板，每个浓度模板取5μL用于标准曲线的构建，并在荧光定量PCR仪上进行扩增。实验结果（参见图3）说明每个反应管内的荧光信号达到阈值所需的循环数（Ct）和起始模板拷贝数的对数存在明显的线性关系（R²=0.996）,检测的最小模板浓度为100拷贝/μL。

实施例3 所述大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法

通过上述一系列试验最后确定一种简单快速的检测方法，从制备模板到检测出结果仅需半个工作日。

1）检测试剂配制：

裂解液：终浓度5 mol/L盐酸胍，0.1 mol/L EDTA，去离子水定容至1 L，pH为8.0。

吸附液：将玻璃粉、浓硝酸与水按1g：（5-6）mL：（10-12）mL的比例配制吸附液，其中玻璃粉以质量计算，浓硝酸和水以体积计算，所述浓硝酸的质量分数可为55%-70%。

洗涤液：终浓度0.1 mol/L 氯化钠，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCl，去离子水定容至1 L，pH为7.5，再加入等体积的无水乙醇，摇匀。

荧光定量PCR反应液：每19 μL中包含2×定量PCR预混液10μL，正向引物F 0.4μL，反向引物R 0.4μL，荧光探针Q 0.8 μL，双蒸水7.4 μL。

阳性对照：含有pMD18-T-LYCIV-Laminin-like的质粒溶液。

阴性对照：无菌水。

灭菌牙签，灭菌后烘干。

2）主要仪器及耗材

荧光定量PCR仪，台式高速离心机，涡旋震荡器，移液枪，0.5 mL离心管，1.5 mL离心管，200 μL PCR管，灭菌枪头，不锈钢镊子，一次性滴管，一次性手套。

3）检测步骤

1. 待测样品的选取：约15 mg（约1/2米粒大小）样品。

2. 将取得的样品置于1.5 mL离心管内，滴入10滴裂解液，用牙签捣碎（约1-2min）。

3. 12,000 rpm离心3 min，将上清转移至新管内，加20 μL吸附液（内含白色物质，用前充分摇匀），混匀后室温静置5 min，期间摇匀3次。

4. 10,000 rpm离心15 s，弃上清，再离心3 s，用移液枪吸干残余液体，滴入10滴洗涤液于沉淀中，用移液枪轻轻搅动至沉淀充分悬浮起来。

5. 10,000 rpm离心30 s，弃上清，再离心3 s，用移液枪吸干残余液体，将沉淀置于PCR仪中60℃烘3 min（打开离心管盖）。

6. 加20 μL蒸馏水，充分悬浮沉淀，10,000 rpm离心30 s，吸取上清1 μL于PCR反应管（内含19 μL荧光定量PCR反应液），用涡旋震荡器混匀，5,000 rpm离心3 s，即可上机检测。阳性对照和阴性对照不需处理，直接取1 μL于反应管做荧光定量PCR即可。PCR反应的程序为：95 ℃ 25 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，收集荧光信号，45个循环。

7. PCR反应结束后，分析可视化荧光定量分析软件中扩增曲线，以标准曲线中Ct值大小判断病毒的有无。阴性对照应无Ct值，阳性对照Ct值 < 35，且出现S型典型扩增曲线。待测样品Ct值 ≤ 35且出现典型扩增曲线，可判定为阳性；若待测样品无扩增曲线，或Ct值 > 35，可判定为阴性。

实施例4应用大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测LYCIV

对大黄鱼虹彩病毒高发期，海水网箱养殖的具有疑似症状的大黄鱼进行TaqMan探针法荧光定量PCR检测，并将每个样品所提DNA进行10倍系列稀释3个梯度作模板，上机进行探针法荧光定量PCR，图4为初步应用批量检测大黄鱼虹彩病毒的标准曲线。黑色为标准品，灰色为具有大黄鱼虹彩病毒疑似症状的样本及对应模板的10-1,000倍稀释的待检样本，R²为标准曲线相关系数，R²=0.995，Eff%为基因扩增效率，Eff%为115.725。结果说明养殖中发病大黄鱼虹彩病毒的病毒量至少约为10⁵拷贝/μL，本发明所建立方法可以满足生产上大黄鱼虹彩病毒的病原检疫需要，对常规提取DNA，再稀释100-1,000倍亦可以成功检出大黄鱼虹彩病毒。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgcttgacca aacaatcttc 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagcaatg gcgaccc 17

<210> 3

<211> 152

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcttgacca aacaatcttc acatccgtct ctcgaggtac cccgcagctg agggtggtcg 60

tctggttgtc gatttccagg ttatagaagg tggtggcgtg agtacacgcc acagtcagca 120

acagaagaag tagcagggtc gccattgctc at 152

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttcttctgt tgctgactgt ggcgtgtact c 31

Claims

1.一种大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性鉴别大黄鱼虹彩病毒的引物和荧光探针，其序列如下：

正向引物F：5’-CGCTTGACCAAACAATCTTC-3’；

反向引物R：5’-ATGAGCAATGGCGACCC-3’；

荧光探针Q：5’-CTTCTTCTGTTGCTGACTGTGGCGTGTACTC-3’；

所述荧光探针Q的5’端标记6-FAM荧光基团，3’端标记能够淬灭荧光基团所发射荧光信号的淬灭基团BHQ1。

2.一种如权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）制备盒体；

2）配制检测试剂：

吸附液：由玻璃粉、浓硝酸与水组成，其中玻璃粉、浓硝酸与水的配比为1g：5~6 mL：10~12mL，所述浓硝酸的质量分数为55~70%；

荧光定量PCR反应液：每19 μL中包含2×定量PCR预混液10μL，正向引物F 0.4 μL，反向引物R 0.4 μL，荧光探针Q 0.8 μL，双蒸水7.4 μL；

阴性对照：灭菌超纯水；

阳性对照：重组质粒pMD18-T-LYCIV-Laminin-like；

3）将裂解液、吸附液、洗涤液、操作说明书、荧光定量PCR反应液、阴性对照、阳性对照，置入盒体内，即得大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2）所述阳性对照的制备方法为：

（1）引物设计，具体方法为：

根据已公开的大黄鱼虹彩病毒基因组序列，采用Primer Premier 5设计能特异性鉴别大黄鱼虹彩病毒的正向引物F和反向引物R：

正向引物F：5’-CGCTTGACCAAACAATCTTC-3’；

反向引物R：5’-ATGAGCAATGGCGACCC-3’；

（2）重组质粒pMD18-T-LYCIV-Laminin-like的构建步骤为：

使用Laminin-like基因引物，以大黄鱼虹彩病毒检测阳性的大黄鱼内脏组织样品DNA为模板，经过PCR反应，获得一段152 bp的Laminin-like基因片段，然后将PCR产物电泳目的条带使用Gel Extraction Kit切胶回收并连接到pMD18-T载体上，转化至Trans1-T1 PhageResistant化学感受态细胞中，筛选阳性克隆并测序验证；

（3）阳性对照的制备

提取构建好的pMD18-T-LYCIV-Laminin-like质粒，用分光光度计检测质粒的质量和浓度，按照如下公式计算出目的基因的拷贝数，然后用灭菌超纯水稀释成浓度为1×10⁸拷贝/μL，即为阳性对照；将该浓度质粒继续做10倍系列稀释，得1×10⁷-1×10²拷贝/μL质粒，用于制作标准曲线：

。

4.一种利用权利要求1所述试剂盒判定大黄鱼虹彩病毒的方法，其特征在于，以标准曲线中Ct值大小判断病毒的有无，阴性对照无Ct值，阳性对照Ct值 < 35，且出现S型典型扩增曲线，待测样品Ct值 ≤ 35且出现典型扩增曲线，可判定为阳性；若待测样品无扩增曲线，或Ct值 > 35，可判定为阴性。