CN101948937A - 流行性造血器官坏死病毒的pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒及检测方法。涉及病毒的检测方法，提供一种特异性高，简便快捷的针对流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒及检测方法。流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒包括：裂解液，吸附液，洗涤液，PCR反应液，阳性对照，阴性对照。检测方法包括：PCR模板制备，PCR反应，PCR产物检测。该试剂盒的检测灵敏度相当于31个病毒粒子，模板制备时间约30min，半个工作日即可得到准确的结果，无非特异性扩增带，适用于EHNV病毒感染的苗种和水产品的检疫及水质环境的监测。

Description

流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及病毒的检测方法，特别涉及流行性造血器官坏死病毒(Epizootic hematopoieticnecrosis virus，EHNV)的PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

近年来，由病毒引起的水产动物病害给水产养殖业造成了重大的经济损失。随着经济的全球化，世界各地水产贸易日益增加，病毒的传播也逐渐蔓延开来，病毒造成的病害已经成为影响世界水产养殖业发展的严重问题(1.Munn CB.Viruses as pathogens of marineorganisms--from bacteria to whales.J Mar Biol Assoc UK，2006，86(3)：453-467)。其中虹彩病毒的危害比较严重，危害分布范围较为广泛，并且鱼类一旦同时感染虹彩病毒和寄生虫，致死率可达90％以上(2.萧枫，张奇亚.水生动物虹彩病毒的分子生物学.水生生物学报，2004，28(2)：202-206)。

流行性造血器官坏死病毒(Epizootic hematopoietic necrosis virus，EHNV)是虹彩病毒科蛙病毒属的成员，能引起河鲈(Perca fluviatilis)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)等多种鱼类的幼鱼和成鱼出现内脏坏死以至死亡(3.World organisation for animal health(OIE).Manual ofDiagnostic Tests for Aquatic Animals 2009.OIE，Paris，France.2009，168-187；4.Langdon JS，Humphrey JD.Epizootic Hematopoietic Necrosis a New Viral Disease in Redfin Perch Percafluviatilis L.in Australia.J.Fish Dis.，1987，10(4)：289-298；5.Langdon JS.Experimentaltransmission and pathogenicity of epizootic haematopoietic necrosis virus(EHNV)in redfin perch，Perca fluviatilis L.，and 11 other teleosts.J.Fish Dis.，1989，12(4)：295-310；6.Reddacliff LA，Whittington RJ.Pathology of epizootic haematopoietic necrosis virus(EHNV)infection in rainbowtrout(Oncorhynchus mykiss Walbaum)and redfin perch(Perca fluviatilis L).J Comp Pathol，1996，115(2)：103-115)。对于EHNV尚无特效药，病毒的早期检测和诊断仍是最重要的防治手段。

目前，常用的诊断方法有电镜观察、ELISA和PCR后酶切等(7.Hyatt AD，Eaton BT，Hengstberger S.Epizootic hematopoietic necrosis virus：detection by ELISA，immunohistochemistry and electron microscopy.J Fish Dis，1991，14，605-617；8.Marsh IB，Whittington RJ，O′Rourke B，Hyattc AD and Chisholm O.Rapid differentiation of Australian，European and American ranaviruses based on variation in major capsid protein gene sequence.MolCell Probes，2002，16(2)：137-151.)，但电镜观察和PCR后酶切均较为繁琐，ELISA难以区分EHNV和蛙病毒属的其他成员，因此急需一种特异性高，简便快捷的针对EHNV的检测手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性高，简便快捷的流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种流行性造血器官坏死病毒的检测方法。

本发明所述流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒设有盒体、裂解液、吸附液、洗涤液、PCR反应液、阳性对照和阴性对照。

所述裂解液的配方为：5mol/L盐酸胍，0.1mol/L EDTA，去离子水定容至1L，pH为8.0。

所述吸附液的组成为玻璃粉、浓硝酸与水，所述玻璃粉、浓硝酸与水的配比为1g∶(5～6)mL∶(10～12)mL，其中玻璃粉以质量计算，浓硝酸和水以体积计算，所述浓硝酸的质量分数可为55％～70％。

所述洗涤液的组成为：0.1mol/L氯化钠，1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，去离子水定容至1L，pH为7.5，再加入等体积的无水乙醇。

所述PCR反应液的配方为：每23μL中包含10×PCR缓冲液2.5μL，正向引物P1 0.5μL，反向引物P2 0.5μL，dNTP2μL，Taq酶0.25μL，双蒸水17.75μL；所述正向引物P1和反向引物P2的序列为：

正向引物P1：5’-CAGCTGGGAGACAACGGCACA-3’；

反向引物P2：5’-ACGAATTCGAGCTCGGTACC-3’。

所述PCR缓冲液可采用常规PCR缓冲液。

所述阳性对照可为含有pMD18-T-EHNV-MCP质粒的溶液；所述阴性对照可为无菌水。

本发明所述流行性造血器官坏死病毒的检测方法包括以下步骤：

1)选取待测样品，加入裂解液进行裂解；第1次离心，收集上清，加吸附液，混匀，静置后，第2次离心，收集沉淀物，用洗涤液洗涤沉淀物后，再第3次离心，再收集沉淀物，加水充分悬浮沉淀物，即得PCR模板；

2)将步骤1)所得PCR模板加入PCR反应液中进行PCR反应，设立阳性对照和阴性对照，PCR反应的程序为：95℃ 3min；94℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min；

3)PCR反应结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察，阳性对照应有一条195bp条带，阴性对照在195bp条带平行位置应无条带；若样品在该平行位置有195bp条带，则表明该样品含有病毒，若无195bp条带，则无病毒。

在步骤1)中，所述第1次离心可为12000rpm，第1次离心时间可为3min；所述静置的时间可为5min，静置期间可摇匀1～3次；所述第2次离心可为10000rpm，第2次离心的时间可为15s；所述第3次离心可为10000rpm，第3次离心的时间可为30s。

本发明以虹彩病毒EHNV中的主衣壳蛋白基因(MCP)保守区序列作为扩增靶序列，设计合成了一对特异性引物，通过改进PCR模板的制备方法和优化扩增条件，建立了EHNV病毒PCR快速检测技术，并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒，经试验，该试剂盒的检测灵敏度相当于31个病毒粒子，模板制备时间约30min，半个工作日即可得到准确的结果，无非特异性扩增带，适用于EHNV病毒感染的苗种和水产品的检疫及水质环境的监测。

附图说明

图1为特异性试验PCR电泳图。在图1中，1为DNA Marker DL 2000；2为pMD18-T-EHNV-MCP质粒加入肾组织后提取的模板；3和8为pMD18-T-EHNV-MCP质粒；4为LYCIV病毒质粒；5为正常肾组织；6为正常脾组织；7和10为空白对照；9为蛙虹彩病毒基因组模板。该PCR检测方法设计的引物能特异性检测EHNV，并且能与同属的蛙虹彩病毒区分开，特异性较好。

图2为PCR检测大黄鱼虹彩病毒EHNV质粒的灵敏性试验。1为DNA Marker DL 2000；2～10分别为10ng、1ng、1×10^-1ng、1×10^-2ng、1×10^-3ng、1×10-^-4ng、1×10^-5ng、1×10^-6ng、1×10^-7ng阳性质粒为模板的扩增结果；该PCR检测方法的灵敏度较高，最小检测限度达到了1×10^-7ng阳性质粒，相当于31个病毒粒子。

图3为模板提取的效果性实验检测。1为DNA Marker DL 2000；2为pMD18-T-EHNV-MCP质粒；3为pMD18-T-EHNV-MCP质粒加入肾组织后重新提取；4为pMD18-T-EHNV-MCP质粒加入脾组织后重新提取；5为正常肾组织；6为正常脾组织；7为无模板空白对照。从含有pMD18-T-EHNV-MCP质粒的鱼组织中提取DNA检测时，能有效地检测到pMD18-T-EHNV-MCP质粒，模板提取效率比较高，同理可知，该PCR检测方法能检测到感染了EHNV的鱼。

具体实施方式

实施例1  pMD-18T-EHNV-MCP质粒构建

1)从病鱼组织中提取病毒模板：取约15mg(1/2米粒大小)鱼组织或组织悬浮液300μL，滴入10滴裂解液(约300μL)并用牙签掏碎；12000r/min离心3min，将上清液转至新管，加入20μL吸附液并混匀；室温放置5min后，10000r/min离心15s，弃上清，滴入10滴洗涤液于沉淀中，并使沉淀充分悬浮；10000r/min离心30s，去上清；加20μL的无菌水，充分悬浮沉淀；10000r/min离心30s，吸取上清液2μL用于PCR实验。

2)引物设计和质粒构建

(1)结合生物信息学手段，对蛙病毒属病毒的基因组序列进行分析，确定了以EHNV主衣壳蛋白基因(MCP)保守区序列作为扩增靶序列，并设计了EHNV特异性的一对引物，其序列为：

正向引物P1：5’-CAGCTGGGAGACAACGGCACA-3’；

反向引物P2：5’-ACGAATTCGAGCTCGGTACC-3’。

该引物的特异性在于其序列和同属的蛙虹彩病毒主衣壳蛋白基因保守区序列只在正向引物P1最末端一个碱基的差异，并由此将与其同源性很高的蛙虹彩病毒区分开。

(2)PCR扩增，使用如下体系进行PCR：

10×PCR缓冲液     2.5μL；

正向引物P1        0.5μL；

反向引物P2        0.5μL；

dNTP              2μL；

组织DNA模板       1.5μL；

Taq酶             0.25μL；

双蒸水            17.75μL。

PCR反应的程序为：95℃ 3min；94℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min。

(3)扩增后的PCR产物，经胶回收后连接至pMD18-T载体中，构建了pMD18-T-EHNV-MCP质粒，并经测序进行序列的验证。

实施例2  敏感性及特异性检测

1)特异性检测

分别用含pMD18-T-EHNV-MCP质粒的大黄鱼肾组织提取的模板，pMD18-T-EHNV-MCP质粒，含大黄鱼虹彩病毒(LYCIV)主衣壳蛋白序列的质粒，正常大黄鱼肾组织模板，正常大黄鱼脾组织模板，蛙虹彩病毒模板按上述反应体系进行PCR扩增，取7.5μL反应液在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳观察。实验结果(参见图1)说明该PCR检测方法设计的引物能特异性检测EHNV，并且能与同属的蛙虹彩病毒区分开，特异性比较好。

2)敏感性试验

将pMD18-T-EHNV-MCP质粒分别稀释成10ng、1ng、1×10^-1ng、1×10^-2ng，、1×10^-3ng、1×10^-4ng、1×10^-5ng，、1×10^-6ng、1×10^-7ng、10^-8ng进行PCR扩增，取7.5μL反应液在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳观察。实验结果(参见图2)表明该PCR检测方法的灵敏度较高，最小检测限度达到了1×10^-7ng阳性质粒，相当于31个病毒粒子。

实施例3  模板提取的效果试验

分别用pMD18-T-EHNV-MCP质粒与大黄鱼正常的肾或脾组织混合后重新提取出EHNV病毒质粒，正常肾组织模板，正常脾组织模板，按上述反应体系进行PCR扩增，通过PCR扩增的条带进行对比。实验结果表明表明从含有pMD18-T-EHNV-MCP质粒的鱼组织中提取DNA检测时，能很有效的检测到pMD18-T-EHNV-MCP质粒，模板提取效率比较高，同理可知，该PCR检测方法能检测到感染了EHNV的鱼。

实施例4  所述流行性造血器官坏死病毒的检测方法

通过上述一系列试验最后确定一种快速简单的检测方法，从制备模板到检测出结果只需半个工作日。

1)检测试剂配制：

裂解液：5mol/L盐酸胍，0.1mol/LEDTA，去离子水定容至1L，pH为8.0。

吸附液：将玻璃粉、浓硝酸与水按照1g∶(5～6)mL∶(10～12)mL的比例配置吸附液，其中玻璃粉以质量计算，浓硝酸和水以体积计算，所述浓硝酸的质量分数为55％～70％。

洗涤液：0.1mol/L氯化钠，1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，去离子水定容至1L，pH为pH7.5，再加入等体积的无水乙醇，摇匀。

50×TAE电泳缓冲液。

PCR反应液：每23μL包含10×PCR buffer 2.5μL，正向引物P10.5μL，反向引物P20.5μL，dNTP 2μL，Taq酶0.25μL，双蒸水17.75μL。

阳性对照：含有pMD 18-T-EHNV-MCP质粒溶液。

阴性对照：无菌水。

灭菌牙签，灭菌后烘干。

2)主要仪器及耗材

PCR扩增仪，台式高速离心机，微型混合仪，加样枪，电泳仪，电泳槽，紫外检测灯，0.5ml离心管，200μL加样枪头，不锈钢镊子，一次性手套，琼脂糖粉。

3)检测步骤

1.待测样品的选取：约15ml(约1/2米粒大小)鱼或其他鱼池生物组织。鱼苗可整只用于检测，成鱼可用镊子取其脾、肾或腮等组织。

2.将取得的鱼组织至于1.5ml小管内，滴入10滴裂解液，用牙签捣碎(约1～2min)。

3.12000r/min离心3min，将上清转移至新管内，加20μL吸附液(内含白色物质，用前充分摇匀！)，混匀。室温放置5min，期间摇匀3次。

4.10000r/min离心15s，弃上清，再离心3s，用加样枪吸干残余液体，滴入10滴洗涤液于沉淀中，用加样枪轻轻搅动是沉淀充分悬浮起来。

5.10000r/min离心30s，弃上清，再离心3s，用加样枪吸干残余液体，将沉淀至于PCR仪上60℃烘3min(打开离心管盖)。

6.加20μL蒸馏水，充分悬浮沉淀，10000r/min离心30s，吸取上清2μL于反应管中(内含23μL PCR反应液)，用混合器混匀，5000r/min离心3s，即可做PCR反应。阳性对照和阴性对照不需处理，直接取2μL于反应管中做PCR即可。PCR程序为：95℃ 3min；94℃ 30s，61℃30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min。

7.PCR反应完毕，取10μL反应液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测，时间20～30min。紫外灯下观察，阳性对照应有一条195bp的清晰条带；阴性对照在此平行位置应无条带；若样品在该平行位置有条带，则表明该样品含有病毒，若无条带，则无病毒。

Claims (10)

1.流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于设有盒体、裂解液、吸附液、洗涤液、PCR反应液、阳性对照和阴性对照。

2.如权利要求1所述流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于所述裂解液的配方为：5mol/L盐酸胍，0.1mol/LEDTA，去离子水定容至1L，pH为8.0。

3.如权利要求1所述流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于所述吸附液的组成为玻璃粉、浓硝酸与水，所述玻璃粉、浓硝酸与水的配比为1g∶(5～6)mL∶(10～12)mL，其中玻璃粉以质量计算，浓硝酸和水以体积计算，所述浓硝酸的质量分数可为55％～70％。

4.如权利要求1所述流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于所述洗涤液的组成为：0.1mol/L氯化钠，1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，去离子水定容至1L，pH为7.5，再加入等体积的无水乙醇。

5.如权利要求1所述流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于所述PCR反应液的配方为：每23μL中包含10×PCR缓冲液2.5μL，正向引物P1 0.5μL，反向引物P20.5μL，dNTP 2μL，Taq酶0.25μL，双蒸水17.75μL；所述正向引物P1和反向引物P2的序列为：

正向引物P1：5’-CAGCTGGGAGACAACGGCACA-3’；

反向引物P2：5’-ACGAATTCGAGCTCGGTACC-3’。

6.如权利要求1所述流行性造血器官坏死病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照为含有pMD18-T-EHNV-MCP质粒的溶液；所述阴性对照为无菌水。

7.流行性造血器官坏死病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)选取待测样品，加入裂解液进行裂解；第1次离心，收集上清，加吸附液，混匀，静置后，第2次离心，收集沉淀物，用洗涤液洗涤沉淀物后，再第3次离心，再收集沉淀物，加水充分悬浮沉淀物，即得PCR模板；

2)将步骤1)所得PCR模板加入PCR反应液中进行PCR反应，设立阳性对照和阴性对照，PCR反应的程序为：95℃ 3min；94℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min；

3)PCR反应结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察，阳性对照应有一条195bp条带，阴性对照在195bp条带平行位置应无条带；若样品在该平行位置有195bp条带，则表明该样品含有病毒，若无195bp条带，则无病毒。

8.如权利要求7所述的流行性造血器官坏死病毒的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述第1次离心为12000rpm，第1次离心时间为3min；所述静置的时间为5min，静置期间摇匀1～3次。

9.如权利要求7所述的流行性造血器官坏死病毒的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述第2次离心为10000rpm，第2次离心的时间为15s。

10.如权利要求7所述的流行性造血器官坏死病毒的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述第3次离心为10000rpm，第3次离心的时间为30s。

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