CN103160620B - 用于检测传染性造血器官坏死病病毒的特异性引物 - Google Patents

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用于检测传染性造血器官坏死病病毒的特异性引物，它涉及传染性造血器官坏死病病毒的特异性引物。它要解决现有的检查传染性造血器官坏死病毒的PCR方法存在敏感性不高的问题。方法：一、设计特异性引物IHNV-Lf和IHNV-Lr；二、待检测病料处理后得组织滤液；三、制备IHNV的RNA；四、PCR扩增得扩增产物；五、PCR扩增产物观察，确定结果即完成。本发明具有很好的特异性，不与VHSV存在交叉反应；本发明以聚合酶蛋白作为检测目标，利用特异性引物IHNV-Lf和IHNV-Lr进行的检测，操作简单，准确度高、灵敏且低浓度下敏感性很好，检测成本相对较低，与现有巢式PCR（2轮PCR）相比更节省时间。

Description

用于检测传染性造血器官坏死病病毒的特异性引物
技术领域
本发明涉及传染性造血器官坏死病病毒的特异性引物。
背景技术
传染性造血器官坏死病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV），属弹状病毒科（Rhabdoviridae），诺拉弹状病毒属（Novirhabdovirus），IHNV是该属代表种。IHNV病毒粒子形态呈子弹状，有囊膜包被，对热、酸、乙醚不稳定。IHNV病毒粒子含有一条线状、反义、单链的RNA，其基因组结构从3′端至5′端依次包含N-P（M1）-M2-G-NV-L六个基因，分别编码病毒核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白、非结构蛋白和聚合酶蛋白，现基因组测序表明IHNV基因组全长约为11kb。
传染性造血器官坏死病（IHN）是一种鱼类急性全身性传染病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须申报的动物疫病，为我国的二类疫病。IHNV主要危害鲑鳟鱼类的鱼苗及当年幼鱼，并且伴随着基因变异，IHN的宿主在不断的扩大，更多种类的冷水鱼将受到威胁。流行病学调查显示IHNV的大规模爆发造成的虹鳟大鱼死亡率约为20-35%，鱼苗阶段死亡率可高达100%。我国是一个渔业大国，鲑鳟鱼类作为一种大型经济鱼类，在我国水产养殖中占相当重要的地位。随着进出口贸易的增加，IHN也被带入了我国，1990年，辽宁本溪首次报道了IHN在我国爆发。IHN发病高峰期造成了鲑鳟鱼鱼苗阶段的大规模死亡（高达100%），使我国鲑鳟鱼产量急剧下降。IHN已经发展成为制约我国冷水鱼养殖健康可持续发展的关键因素。目前我国尚没有有效的预防和治疗IHN的疫苗与药物问世，为了保护水产养殖业健康发展，需要对流通的鲑鳟鱼类进行严格检验避免病毒流入，以及对已发现该病的养殖场进行疫情控制、防止疫情传播恶化。目前IHNV检测方法主要包括核蛋白基因特异性探针原位杂交、免疫组织化学、ELISA方法和核蛋白基因RT-PCR方法等。在这些方法中，PCR被证明是最迅速和最灵敏的方法，但是，研究表明核蛋白基因并不是IHNV基因组中丰度最高的基因，利用其为目标蛋白进行病毒检测不是敏感性最好的方法，容易在病毒含量低的感染早期及后期携带时无法诊断。
发明内容
本发明目的是提供用于检测传染性造血器官坏死病病毒的特异性引物。
传染性造血器官坏死病病毒的高效PCR检测方法，按以下步骤进行：
一、根据Genbank数据库中IHNV聚合酶蛋白的基因序列（登录号：L40883），利用Primer Premier5.0选取聚合酶蛋白的基因保守区段设计一对特异性引物IHNV-Lf和IHNV-Lr；
二、取无传染性造血器官坏死病临床症状鱼的待检测病料，置于小型匀浆器内，于冰上研磨3-5min，然后以3000g离心5min，弃去沉淀，上清液经过0.22μM一次性滤器过滤除菌，获得无菌匀浆上清液，再利用MEM培养基将无菌匀浆上清液进行1000倍稀释，获得组织滤液；
三、培养瓶中EPC细胞传代长成致密单层细胞后，吸弃培养液后，用Hanks液洗涤2次，接入1mL步骤二中所得组织滤液，置于15℃培养箱中吸附1h，吸弃组织液，加入5mL细胞培养维持液，15℃恒温培养，利用倒置显微镜每日观察细胞病变情况，当70%-80%的EPC细胞发生病变崩解后，吸取100μL细胞培养液进行病毒的RNA提取，获得IHNV的RNA；
四、以IHNV的RNA为模板，IHNV-Lf和IHNV-Lr为特异性引物，进行PCR扩增，获得扩增产物；
五、PCR扩增产物经凝胶成像系统观察，若在825bp处有目的片段，则确定结果为阳性，若在825bp处没有目的片段，则确定结果为阴性，即完成传染性造血器官坏死病病毒的高效PCR检测；
其中步骤一中特异性引物的上游引物IHNV-Lf的核苷酸序列：5’-CATAGAAATAAAACAAGAGAGACTC-3’，下游引物IHNV-Lr的核苷酸序列：5’-CCTCGTATTGTGTTTCGGAAATCT-3’；
步骤三中细胞维持液为含有2%FBS的MEM培养基。
本发明传染性造血器官坏死病病毒的高效检测方法具有很好的特异性，不与VHSV（病毒性出血性败血症病毒）存在交叉反应；本发明以聚合酶蛋白作为检测目标，利用特异性引物IHNV-Lf和IHNV-Lr进行的检测，灵敏度高，其最低检测限为102，当病毒核酸数量不小于100个拷贝即可以检测出阳性结果，而现有以核蛋白为检测目的蛋白并利用IHNV-Nf1/IHNV-Nr1和IHNV-Nf2/IHNV-Nr2为引物进行的巢式PCR方法检测，灵敏度低，最低检测限为103，当病毒核酸数量不小于1000个拷贝才可以检测出阳性结果。
本发明传染性造血器官坏死病病毒的高效检测方法，操作简单，准确度高、灵敏且低浓度下敏感性很好，检测成本相对较低，只通过一轮PCR检测就可以检测出不小于102的病毒，与现有巢式PCR（2轮PCR）相比更节省时间。
附图说明
图1为实施例中PCR扩增结果的电泳图，其中M：DL2000marker，泳道1：以IHNV的RNA为模板；
图2为实施例中以聚合酶蛋白为目标基因的PCR检测灵敏度的电泳图，其中M：DL2000marker，N：阴性对照，泳道1-4：104、103、102、101拷贝数病毒粒子；
图3为实施例中以核蛋白为目标基因的PCR检测灵敏度的电泳图，其中M：DL2000marker，N：阴性对照，泳道1-4：104、103、102、101拷贝数病毒粒子；
图4为实施例中以核蛋白为目标基因的巢式PCR检测灵敏度的电泳图，其中M：DL2000marker，102：102拷贝数病毒为模板的巢式PCR产物；
图5为实施例中PCR特异性检测的电泳图，其中M：DL2000marker，N：阴性对照，泳道1:VHSV，2:IHNV。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式传染性造血器官坏死病病毒的高效PCR检测方法，按以下步骤进行：
一、根据Genbank数据库中IHNV聚合酶蛋白的基因序列（登录号：L40883），利用Primer Premier5.0选取IHNV聚合酶蛋白的基因保守区段设计一对特异性引物IHNV-Lf和IHNV-Lr；
二、取无传染性造血器官坏死病临床症状鱼的待检测病料，置于小型匀浆器内，于冰上研磨3-5min，然后以3000g离心5min，弃去沉淀，上清液经过0.22μM一次性滤器过滤除菌，获得无菌匀浆上清液，再利用MEM培养基将无菌匀浆上清液进行1000倍稀释，获得组织滤液；
三、培养瓶中EPC细胞传代长成致密单层细胞后，吸弃培养液后，用Hanks液洗涤2次，接入1mL步骤二中所得组织滤液，置于15℃培养箱中吸附1h，吸弃组织液，加入5mL细胞培养维持液，15℃恒温培养，利用倒置显微镜每日观察细胞病变情况，当70%-80%的EPC细胞发生病变崩解后，吸取100μL细胞培养液进行病毒的RNA提取，获得IHNV的RNA；
四、以IHNV的RNA为模板，IHNV-Lf和IHNV-Lr为特异性引物，进行PCR扩增，获得扩增产物；
五、PCR扩增产物经凝胶成像系统观察，若在825bp处有目的片段，则确定结果为阳性，若在825bp处没有目的片段，则确定结果为阴性，即完成传染性造血器官坏死病病毒的高效PCR检测；
其中步骤一中特异性引物的上游引物IHNV-Lf的核苷酸序列：5’-CATAGAAATAAAACAAGAGAGACTC-3’，下游引物IHNV-Lr的核苷酸序列：5’-CCTCGTATTGTGTTTCGGAAATCT-3’；
步骤三中细胞维持液为含有2%FBS的MEM培养基。
本实施方式中IHNV聚合酶蛋白的基因保守区段的核苷酸序列参见SEQ ID NO：7。
本实施方式中鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）由中国水产科学研究院长江水产研究所鱼病组曾令兵教授惠赠。
本实施方式中涉及的反应试剂盒和DNA Marker购自TaKaRa公司；涉及的引物由哈尔滨博仕生物公司合成。
本实施方式中确定结果为阳性即检查对象感染了传染性造血器官坏死病病毒；确定结果为阴性检查对象没有感染传染性造血器官坏死病病毒。
本实施方式步骤三中吸取100μL细胞培养液进行病毒的RNA提取，获得IHNV的RNA，过程如下：100μL细胞培养液放入无RNA酶的离心管中；10000g离心5min，去除沉淀；加入600μL Trizol裂解液，震荡混匀，10000g离心15min，吸取上清液加入到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，反复颠倒混匀，10000g离心15min，弃尽上清，加入75%的乙醇600μL，颠倒洗涤，10000g离心10min，弃尽上清，4000离心10s，吸干管底的液体，室温干燥3min；加入100μL的无RNA酶水，将RNA沉淀完全溶解，分装于-80℃备用。
对于具有传染性造血器官坏死病临床症状的鱼进行检测，则直接从组织中提取IHNV核酸，采用本实施方式中的PCR方法进行检测。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤四中PCR扩增的反应体系为25μL的反应体系，由下列成分组成：
PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性1min，50℃退火50s，72℃延伸1min，共30个循环，再72℃延伸10min，4℃结束反应。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
实施例：
传染性造血器官坏死病病毒的高效PCR检测方法，按以下步骤进行：
一、根据Genbank数据库中IHNV聚合酶蛋白的基因序列（登录号：L40883），利用Primer Premier5.0选取IHNV聚合酶蛋白的基因保守区段设计一对特异性引物IHNV-Lf和IHNV-Lr；
二、取无传染性造血器官坏死病临床症状鱼的待检测病料，置于小型匀浆器内，于冰上研磨3-5min，然后以3000g离心5min，弃去沉淀，上清液经过0.22μM一次性滤器过滤除菌，获得无菌匀浆上清液，再利用MEM培养基将无菌匀浆上清液进行1000倍稀释，获得组织滤液；
三、培养瓶中EPC细胞传代长成致密单层细胞后，用Hanks液洗涤2次，接入1mL步骤二中所得组织滤液，置于15℃培养箱中吸附1h，吸弃组织液，加入5mL细胞培养维持液，15℃恒温培养，利用倒置显微镜每日观察细胞病变情况，当70%-80%的EPC细胞发生病变崩解后，吸取100μL细胞培养液进行病毒的RNA提取，获得IHNV的RNA；
四、以IHNV的RNA为模板，IHNV-Lf和IHNV-Lr为特异性引物，进行PCR扩增，获得扩增产物；
五、PCR扩增产物经凝胶成像系统观察，若在825bp处有目的片段，则确定结果为阳性，若在825bp处没有目的片段，则确定结果为阴性，即完成传染性造血器官坏死病病毒的高效PCR检测；
其中步骤一中特异性引物的上游引物IHNV-Lf的核苷酸序列：5’-CATAGAAATAAAACAAGAGAGACTC-3’，下游引物IHNV-Lr的核苷酸序列：5’-CCTCGTATTGTGTTTCGGAAATCT-3’；
步骤三中细胞维持液为含有2%FBS的MEM培养基。
本实施例中IHNV聚合酶蛋白的基因保守区段的核苷酸序列参见SEQ ID NO：7。
本实施例中鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）由中国水产科学研究院长江水产研究所鱼病组曾令兵教授惠赠。
本实施例中涉及的反应试剂盒和DNA Marker购自TaKaRa公司。
本实施例步骤四中PCR扩增的反应体系为25μL的反应体系，由下列成分组成：
PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性1min，50℃退火50s，72℃延伸1min，共30个循环，再72℃延伸10min，4℃结束反应。
结果：在的825bp处有目的片段扩增（如图1），则结果为阳性即检查对象感染了传染性造血器官坏死病病毒。
PCR检测灵敏度试验：
采用本实施方式中的方法，分别以104、103、102、101拷贝数病毒粒子（病毒粒子来自毒株IHNV-WRAC（VR-1392），毒株由中国水产科学研究院长江水产研究所鱼病组曾令兵教授惠赠；毒株IHNV-WRAC（VR-1392）已经商品化，可通过购买获得。）的IHNVRNA作为模板，进行PCR扩增。分别取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示随着模板量的减少目的条带逐渐变暗，直至101的拷贝数模板量时目的条带消失（图2），该结果说明该方法的最低检测限为102，当病毒核酸数量不小于100个拷贝即可以检测出阳性结果。
对照实验：现有的以核蛋白为目标基因并利用IHNV-Nf1(5’-CACCGTACTTTGCTGCTAC-3’)和IHNV-Nr1(5’-TCAAGGGGGGAGTCCTCGA-3’)为引物，按照中华人民共和国国家标准-鱼类检疫方法中IHNV检测方法中PCR程序：94℃4min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，72℃8min，进行IHNV病毒核酸的扩增和检测。分别取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示随着模板量的减少目的条带逐渐变暗，直至102的拷贝数模板量时目的条带消失（图3）。以上述102的拷贝数为模板PCR产物为模板进行巢式PCR，所用引物序列为：IHNV-Nf2(5’-GCGCACAGTGCCTTGGCT-3’)和IHNV-Nr2(5’-TTCGCAGATCCCAACAAC AA-3’)。按照上述程序进行IHNV病毒核酸的扩增和检测。取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示未见目的条带出现(图4)。该结果说明该方法的最低检测限为103，当病毒核酸数量不小于1000个拷贝才可以检测出阳性结果。
PCR检测特异性试验：
分别以105拷贝数病毒粒子的VHSV和IHNV RNA为模板，利用IHNV-Lf/IHNV-Lr为引物，进行PCR扩增反应。分别取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示以IHNV为模板的扩增体系于目的条带大小位置出现单一清晰条带，而以VHSV为模板的扩增体系未见任何条带（图5）。该结果说明检测方法具有很好的特异性，不与VHSV存在交叉反应。

Claims (1)

1.用于检测传染性造血器官坏死病病毒的特异性引物，其特征在于特异性引物的上游引物IHNV-Lf的核苷酸序列：5’-CATAGAAATAAAACAAGAGAGACTC-3’，下游引物IHNV-Lr的核苷酸序列：5’-CCTCGTATTGTGTTTCGGAAATCT-3’。
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