CN103525951A - 用于检测传染性造血器官坏死病毒的lamp引物及应用 - Google Patents

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CN103525951A CN201310506902.8A CN201310506902A CN103525951A CN 103525951 A CN103525951 A CN 103525951A CN 201310506902 A CN201310506902 A CN 201310506902A CN 103525951 A CN103525951 A CN 103525951A
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Abstract

本发明公开了一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的LAMP引物及应用。本发明所提供的引物为引物组，由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本发明利用以上引物，通过在反应液加入SYBR Green I荧光染料，建立了IHNV RT-LAMP可视化检测方法，且该方法灵敏度高、特异性好、成本低、不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，这对鲑鳟鱼鱼苗的引种、无特定病原体种鱼的培育，以及鲑鳟鱼无公害健康养殖均有重要意义。

Description

用于检测传染性造血器官坏死病毒的LAMP引物及应用
技术领域
本发明涉及一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的LAMP引物及应用。
背景技术
传染性造血器官坏死病（infectious haematopoietic necrosis，IHN）是由传染性造血器官坏死病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV）引起的一种常见的危害鲑鳟鱼类的急性病毒性传染病。自从上世纪50年代在美国首次暴发以来，IHNV已经扩散至欧洲、澳洲、亚洲等十余个国家。IHNV可造成鲑鳟鱼鱼苗近100%的死亡率，对世界的鲑鳟鱼养殖业造成了巨大的经济损失。因此，实用、快速、灵敏、准确的IHNV检测技术的建立在IHN早期诊断、水产品卫生质量监督、疫情监测等方面具有重要的意义。目前，世界动物卫生组织推荐的IHN的几种诊断方法包括细胞培养分离方法、免疫学方法（中和试验法、间接荧光抗体法和ELISA法）和分子生物学方法（PCR法、PCR探针和序列测定法）。PCR方法是目前最常用的快速检测方法，已经有以PCR技术为依托的商业化的IHNV检测试剂盒，这些检测试剂盒需要专门的仪器或者对PCR产物进行凝胶电泳与紫外线分析才能确定检测结果。
环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）技术是2000年Notomi等在PCR基础上创建的另外一种形式的核酸扩增技术。与PCR技术相比，两者最大的差异在于靶基因引物的设计上。其中，PCR只使用一对与靶基因两端序列互补的上下游引物，而LAMP则针对靶基因的6个不同区域，设计4种特异引物——内侧引物对和外侧引物对，必要时再加上环形引物对，对靶基因进行扩增，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行扩增反应，因此其特异性和敏感性均比PCR更高。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增引物组。
本发明所提供的用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增引物组，具体可为引物组A或引物组B；所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；
所述引物1（F3）、所述引物2（B3）、所述引物3（FIP）、所述引物4（BIP）、所述引物5（Loop-F）和所述引物6（Loop-B）的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
所述引物组A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比可为1：1：8：8：4：4。所述引物组B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比可为1：1：8：8。
在本发明的一个实施例中，所述引物1（F3）和所述引物2（B3）在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为0.2μM；所述引物3（FIP）和所述引物4（BIP）在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为1.6μM；所述引物5（Loop-F）和所述引物6（Loop-B）在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为0.8μM。
所述引物组中，引物1（F3）和引物2（B3）组成外侧引物对；引物3（FIP）和引物4（BIP）组成内侧引物对；引物5（Loop-F）和引物6（Loop-B）组成环形引物对。序列1由20个核苷酸组成，序列2由20个核苷酸组成，序列3由45个核苷酸组成，序列4由46个核苷酸组成，序列5由18个核苷酸组成，序列6由20个核苷酸组成。
本发明的又一个目的是提供一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂。
本发明所提供的用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂，具体可包括反转录酶、链置换型DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和所述引物组。
当所述引物组为所述引物组A时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录酶和所述链置换型DNA聚合酶在所述扩增试剂中的配比可为5pmol：5pmol：40pmol：40pmol：20pmol：20pmol：25mmol：5nmol：10U：8U。
当所述引物组为所述引物组B时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录酶和所述链置换型DNA聚合酶在所述扩增试剂中的配比可为5pmol：5pmol：40pmol：40pmol：25mmol：5nmol：10U：8U。
在本发明中，所述反转录酶具体可为AMV反转录酶；所述链置换型DNA聚合酶具体可为Bst2.0DNA聚合酶（如NEB公司产品目录号为M0537S的产品）或Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。
在本发明的一个实施例中，所述试剂具体由所述AMV反转录酶、所述Bst2.0DNA聚合酶、所述dNTPs、10×等温扩增缓冲液和所述引物组组成；其中，所述10×等温扩增缓冲液的pH8.8，溶剂为水，溶质及其浓度如下：Tris-HCl20mM、KCl50mM、(NH4)2SO410mM、MgSO42mM、Tween-20体积分数0.1%。
所述AMV反转录酶为Promega公司产品；所述Bst2.0DNA聚合酶为New EnglandBiolabs公司产品。
在实际使用过程中，上述试剂的各组分在（逆转录）环介导等温扩增反应体系中的终浓度为：所述引物1和所述引物2各0.2μmol/L；所述引物3和所述引物4各1.6μmol/L；所述引物5和所述引物6各0.8μmol/L；所述dNTPs1mmol/μL；所述AMV反转录酶0.4U/μL；所述Bst2.0DNA聚合酶0.32U/μL；所述10×等温扩增缓冲液体积分数10%。
本发明的还一个目的是提供一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒。
本发明所提供的用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒，含有所述扩增试剂和荧光显色剂。
所述荧光显色剂为荧光染料SYBR Green I（如Invitrogen公司产品）。
如下a）或b）的应用也属于本发明的保护范围：
a）所述引物组在制备所述试剂盒中的应用；
b）所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有传染性造血器官坏死病毒的产品中的应用。
应用所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒检测或辅助检测待测样品中是否含有传染性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤：用所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒在63-65℃（如63℃或65℃）条件下对所述待测样品进行时长60min的环介导等温扩增反应，之后在80℃放置2min终止反应，按照如下方法确定所述待测样品中是否含有传染性造血器官坏死病毒：向反应体系中加入SYBR GreenＩ型核酸染料，如果反应液变成荧光绿色，说明待测样品中含有传染性造血器官坏死病毒，若反应体系呈现红棕色，则说明待测样品中没有传染性造血器官坏死病毒，该方法实现了检测结果的可视化。当然也可将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测待测样品中是否含有传染性造血器官坏死病毒，电泳检测若出现阶梯状DNA条带，则说明待测样品中含有传染性造血器官坏死病毒，若未出现阶梯状DNA条带，则说明待测样品中没有传染性造血器官坏死病毒。
所述待测样品来源于淡水或海洋动物，如鱼类，具体如鲑鳟鱼。
在本发明中，所述传染性造血器官坏死病毒为感染鱼类（如鲑鳟鱼）的传染性造血器官坏死病毒，具体如传染性造血器官坏死病毒（IHNV）毒株WRAC（美国典型培养物保藏中心，
Figure BDA0000401274420000031
Number：VR-1392ＴＭ）。
本发明将逆转录环介导的等温扩增技术（reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification，RT-LAMP）引入到传染性造血器官坏死病毒（infectioushaematopoietic necrosis virus，IHNV）检测中，建立了简单、快速、灵敏的IHNV检测方法。针对IHNV的聚合酶蛋白基因（Polymerase protein，L）的8个区域设计6条特异性引物，以IHNV基因组RNA为模板，在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下进行RT-LAMP，反应产物添加SYBR Green I荧光染料后，通过肉眼观察阳性样本表现为荧光绿色，而阴性样本表现为红棕色。该方法实现了检测结果的可视化。特异性分析显示该方法不与传染性胰腺坏死病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）及同属的水生动物病毒性出血败血症（viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV）发生交叉反应，并且可检测不低于10pfu IHNV的RNA，具有良好的特异性和很高的灵敏性。以上可视化结果均被2%琼脂糖凝胶电泳证明。本研究所建立的IHNV RT-LAMP可视化检测方法灵敏度高、特异性好、成本低、不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测。本发明对鲑鳟鱼鱼苗的引种、无特定病原体种鱼的培育，以及鲑鳟鱼无公害健康养殖均有重要意义。
附图说明
图1为不同稀释度病毒悬液感染EPC细胞后在细胞板上形成的空斑。
图2为RT-LAMP检测方法反应温度优化结果。其中，A为可视化检测结果，1：阴性对照；2-4：61℃、63℃、65℃。B为凝胶检测结果，泳1：阴性对照；2-4：61℃、63℃、65℃；M：DL2000DNA Marker。
图3为RT-LAMP检测方法特异性检测结果。其中，A为可视化检测结果，1：IHNV；2：IPNV；3：VHSV；B为凝胶检测结果，1：IHNV；2：IPNV；3：VHSV；M：DL2000DNA Marker。
图4为RT-LAMP检测方法灵敏度检测结果。其中，A为可视化检测结果，1-7：5、10、25、50、102、103、104pfu IHNV RNA。B为凝胶检测结果，1-7：5、10、25、50、102、103、104pfu IHNV RNA；M：DL2000DNA Marker。
图5为用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒的实际应用结果结果。其中，A为可视化检测结果，1-7：1-7号样品；B为凝胶检测结果，1-7：1-7号样品，M：DL2000DNA Marker。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
传染性造血器官坏死病毒（IHNV）毒株WRAC：美国典型培养物保藏中心，
Figure BDA0000401274420000043
Number：VR-1392ＴＭ。
传染性胰腺坏死病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）：美国典型培养物保藏中心，
Figure BDA0000401274420000041
Number：VR-890ＴＭ。
水生动物病毒性出血败血症（viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV）：美国典型培养物保藏中心，Number：VR-1387ＴＭ。
AMV反转录酶购自Promega公司，其产品目录号为M5101；Bst2.0DNA聚合酶购自NEB公司，其产品目录号为M0537S；SYBR Green I和Trizol购自Invitrogen公司；DKZW-D-2电热恒温水浴锅购自北京市永光明医疗仪器有限公司；凝胶成像系统Universal Hood II购自BIO-RAD。
实施例1、用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒的制备及使用方法
一、用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增引物组的制备
本实施例用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增引物组由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成。这六个引物按照如下方法制备：根据GenBank收录的IHNV聚合酶蛋白的多条基因序列，进行比对，选取聚合酶基因特异性保守区段，利用在线软件PrimerExplorer V4（https://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/）针对L基因保守区设计3对RT-LAMP引物，序列见表1，引物由哈尔滨博仕生物公司合成。
表1L基因RT-LAMP引物序列
Figure BDA0000401274420000051
二、检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增的方法的建立及优化
1、病毒的扩增与滴度测定
将传染性造血器官坏死病毒（IHNV）毒株WRAC的病毒悬液用细胞维持液（含有体积分数2%FBS的MEM培养基，MEM购自Gibico，产品目录号41500034）稀释103倍，取1ml接种于单层汇合的EPC细胞（购自美国典型培养物保藏中心，Number：CRL-2872），于15℃孵育1h，弃去细胞液，加入5mL细胞维持液（组成同上）于细胞培养瓶内，于15℃培养。当80%以上细胞出现细胞病变（cytopathic effect，CPE）时，收集细胞培养液（即病毒悬液），稀释成10-4-10-6三个梯度，取各梯度病毒悬液1mL接种于含有单层汇合EPC细胞的六孔板，置于15℃培养箱中吸附1h左右。同时将湿热灭菌的1.5%（每100ml细胞维持液中含有1.5g低熔点琼脂糖）低熔点琼脂糖与2×MEM细胞维持液（MEM购自Gibico，产品目录号41500034，一袋MEM粉末溶于500ml超纯水后无菌过滤获得2×MEM）按照体积比1:1混匀（所得混合液为低熔点琼脂糖细胞维持液），在40℃温浴保存。吸附后，弃去病毒悬液，用Hanks液（购自Gibico，产品目录号14065056）洗涤细胞2次，每孔加入2mL低熔点琼脂糖细胞维持液覆盖，待低熔点琼脂糖凝固后，置于15℃培养箱内倒置培养，显微镜下逐日观察空斑的形成和变化，4d后用含有中性红（终浓度0.06%体积分数）的低熔点琼脂糖细胞维持液覆盖六孔板，12h后进行病毒空斑计数，计算病毒滴度。
结果显示，将细胞培养病毒液接种到EPC细胞中，3d后肉眼就能观察到病毒空斑。随着时间的延长，空斑数目增多，直径扩大。至第5d，细胞板中性红染色后，肉眼可见圆形空斑（图1）。当接种病毒悬液的稀释倍数为104时，空斑数目最多，当稀释倍数为106时空斑数目约为3个，由此可知该病毒滴度约为3×106pfu/mL。
2、病毒RNA制备
取100μL病毒悬液（调整至含有105pfu））于无RNA酶的离心管中。12000g离心5min，去除沉淀。加入600μL Trizol裂解液，震荡混匀，12000g离心15min，吸取上清液加入到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，反复颠倒混匀，12000g离心15min，弃尽上清，加入体积分数75%的乙醇600μL，颠倒洗涤，12000g离心10min，弃尽上清，4000g离心10s，吸干管底的液体，室温干燥3min；加入100μL的无RNA酶水，将RNA沉淀完全溶解，分装于-80℃备用。
3、RT-LAMP检测方法的建立及优化
建立如下RT-LAMP扩增反应体系：表1中对应于L基因的六条引物各1μl（引物浓度为F3与B3：5pmol/μl；FIP与BIP：40pmol/μl；Loop-F与Loop-B：20pmol/μl）、1μl dNTP（浓度为25mmol/μl）、2.5μl10×等温扩增缓冲液、8U Bst2.0DNA聚合酶、10U AMV反转录酶，5μl上述步骤2制备RNA样品，无RNA酶水补齐至25μl，混匀。其中，10×等温扩增缓冲液的pH8.8，溶剂为水，溶质及其浓度如下：Tris-HCl20mM（pH8.825℃）、KCl50mM、(NH4)2SO410mM、MgSO42mM、Tween-20体积分数0.1%。
同时设置加入正常EPC细胞培养上清提取的RNA的样品组为阴性对照组。
将反应体系分别在61℃、63℃、65℃恒温水浴锅反应60min，随后80℃水浴2min用以灭活Bst2.0DNA聚合酶。
反应结束后，从扩增产物中取出5μl，向其余扩增产物加入2μl100倍稀释的SYBRGreen I，轻轻震荡，直接观察反应液颜色变化判断结果，确定最佳反应温度。如果反应液变为荧光绿色，说明相应温度下可发生有效扩增，能够实现IHNV的可视化检测；若反应液呈现红棕色，则说明相应温度下未发生有效扩增，未检测到IHNV。
同时，将取出的5μl产物用于2%琼脂糖凝胶电泳，观察结果，从而验证以上依靠反应液颜色进行结果判断的准确性。如果有荧光绿色产生的反应液，电泳检测出现阶梯状DNA条带，呈现红棕色的反应液，电泳检测未出现阶梯状DNA条带，则说明以上可视化检测结果准确。
结果显示，当反应温度为63℃和65℃时，扩增产物加入SYBR Green I后呈现荧光绿色。当扩增温度为61℃时扩增产物加入SYBR Green I后呈现红棕色，与阴性对照相同（图2中A）。凝胶电泳结果显示在63℃和65℃时，扩增产物电泳条带均呈特异性阶梯状分布；当扩增温度为61℃时结果与阴性对照一样，扩增产物没有出现阶梯状电泳条带（图2中B）。凝胶电泳结果与显色结果相符，从而验证了可视化检测结果的准确性。为了尽量减少水浴锅造成的温度误差，本发明的发明人在后续实验折中采用63℃为该方法扩增温度。
三、检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒的制备及使用方法
该试剂盒包括2个成分，分别是反应试剂和荧光染料SYBR Green I。其中，反应试剂由AMV反转录酶、Bst2.0DNA聚合酶、dNTPs、10×等温扩增缓冲液和表1中对应于L基因的六条引物组成；其中，所述10×等温扩增缓冲液的pH8.8，溶剂为水，溶质及其浓度如下：Tris-HCl20mM、KCl50mM、(NH4)2SO410mM、MgSO42mM、Tween-20体积分数0.1%。
具体而言，所述反应试剂按照如下配制（以20μl为例说明）：表1中对应于L基因的六条引物各1μl（引物浓度为F3与B3：5pmol/μl；FIP与BIP：40pmol/μl；Loop-F与Loop-B：20pmol/μl）、1μl dNTP（浓度为25mmol/μl）、2.5μl10×等温扩增缓冲液、8U Bst2.0DNA聚合酶、10U AMV反转录酶，无RNA酶水补齐至20μl，混匀。
该试剂盒可按照包括如下步骤的方法使用：
（a）取5μl待测RNA样品，加入到20μl上述反应试剂中，混匀，得到25μl的反应体系。同时分别做一组以等量无RNA酶水替代待测样品的阴性对照；
（b）将步骤（a）的待测样品反应体系和阴性对照反应体系均按照如下反应程序进行反应：63℃恒温水浴60min，80℃水浴2min；
（c）取出反应管，观察各样品反应产物的颜色，根据如下标准对结果进行判断：向反应体系中加入荧光染料SYBR GreenＩ，如果反应液变为荧光绿色，说明待测样品中含有传染性造血器官坏死病毒，若反应体系呈现红棕色，则说明待测样品中没有传染性造血器官坏死病毒。
当然，也可将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测待测样品中是否含有传染性造血器官坏死病毒，电泳检测若出现阶梯状DNA条带，则说明待测样品中含有传染性造血器官坏死病毒，若未出现阶梯状DNA条带，则说明待测样品中没有传染性造血器官坏死病毒。
实施例2、用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒的特异性分析
分别以含有105pfu的IHNV-WRAC（ATCC：VR-1392）、IPNV（ATCC：VR-890）和VHSV（ATCC：VR-1387）的基因组RNA为模板，利用实施例1的试剂盒及建立的RT-LAMP检测IHNV的方法，进行特异性对比实验。具体操作按照实施例1步骤三中所述的试剂盒使用方法进行。
反应结束后，从扩增产物中取出5μl，向其余扩增产物加入2μl100倍稀释的SYBRGreen I，轻轻震荡，直接观察反应液颜色变化判断结果。同时，将取出的5μl产物用于2%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。结果判断标准参照实施例1步骤三。
结果显示，以IHNV RNA为模板，RT-LAMP扩增产物在加入SYBR Green I后呈荧光绿色，凝胶结果呈特异性阶梯状条带，以IPNV和VHSV为模板RT-LAMP产物检测结果为阴性（图3）。以上结果说明实施例1制备的试剂盒及建立的RT-LAMP检测IHNV的方法具有良好的特异性，不与IPNV和VHSV发生交叉反应。
实施例3、用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒的灵敏度分析
以含有105pfu的IHNV-WRAC（ATCC：VR-1392）基因组RNA为标准模板，并将其按照一定的倍比进行梯度稀释，分别稀释成含有104、103、102、50、25、10、5pfu的IHNV RNA，分别以各稀释度的IHNV RNA为模板，对实施例1的试剂盒及建立的RT-LAMP检测IHNV的方法进行灵敏性分析。具体操作按照实施例1步骤三中所述的试剂盒使用方法进行。
反应结束后，从扩增产物中取出5μl，向其余扩增产物加入2μl100倍稀释的SYBRGreen I，轻轻震荡，直接观察反应液颜色变化判断结果。同时，将取出的5μl产物用于2%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。结果判断标准参照实施例1步骤三。
结果显示，以10pfu的IHNV RNA为模板时，RT-LAMP产物在加入SYBR GreenI后变成荧光绿色，仍可见清晰的特异性阶梯状条带，当模板量降为5pfu时，产物呈红棕色，阶梯状条带消失，并且经多次实验都获得稳定的结果（图4）。以上结果说明实施例1制备的试剂盒及建立的RT-LAMP检测IHNV的方法具有很高的灵敏度，可以检测不低于10pfu的IHNV RNA。
实施例4、用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒的实际应用
待测样品：不同地区送检1～7号样品鱼的肝组织，已知4号及7号样品未感染IHNV，其余样品均感染IHNV。
分别从1～7号样品鱼的肝组织提取RNA，各取5μl RNA样品进行RT-LAMP检测，具体操作按照实施例1步骤三中所述的试剂盒使用方法进行。
反应结束后，从扩增产物中取出5μl，向其余扩增产物加入2μl100倍稀释的SYBRGreen I，轻轻震荡，直接观察反应液颜色变化判断结果。同时，将取出的5μl产物用于2%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。结果判断标准参照实施例1步骤三。
结果见图5。由图可知，1～3号、5～6号样品成现荧光绿色，样品检出IHNV，4号、7号样品检测结果呈红棕色，未检测出IHNV（图5中A）。以上可视化检测结果与2%琼脂糖凝胶电泳检测结果一致（图5中B），且与已知感染结果一致。进一步证实了本发明试剂盒方法的实际应用可行性。
Figure IDA0000401274500000021
Figure IDA0000401274500000031

Claims (10)

1.用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增引物组，为引物组A或引物组B；所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；
所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述引物组A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为1：1：8：8：4：4；所述引物组B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为1：1：8：8。
3.用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂，包括反转录酶、链置换型DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和权利要求1或2所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录酶和所述链置换型DNA聚合酶在所述扩增试剂中的配比为5pmol：5pmol：40pmol：40pmol：20pmol：20pmol：25mmol：5nmol：10U：8U；或
所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录酶和所述链置换型DNA聚合酶在所述扩增试剂中的配比为5pmol：5pmol：40pmol：40pmol：25mmol：5nmol：10U：8U。
5.根据权利要求3或4所述的试剂，其特征在于：所述反转录酶为AMV反转录酶。
6.根据权利要求3-5中任一所述的试剂，其特征在于：所述链置换型DNA聚合酶为Bst2.0DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。
7.根据权利要求3-6中任一所述的试剂，其特征在于：所述试剂由所述AMV反转录酶、所述Bst2.0DNA聚合酶、所述dNTPs、10×等温扩增缓冲液和权利要求1或2所述的引物组组成；
所述10×等温扩增缓冲液的pH8.8，溶剂为水，溶质及其浓度如下：Tris-HCl20mM、KCl50mM、(NH4)2SO410Mm、MgSO42mM、Tween-20体积分数0.1%。
8.用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求3-7中任一所述扩增试剂和荧光显色剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光显色剂为荧光染料SYBRGreen I。
10.如下a）或b）的应用：
a）权利要求1或2所述的引物组在制备权利要求8或9所述试剂盒中的应用；
b）权利要求1或2所述引物组，或权利要求3-7中任一所述试剂，或权利要求8或9所述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有传染性造血器官坏死病毒的产品中的应用。
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