CN101418351B - 虾白斑综合症病毒病检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

一种虾白斑综合症病毒病检测试剂盒及检测方法，该试剂盒由一套引物、DNA提取缓冲液、DNA聚合酶、环介导等温扩增反应液、阳性对照、阴性对照、甜菜碱和dNTP组成；采用本发明可以检测出待检测虾是否感染虾白斑综合症病毒；本发明利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6个区域，在等温条件下生成大量的茎环样结构，在定性检测时不需任何特殊设备。因此具有特异性、灵敏度高和检测时间比普通PCR短的特点。

Description

虾白斑综合症病毒病检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测病毒的试剂盒及检测方法，具体涉及一种检测虾白斑综合症病毒的试剂盒及检测方法。

背景技术

自1993年以来，我国沿海对虾养殖业常常遭受暴发性流行病的侵袭。该病传染性强、宿主广、致死率高，严重制约着我国对虾养殖业的持续发展。现已证实对虾暴发病的病原是白斑综合症病毒(WSSV)。目前WSSV已遍及亚洲主要对虾养殖国家和地区，并已传播到北美洲。在已报道的所有对虾病毒中，该病毒毒力最强，危害最大，南美白对虾、斑节对虾、日本对虾、墨吉对虾、长毛对虾、中国对虾、印度对虾、桃红对虾、蓝对虾、白对虾、褐对虾、刀额新对虾、脊尾白虾、斑节对虾等，大部分养殖对虾皆可被WSSV侵染，在浮游生物、海葵、糠虾、白虾、毛虾、天津厚蟹、日本大眼蟹等动物中可检测出WSSV，在虾池的蟹、桡足类和昆虫(Ephydridae)体内也检到过WSSV，表明WSSV地域分布及宿主范围非常广泛，早在1995年国际兽疫局(OIE)、联合国粮农组织(FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)将其列为需要报告的重要的水生动物病毒病病原之一。

有关WSSV的研究在病原学、病理学、流行病学以及诊断学研究方面已深入到分子水平，但由于诸多原因，到目前为止还不能完全控制WSSV的疫情，面对WSSV的传布所能采取最主要的措施是及早发现和消灭传染源，果断切断传播途径。这样就需要建立和完善灵敏、准确、高效、快捷、方便的检测方法，现有的检测WSSV感染的方法很多，大致可以分为三类，即病原学、免疫学以及基因组检测。

用组织病理学和电子显微镜的方法来来检测WSSV耗时长，操作繁琐，灵敏度低，极易漏检，不宜对大批样品进行检测。

免疫学检测制备高效价抗体是WSSV免疫检测的关键，其最佳方案是制备单克隆抗体。WSSV的单克隆抗体免疫检测，其特异性、灵敏性和可重复性大大提高，方法快速、灵敏、简单、低成本，在实验条件一般的实验室内均能进行，但这类方法的发展落后于现代分子生物学技术。

通过基因组来检测，以WSSV的特有序列为靶序列进行检测，其中PCR检测由于其快速而又特异，应用方便，还可以进一步衍生出巢式PCR(nested-PCR)，但为避免假阳性结果需设置内控引物，同时因PCR反应时间长、还需要专门的PCR仪，新近还有利用实时PCR(real-time PCR)来检测WSSV，更是需要专用的仪器。另外还有利用核酸杂交技术，通过原位杂交或斑点杂交来完成，原位杂交需要先制组织切片，而且此法耗时长，操作繁琐，不适合在基层使用，斑点杂交需要把待测核酸固定于杂交膜上再行杂交、显影，适合于批量样品操作，但仅杂交后的显影检测需15小时左右，耗时长。

近年来发展起来的环介导等温扩增法(LAMP，loop-mediated isothermalamplification)，该方法可以高灵敏地非常有选择性地高效扩增靶序列(Notomiet al.，2000)，最终的LAMP产物是是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱。LAMP是一种全新的恒温核酸扩增方法，和其它核酸扩增技术相比，其反应原理、引物设计更加复杂。但是它具有等温扩增：只需要一个恒温装置就可以；高效灵敏：模板仅需要10个拷贝或更少；扩增特异性强：应用包含了六个区段的四条引物按严格顺序进行扩增；检测时间短：扩增可以在90min完成，比普通PCR反应还要省时间；产物可以通过直接在反应管中加SYBR Green I染色(由橙色转为绿色)或用琼脂糖凝胶电泳检测。因此LAMP在核酸的科学研究、疾病的诊断和预防、动物胚胎的性别鉴定和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。2004年Tomoya Kono将WSSV从kuruma shrimp中纯化出来，再提取WSSV的核酸，利用LAMP技术对此核酸进行扩增，结果证实LAMP可用于WSSV相应序列的扩增；但是该方法对中提纯步骤复杂而且对设备要求高，设备昂贵，适用性不普遍，另外，LAMP技术应用到实际检测中，还需要解决的问题包括引物的设计和实验条件的优化。

发明内容

本发明目的是提供一种检测虾WSSV的试剂盒及检测方法，简化检测步骤，缩短检测耗时，同时提高检测的灵敏度和特异性。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种环介导等温扩增检测虾白斑综合症病毒病(WSSV)的引物，由一对外引物和一对内引物组成，其中：

前内引物FIP-234包含F1C，一个TTTT连接子和F2-234，其序列如下所示：

5’-CGC ATA TTT CCC TCT ATC GCT ATT ATT TTT TAG CAC AGATTT TTT GAT-3’；

后内引物BIP-234包含B1C，一个连接子和B2-234，其序列如下所示：

5’-GGT CTG AAA TAT ACA TGG GTG CCT TTT TGA AAA TGG GGTTTA CGA CAA-3’；

前外引物F3-234的序列如下所示：5’-GGT AAA GGA ACG TTT TGTTG-3’；后外引物B3-234的序列如下所示：

5’-GCA ATG GGA ATG ATA ACT CTT-3’；

上述引物是根据WSSV DNA基因组序列，选取WSSV ORF234(其GenBank登录号为No.EF524224)，经BLAST分析确定其保守区域且与GenBank公布的其它核酸序列无同源，同时根据引物设计原则分别设计的，上述引物具体涉及的6个位点如下所示：

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种环介导等温扩增检测虾WSSA的试剂盒，由一套引物、DNA提取缓冲液、DNA聚合酶、环介导等温扩增反应液、阳性对照、阴性对照、甜菜碱和dNTP组成；所述的一套引物是由一对外引物和一对内引物组成，一对内引物由前内引物FIP-234和后内引物BIP-234组成，一对外引物由前外引物F3-234和后外引物B3-234组成；

所述提取缓冲液的组成包括：10mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，0.05mM乙二胺四乙酸(EDTA)，5mM硫酸铵((NH₄)₂SO₄)，0.1％质量百分浓度曲拉通X-100(Triton X-100)；溶液pH为7.8；

所述DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶；所述环介导等温扩增反应缓冲液为与Bst DNA聚合酶配套的，并且配套出售提供的环介导等温扩增反应液，通常配套提供的为10倍环介导等温扩增反应液(10×LAMP反应液)；

所述阳性对照为WSSV质粒片段，选自WSSV ORF 234(其GenBank登录号为No.EF524224)质粒片段；

所述阴性对照为健康虾的DNA提取物，即没有受到WSSV感染的健康的虾，虾的种类与带检测的虾保持一致，例如：当待检测的虾为克氏螯虾时，阴性对照即为健康的克氏螯虾的DNA提取物；当待检测的虾为罗氏沼虾时，阴性对照即为健康的罗氏沼虾的DNA提取物。以健康虾的DNA提取物为阴性对照而不选用二次蒸馏水为阴性对照的目的是保证检测的真实有效性，因为如果以二次蒸馏水为阴性对照，以WSSV质粒片段为阳性对照时，即使待检测的虾最后的检测结果呈阳性，那么也可能是由于虾的DNA导致的；而如果以健康的同一种类的虾的DNA提取物为阴性对照，以WSSV质粒片段为阳性对照时就不会出现这样的情况；所述虾的种类包括：中国对虾、南美白对虾、克氏螯虾、罗氏沼虾、斑节对虾等。

所述dNTP为含有四种dNTP的等量混合物。

使用上述试剂盒检测虾WSSV的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测虾的总DNA：取待检测虾的组织于沸水中煮6～20min，离心去水分后加入DNA提取缓冲液，充分磨碎后加酚摇匀10～30min，离心后将上清转移到新管中再加酚/氯仿摇匀5～15min，离心后取其上清，作为供扩增的目的模板；

所述酚/氯仿溶液的配比为酚和氯仿的体积比为1：1；

(2)配置扩增体系：在每25μl扩增体系中，包含：10×LAMP反应液2.5μL，终浓度各为0.8μmol/L的内引物FIP-234和BIP-234，终浓度各为0.2μmol/L的外引物F3-234和B3-234，终浓度为0.4μmol/L的dNTP，终浓度为1mol/L的甜菜碱，步骤(1)所得的模板4μL；补加灭菌的超纯水至24μL；

(3)将反应混合物混匀后加热变性，冷却后加入1μL的8U/μL的BstDNA聚合酶，混匀后于60～63℃孵育60～90min，结束反应；

(4)检测LAMP反应产物。

上述技术方案中，检测LAMP反应产物的方法为现有技术，例如可以通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测LAMP反应产物，有扩增条带出现的为检测结果阳性；或者向LAMP反应产物中加入100倍稀释的SYBR Green I染料1μL后，颜色由橙色变为绿色，提示检测结果为阳性。

优选的技术方案中，步骤(1)提取待检测虾的总DNA的方法如下：

取待检测虾的组织于沸水中煮10min，离心去水分后加入DNA提取缓冲液，充分磨碎后加酚摇匀15min，离心后将上清转移到新管中再加酚/氯仿摇匀10min，离心后取其上清，作为供扩增的目的模板。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

(1)本发明实现了对患WSSV病虾的快速诊断，整个检测时间可以在4小时左右完成，比最快的PCR的检测还要短，比用核酸杂交法检测时间省10小时以上。

(2)本发明基于检测是否存在WSSV基因组，对WSSV核酸相关片段进行特异性扩增，通过检测是否有扩增产物来实验对患WSSV病虾的WSSV检测，但LAMP不再需要PCR仪这样的专业仪器，代替PCR仪的只是一个恒温装置，例如控温精度高的水浴锅。

(3)与PCR扩增检测相比，LAMP的检测灵敏度要比PCR高出千倍以上。

(4)特异性增强，PCR扩增是针对了靶序列的二个区段用2个(一对)引物进行匹配实现扩增，而LAMP需要设计4个(二对)引物覆盖了靶序列的6个区段，因而其特异性有很大提高。

(5)基于对DNA提取方法的改进，改进后的提取方法与通常DNA提取方法相比，时间要节约一半以上，而且操作更为方便。

(6)与基于病原直接诊断、免疫学诊断来检测虾WSSV相比，本发明的检测周期更短，操作简便，而且适合批量检测，所需费用也低。

具体实施方式

下面实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：自然感染WSSV克氏螯虾的诊断

一种检测虾WSSV的方法，该方法采用的试剂盒由一套引物、DNA提取缓冲液、DNA聚合酶、环介导等温扩增反应液、阳性对照、阴性对照、甜菜碱和dNTP组成；所述的一套引物是由一对外引物和一对内引物组成，其中一对外引物由前外引物F3-234和后外引物B3-234组成；一对内引物由前内引物FIP-234和后后内引物BIP-234组成；

所述提取缓冲液的组成包括：10mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，0.05mM乙二胺四乙酸(EDTA)，5mM硫酸铵((NH₄)₂SO₄)，0.1％质量百分浓度曲拉通X-100(Triton X-100)；溶液pH为7.8；

所述DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶；所述环介导等温扩增反应缓冲液为与Bst DNA聚合酶配套的10倍环介导等温扩增反应液(10×LAMP反应液)；

所述阳性对照为WSSV质粒片段，选自WSSV ORF234(其GenBank登录号为No.EF524223)质粒片段；取pET-28a(+)-WSSV ORF234(1 OD/500μl)0.5μl，其它成分同检测组，用双蒸水补足到总体积24μl；

所述阴性对照为健康虾的DNA提取物，含有克氏螯虾虾DNA(1OD/200μl)0.5μl，其它成分同检测组，用双蒸水补足到总体积24μl；

所述dNTP为含有四种dNTP的等量混合物。

技术操作过程如下：

1.模板DNA的提取：取环境中怀疑被自然感染WSSV的克氏螯虾新鲜组织0.2g，于沸水中煮10min，离心弃尽水后充分研磨，按1/3(W/V)比例加入DNA抽提缓冲液(10mM Tris-HCl，0.05mM EDTA，5mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton X-100，pH7.8)，再加入500μl饱和酚，颠倒混合15min后4℃，12,000rpm，离心10min。上清转入新的离心管，加入等体积的酚/氯仿，颠倒混合，4℃，12,000rpm，上清即可作为下一步扩增的模板用；耗时约50分钟。

2.LAMP扩增：LAMP的反应为25μL体系，其中包含10×buffer 2.5μL；针对WSSV ORF 234的FIP(5’-CGC ATA TTT CCC TCT ATC GCT ATT ATTTTT TAG CAC AGA TTT TTT GAT-3’)、BIP(5’-GGT CTG AAA TAT ACATGG GTG CCT TTT TGA AAA TGG GGT TTA CGA CAA-3’)终浓度各为0.8μmol/L；F3(5’-GGT AAA GGA ACG TTT TGT TG-3’)、B3(5’-GCA ATGGGA ATG ATA ACT CTT-3’)终浓度各为0.2μmol/L；dNTP终浓度为0.4μmol/L；甜菜碱终浓度为1mol/L；模板4μL，补加灭菌的超纯水至24μL。将反应混合物混匀后，于95min变性5min，迅速至冰上冷却5min后加入8U(1μL)的BstDNA聚合酶，混匀后于60℃孵育60min，90℃ 2min结束反应。

3.LAMP反应产物通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示有扩增条带出现，表明结果为阳性。

实施例二：人工感染WSSV的克氏螯虾诊断

1.模板DNA的提取(采用了普通PCR方法中的DNA提取法，耗时约110分钟)：取怀疑被自然感染WSSV养殖的克氏螯虾组织0.2g，冰上充分研磨后按1/6(W/V)比例加入TN缓冲液(50mM Tris-HCl，0.4M NaCl，pH7.6)，将含病毒的组织研磨液分至两个离心管中，每管500μl。加入等体积的酚，颠倒混合。4℃，12,000rpm，离心10min。上清转入新的离心管，加入等体积的酚/氯仿，颠倒混合，4℃，12,000rpm，离心10min。上清转入新的离心管，加入等体积的氯仿，颠倒混合，4℃，12,000rpm，离心10min。上清再转入新的离心管中，加入1/10体积NaAC(3mol/L)，两倍体积的预冷无水乙醇，颠倒混匀后4℃，12,000rpm，离心10min。吸去上清，倒置两分钟后。加入500μL70％乙醇于沉淀中洗盐后，4℃，12,000rpm离心5min。弃上清，室温或37℃晾干后溶于50μL TE缓冲液中，并作10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹倍系列稀释，作为下一步扩增用模板。

2.靶序列LAMP扩增，取步骤1中所制备的样品各2μL作为模板，分别进行LAMP扩增，扩增条件为60℃ 90min，其余同实施实例一中步骤2。

3.LAMP扩增产物的检测实施实例一中步骤3，结果系列稀释模板全部得到有效扩增，全部显示阳性，以同样模板进行PCR扩增(p1-234：5’-CCGAATTCACCATGGAGTATATAGGGG-3’，p2-234：5’-CGAAGCTTGATACAGTGACCGTCCCTG-3’)并将扩增片段克隆测序证实为WSSV的核酸片段，结果只能在模板浓度为10^-1～10^-5之间能观察到扩增结果，当模板浓度为10^-6～10^-9之间时已经观察不到了，结果证明LAMP阳性结论正确，而且LAMP的灵敏度比PCR的灵敏度高了上千倍。

实施例三：自然感染WSSV罗氏沼虾的诊断

技术操作过程如下：

1.模板DNA的提取：将待检测养殖的罗氏沼虾，按实施实例三步骤1提取模板DNA，但模板不作稀释。

2.靶序列扩增同实施例一中步骤2。

3.扩增产物检测同实施例一中步骤3。结果显示WSSV阳性，并且得到电镜观察结果的支持。

Claims (2)

1.一种环介导等温扩增检测虾白斑综合症病毒病的引物，由一对外引物和一对内引物组成，其特征在于：一对内引物由前内引物FIP-234和后内引物BIP-234组成；一对外引物由前外引物F3-234和后外引物B3-234组成；

所述前内引物FIP-234的序列如下所示：

5’-CGC ATA TTT CCC TCT ATC GCT ATT ATT TTT TAG CAC AGATTT TTT GAT-3’；

后内引物BIP-234的序列如下所示：

5’-GGT CTG AAA TAT ACA TGG GTG CCT TTT TGA AAA TGG GGTTTA CGA CAA-3’；

前外引物F3-234的序列如下所示：

5’-GGT AAA GGA ACG TTT TGT TG-3’；

后外引物B3-234的序列如下所示：

5’-GCA ATG GGA ATG ATA ACT CTT-3’。

2.一种环介导等温扩增检测虾白斑综合症病毒病的试剂盒，其特征在于：由一套引物、DNA提取缓冲液、DNA聚合酶、环介导等温扩增反应液、阳性对照、阴性对照、甜菜碱和dNTP组成；

所述一套引物是由一对外引物和一对内引物组成，一对内引物由前内引物FIP-234和后内引物BIP-234组成，一对外引物由前外引物F3-234和后外引物B3-234组成；

所述前内引物FIP-234的序列如下所示：

5’-CGC ATA TTT CCC TCT ATC GCT ATT ATT TTT TAG CAC AGATTT TTT GAT-3’；

后内引物BIP-234的序列如下所示：

5’-GGT CTG AAA TAT ACA TGG GTG CCT TTT TGA AAA TGG GGTTTA CGA CAA-3’；

前外引物F3-234的序列为：5’-GGT AAA GGA ACG TTT TGT TG-3’；

后外引物B3-234的序列为：5’-GCA ATG GGA ATG ATA ACT CTT-3’；

所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；

所述阳性对照为wSSV质粒片段，选自wSSV ORF 234质粒片段；

所述阴性对照为健康虾的DNA提取物；

所述DNA提取缓冲液的组成包括：10mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，0.05mM 乙二胺四乙酸，5mM硫酸铵，0.1％质量百分浓度曲拉通X-100；溶液pH为7.8。