CN110628957A - 用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒pcr检测的引物对及试剂盒 - Google Patents

用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒pcr检测的引物对及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对及试剂盒。本发明提供了一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对，本发明的引物对根据如SEQ ID NO.3所示的中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列进行设计，实现了中华绒螯蟹白斑病毒的PCR检测。本发明实现了中华绒螯蟹白斑病毒的快速检测，从模板DNA制备、PCR反应、阳性对照体系均有预混液，实现了检测操作过程的标准化、简单化，且可大大减少了操作过程中所引起的污染，减少人为操作所引起的误差。本发明可广泛应于养殖生产中中华绒螯蟹白斑病毒的检测和评估其在养殖生产中的潜在危害。与宏基因组、宏转录组批量检测相比，本发明的技术方案具有速度快、费用低、针对性强，应用性好。

Description

用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对及试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术
对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)在分类上属线形病毒科(Nimaviridae)、白斑病毒属(Whispovirus)，是一种大型的杆状双链DNA 病毒，具有双层囊膜，不能形成包涵体。囊膜大小为210-420nm×70-167nm，病毒核衣壳大小为180-420nm×54-85nm。
WSSV是一种复制迅速和极其致命的对虾病原体，它于1992首次在中国台湾被发现，然后传播到日本和几乎所有亚洲国家。目前在全球范围内WSSV是危害对虾养殖业最严重的病原。WSSV除了能感染大多数对虾品种之外，还能感染其它非对虾种类，如端足类、介形类、蟹类、龙虾类、桡足类、水蝇类等甲壳纲动物，迄今为止，已报道有90种以上的节肢动物是WSSV的宿主或携带者。其外，也发现蠕虫、轮虫也是WSSV的携带者或中间宿主。已有一些报道指出海鸟也是WSSV传播的潜在来源。
蟹是一种广泛养殖的水产品种，已在蓝蟹(Callinectes sapidus)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、淡水蟹(Paratelphusa hydrodomus、P.pulvinata)、印度海蟹(Indian marine crabs)、远海梭子蟹(Portunus pelagicus)，mud crab巨缘青蟹(Scyllaserrata)等38种蟹中通过PCR检测到WSSV。中华绒螯蟹是我国养殖量最大的蟹种，2015年有学者首次报道池塘养殖的中华绒螯蟹感染WSSV，造成很高的死亡率。WSSV有多种分离株，其毒力有所差异。肌肉注射 WSSV-TW型和WSSV-CN-Pc克氏原螯虾(Procambarus clarkii)均在第6天出现100％的死亡；但罗氏沼虾在肌肉注射WSSV-TW后未出现死亡，但在注射 WSSV-CN-Pc后的第9天死亡率达100％。经口注射WSSV-CN-Pc和WSSV-TW 的克氏原螯虾均在第16天出现100％的死亡；罗氏沼虾经口注射WSSV-CN-Pc 后的第19天死亡率为100％，但注射WSSV-TW的实验组并未出现死亡。说明不同的WSSV分离株的毒力不同，同一个分离株对不同宿主的毒力也不同。 WSSV是白斑病毒属(Whispovirus)的一个种，WSSV可以感染中华绒螯蟹，但中华绒螯蟹是否存在自己的白斑病毒目前还无明确的报道。
通过组织病理学观察和电子显微镜观察，可以判断宿主是否感染白斑病毒，但在分类上难以判断是哪一种病毒。分子生物学的方法为白斑病毒的种类鉴定和检测提供了强有力的手段。利用一对WSSV特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对WSSV DNA进行体外扩增检测，用于对可疑感染者的病原学诊断。现有的文献中提供了多种WSSV的检测方法，但是现有的这些检测均只涉及到对虾WSSV，并没有涉及到感染中华绒螯蟹的白斑病毒属的其它成员。有关中华绒螯蟹病毒性疾病的研究非常有限，养殖生产上经常发生一些不明病因或病原的疾病，例近年来常发的中华绒螯蟹肝胰腺坏死征。因此，分离鉴定、检测中华绒螯蟹组织中的相关病毒，掌握其宿主域及危害，对中华绒螯蟹的疾病防治有重要意义，对防止或限制其传播有重要帮助，也能够帮助评价其对野生群体的潜在危害。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种检测、鉴定中华绒螯蟹白斑病毒方法。
本发明的第一个目的是提供一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR 检测的引物对，所述引物对根据中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列进行设计。
进一步地，所述的中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
进一步地，所述的中华绒螯蟹白斑综合征病毒保守区域的核苷酸序列还包括保持SEQ ID NO.3所示的序列的5’端21个碱基、3’端21个碱基不变，序列中有5-7个碱基随机错配得到的序列。
进一步地，所述的引物对包括：
正向引物(SEQ ID NO.1)：5’-CCTACACAGTCCGTCGTGAAG-3’；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5’-CGTTCCGTTGACCATAGGGAG-3’。
进一步地，所述的引物对还包括在上述引物对3’端碱基不变，序列中 1-3个碱基错配得到的引物对。
本发明的第二个目的是提供一种试剂盒，所述的试剂盒包含所述的用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对。
进一步地，所述的试剂盒还包含冻干DNA提取试剂、冻干PCR检测试剂和对照质粒。
进一步地，所述的DNA提取试剂为1000mmol Tris-HCl、250mmol EDTA、5000mmolNaCl、10％SDS、10％NP40和10000μg/ml蛋白酶K。
进一步地，所述的PCR检测试剂为10×PCR缓冲液、4dNTPs Mix、 250pmol/L引物对、25mM MgCl2、5U/μL Taq DNA聚合酶。
进一步地，所述的对照质粒含有如SEQ ID NO.3所示的中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列。
本发明的第三个目的是提供所述的试剂盒检测中华绒螯蟹白斑综合征的方法，包括如下步骤：
(1)在组织总DNA提取管中，加0.5-1mL双蒸水溶解，制备组织总 DNA提取液，尔后与0.1g待检组织混合，55度保温0.5-1小时，沸水浴加热5分钟，离心10分钟，取上清作为DNA模板；
(2)在待检样品PCR管中，加24μL双蒸水，溶解后加1μL DNA模板；
(3)在阳性对照PCR管中，加25μL双蒸水溶解；
(4)将步聚2、3的PCR管进行PCR扩增，扩增条件为：93-95度预变性3分钟后，按94度变性30秒、50-60度退火30秒、72度延伸15-25 秒，共扩增25-35个循环，最后72度延伸10分钟；
(5)PCR反应结束后，取8-10μL反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离，尔后在紫外观察仪下观察，如果待检样品和阳性对照均可观察到0.25kb 的特异性条带，则可判别为待检样品中含有中华绒螯蟹白斑病毒，如果待检样品中没有观察到0.25kb的特异性条带，而阳性对照中可观察到0.25kb 的特异性条带，则可判别为待检样品中无中华绒螯蟹白斑病毒。
本发明的有益效果是：
(1)目前还没有任何有关中华绒螯蟹白斑病毒的报道，更没有该病毒检测方法的报道，因此现有组织病理学观察、电子显微镜检测不能正确判断组织样品中是否含有中华绒螯蟹白斑病毒；现有的对虾WSSV的检测方案也不适合用于区分中华绒螯蟹白斑病毒。本发明实现了中华绒螯蟹白斑病毒的PCR检测。
(2)本发明实现了中华绒螯蟹白斑病毒的快速检测，从模板DNA制备、 PCR反应、阳性对照体系均有预混液，实现了检测操作过程的标准化、简单化，且可大大减少了操作过程中所引起的污染，减少人为操作所引起的误差。由于 PCR技术已非常普及，因此在一般的生物学实验室均可实现，本发明可广泛应于养殖生产中中华绒螯蟹白斑病毒的检测和评估其在养殖生产中的潜在危害。与宏基因组、宏转录组批量检测相比，本发明的技术方案具有速度快、费用低、针对性强，应用性好。
(3)与常规PCR的模板制备相比，本发明DNA模板的制备不需经过复杂的DNA提取、纯化，只需将检测组织用本发明的中华绒螯蟹组织总DNA提取液匀浆，然后在55度保温0.5-1小时沸水加热10分钟，经过简单的离心即可，大缩短了的模板DNA的制备时间，并减少了常规DNA提取中苯酚、氯仿所导致的污染。
(4)与常规PCR体系相比，本发明中PCR体系制成了预混液的冻干粉，减少了操作过程的人为误差和污染，最大限度地保证了检测过程的操作标准化。与以往的预混液相比，本发明在预混液的基础上进一步进行了冻干，保证了反应体系中试剂和酶的稳定性；并且运输方便，可减少运输过程对Taq酶活性的影响。
(5)PCR反应的阳性对照通常在PCR扩增前，按PCR反应体系现配，并用阳性质粒替代待检测的DNA模板。而本发明预先制成了PCR反应预混液冻干粉，用前只要加水即可，简化了操作，有效防止了污染。
附图说明
图1为中华绒螯蟹白斑病毒检测；泳道P：阳性对照PCR产物电泳；泳道 1-5：不同待测中华绒螯蟹肝胰腺组织PCR产物电泳；
图2为克氏螯虾肝胰腺组织中中华绒螯蟹白斑病毒的检测；泳道P：阳性对照PCR产物电泳；泳道1-6：不同待测克氏螯虾组织PCR产物电泳；M：标准分子量DNA marker；
图3为不同宿主不同组织中华绒螯蟹白斑病毒的检测。M：标准分子量DNA marker；泳道P：阳性对照PCR产物电泳；泳道1-3：不同待测中华绒螯蟹肝胰腺、肌肉、肠道组织PCR产物电泳；泳道4-6：待检中华绒螯蟹、克氏螯虾、罗氏沼虾的肠道组织；泳道7-9：待检中华绒螯蟹、克氏螯虾、罗氏沼虾的肌肉；泳道10-11：南美白对虾肌肉。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：宏基因组法筛选与鉴定中华绒螯蟹白斑病毒
1.采集摄食停止、活力差、病蟹壳软、四肢无力的河蟹，解剖取肝胰腺；
2.从肝胰腺中提取基因组DNA，委托商业公司用Illumina Hiseq 2500(Illumina，Inc.，San Diego，CA，USA)进行宏基因组鸟枪测序；
3.对测序获得的序列，用软件Bowtie2去除低质量序列、接头序列和核苷酸不明确序列；
4.用Bowtie2软件对通过步骤4获得干净序列进行组装，获得scaftigs序列；
5.将scaftigs序列与公其数据库中收录的细菌、真菌、古菌和病毒的序列进行比对，发现一个scaftigs序列与细菌、真菌、古菌、河蟹的序列无相似性；将该序列进行BLASTX比对，发现该scaftigs序列所编码的氨基酸序列与GenBank 中公开的不同宿主来源的WSSV的WSV-447-like蛋白的相应区域的同源性较高，其氨基酸的一致性达29.03％-47.67％，其中与WSSV169、WSSV507病毒株的一致性达41.18％。因此所发现的scaftigs序列代表一种新的白斑病毒序列，根据其来源的宿主，把该新的白斑病毒命名为中华绒螯蟹白斑病毒；该scaftigs 序列如SEQ ID NO.3。
实施例2：中华绒螯蟹肝胰腺组织中的中华绒螯蟹白斑病毒的检测
根据特异性序列SEQ ID NO3设计引物对SEQ ID NO1和SEQ ID NO2用于PCR检测中华绒螯蟹白斑病毒：
SEQ ID NO.1：
CCTACACAGTCCGTCGTGAAG
SEQ ID NO.2:
CGTTCCGTTGACCATAGGGAG
具体操作过程如下：
(1)制备组织总DNA提取管：首先分别配制1000mmol Tris-HCl(pH8.0)、250mmolEDTA(pH8.0)、5000mmol NaCl、10％SDS、10％NP40和10000μg/ml 蛋白酶K；尔后，分别取各100μL、100μL、100μL、10μL、10μL和10μL，在离心管中混匀后冻干制备组织总DNA提取管，-20度保存备用。
(2)取样：用电子天平称取0.1g左右的待检中华绒螯蟹肝胰腺，移至1.5mL 的离心管中；泳道P：阳性对照PCR产物电泳，即以pES-WSSV为模板的PCR 产物电泳；泳道1-5：为以不同待检测的中华绒螯蟹肝胰腺组织的DNA为模板的PCR产物电泳；
(3)制备DNA模板：从-20度取出组织总DNA提取管，加1mL双蒸水溶解，然后转移至步聚1的离心管中，用微型研棒研磨；55度保温0.5小时，沸水浴加热5分钟，4度下12000转/分钟离心10分钟，吸取上清至新的离心管中作为DNA模板备用。
(4)制备待检样品PCR管：化学合成检测引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，加适量双蒸水溶解，调节SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的浓度到 250pmol/L；分别取市售的10×PCR缓冲液、4dNTPs Mix(每一种dNTP的终浓度为2.5mM)、250pmol/L引物SEQ ID NO.1、250pmol/L引物SEQ ID NO.2、 25mM的MgCl2和Taq DNA聚合酶(5U/μL)各2.5、2.5、1、1、1.5和0.3μL，于PCR管中混匀，尔后冻干，-20度保存备用。
(5)配制待检样品PCR体系：从-20度冰箱中取出待检样品PCR管，加 24μL双蒸水，混匀后，加步骤(3)制备的DNA模板1μL，混匀；
(6)制备阳性对照PCR管：按SEQ ID NO.3序列人工合成，合成后的序列克隆进市售的T-载体，进一步进行测序验证，将含有与SEQ ID NO.3序列完全一致的质粒命名为pES-WSSV。分别取市售的10×PCR缓冲液、4dNTPs Mix(每一种dNTP的终浓度为2.5mM)、250pmol/L引物SEQ ID NO.1、250pmol/L 引物SEQ ID NO.2、25mM的MgCl2和Taq DNA聚合酶(5U/μL)各2.5、2.5、1、 1、1.5和0.3μL加入至含有10ng阳性质粒pES-WSSV的PCR管中，混匀后冻干，-20度保存备用。
(7)配制阳性对照PCR体系：从-20度冰箱中取出阳性对照PCR管，加 25μL双蒸水，混匀。
(8)PCR扩增：将步骤(5)的待检样品PCR管和步骤(7)的阳性对照 PCR管安装在PCR仪上，94度预变性3分钟后，按94度变性30秒、50度退火30秒、72度延伸15秒，共扩增30个循环，最后72度延伸10分钟；
(9)琼脂糖凝胶电泳和结果判别：PCR反应结束后，取10μL反应产物用 1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，尔后在紫外观察仪下观察，待检样品1-4(泳道1-4) 和阳性对照(泳道P)均可观察到0.25kb的特异性条带，则可判别为待检样品 1-4中含有中华绒螯蟹白斑病毒；待检样品(泳道5)中没有观察到0.25kb的特异性条带则可判别为对应待检样品中无中华绒螯蟹白斑病毒(图1)，即泳道5 所对应的河蟹肝胰腺中没有被中华绒螯蟹白斑病毒感染或该蟹没有携带所检测的病毒。
与常规PCR的模板制备相比，本发明DNA模板的制备简单：在我们的DNA 提取预混物中有：1000mmol Tris-HCl、250mmol EDTA、5000mmol NaCl、 10％SDS、10％NP40和10000μg/ml蛋白酶K，Tris-HCl主要提供缓冲条件，EDTA 可抑制DNA酶的活性，NaCl提高DNA的溶解，SDS促使蛋白变性、NP40表面活性剂破坏细胞膜、蛋白酶K降解蛋白使蛋白与DNA解离；55度蛋白酶K 的反应最适温度、沸水加热10分钟促使蛋白变性、细胞DNA变性，通过上述综合作用，提高了病毒DNA的提取效率，从而简化了模板的制方法。
实施例3：克氏螯虾中中华绒螯蟹白斑病毒的检测
具体操作过程如下：
(1)制备组织总DNA提取管：首先分别配制1000mmol Tris-HCl(pH8.0)、 250mmolEDTA(pH8.0)、5000mmol NaCl、10％SDS、10％NP40和10000μg/ml 蛋白酶K；尔后，按10：10：10：1：1：1的体积比混匀后，以330μL/管分装，冻干制备组织总DNA提取管，-20度保存备用。
(2)制备待检样品PCR管：化学合成检测引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，加适量双蒸水溶解，调节SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的浓度到 250pmol/L；分别取市售的10×PCR缓冲液、4dNTPs Mix(每一种dNTP的终浓度为2.5mM)、250pmol/L引物SEQ ID NO.1、250pmol/L引物SEQ ID NO.2、 25mM的MgCl2和Taq DNA聚合酶(5U/μL)按2.5：2.5：1：1：1.5：0.3体积比混匀，按8.8μL/管分装，冻干制备待检样品PCR管，-20度保存备用。
(3)制备阳性对照PCR管：按SEQ ID NO.3序列人工合成，合成后的序列克隆进市售的T-载体，进一步进行测序验证，将含有与SEQ ID NO.3序列完全一致的质粒命名为pES-WSSV，并配制10ng/μL的pES-WSSV，分别取市售的10×PCR缓冲液、4dNTPs Mix(每一种dNTP的终浓度为2.5mM)、250pmol/L 引物SEQ ID NO.1、250pmol/L引物SEQ ID NO.2、25mMMgCl2、Taq DNA聚合酶(5U/μL)、10ng/μL pES-WSSV按2.5：2.5：1：1：1.5：0.3：1混匀，按9.8μL/ 管分装，冻干后-20度保存备用。
(4)取样：用电子天平称取0.1g左右的待检克氏螯虾肝胰腺，移至1.5mL 的离心管中；
(5)制备DNA模板：从-20度冰箱中取出组织总DNA提取管，加0.5mL 双蒸水溶解，用微型研棒研磨后；55度保温1小时，沸水浴加热5分钟，4度下12000转/分钟离心10分钟，吸取上清至新的离心管中作为DNA模板备用。
(6)配制待检样品PCR体系：从-20度冰箱中取出待检样品PCR管，加24μL双蒸水，混匀后，加步骤(5)制备的DNA模板1μL，混匀；
(7)配制阳性对照PCR体系：从-20度保存的冰箱中取出阳性对照PCR 管，加25μL双蒸水，混匀。
(8)PCR扩增：将步骤(6)的待检样品PCR管和步骤(7)的阳性对照 PCR管安装在PCR仪上，95度预变性3分钟后，按94度变性30秒、60度退火30秒、72度延伸25秒，共扩增35个循环，最后72度延伸10分钟；
(9)琼脂糖凝胶电泳和结果判别：PCR反应结束后，取8μL反应产物用 1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，尔后在紫外观察仪下观察，阳性对照(泳道P) 可观察到0.25kb的特异性条带，待检样品1-4(泳道1-4)均可观察到0.25kb的特异性条带，则可判别为待检样品1-4中含有中华绒螯蟹白斑病毒；待检样品(泳道5、6)中没有观察到0.25kb的特异性条带，则可判别为对应待检样品中无中华绒螯蟹白斑病毒(图2)。
实施例4：不同宿主不同组织中华绒螯蟹白斑病毒的检测
具体操作过程如下：
(1)制备组织总DNA提取管：同实施例2；
(2)制备待检样品PCR管：同实施例2；
(3)制备阳性对照PCR管：以中华绒螯蟹白斑病毒阳性的中华绒螯蟹肝胰腺组织DNA为模板，以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增， PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒回收0.25kb的特异性DNA条带，克隆进市售的T-载体中进行测序鉴定，如果所测序列与SEQ ID NO.3序列一致，则将此重组质粒命名为pES-WSSV-P，配制10ng/μL的 pES-WSSV-P，分别取市售的10×PCR缓冲液、4dNTPs Mix(每一种dNTP的终浓度为2.5mM)、250pmol/L引物SEQ ID NO.1、250pmol/L引物SEQ ID NO.2、 25mM MgCl2、TaqDNA聚合酶(5U/μL)、10ng/μL pES-WSSV-P按2.5：2.5：1： 1：1.5：0.3：1混匀，按9.8μL/管分装，冻干后-20度保存备用。
(4)取样：取待检中华绒螯蟹、克氏螯虾、罗氏沼虾、南美白对虾的肝胰腺、或肌肉，如果所取组织肠道，则需用生理盐水洗除肠道内容物。用电子天平称取0.1g左右的待检组织，移至1.5mL的离心管中；
(5)制备DNA模板：从-20度冰箱中取出组织总DNA提取管，加0.75mL 双蒸水溶解，用微型研棒研磨后；55度保温0.75小时，沸水浴加热5分钟，4 度下12000转/分钟离心10分钟，吸取上清至新的离心管中作为DNA模板备用。
(6)配制待检样品PCR体系：同实施例2；
(7)配制阳性对照PCR体系：同实施例2；
(8)PCR扩增：将步骤(6)的待检样品PCR管和步骤(7)的阳性对照 PCR管安装在PCR仪上，93度预变性3分钟后，按94度变性30秒、55度退火30秒、72度延伸20秒，共扩增25个循环，最后72度延伸10分钟；
(9)琼脂糖凝胶电泳和结果判别：PCR反应结束后，取9μL反应产物用 1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，尔后在紫外观察仪下观察，泳道M为标准分子量DNA marker；泳道P为阳性对照PCR产物电泳，可观察到0.25kb的特异性条带；泳道1-3为不同待测中华绒螯蟹肝胰腺、肌肉、肠道组织PCR产物电泳，可观察到0.25kb的特异性条带，可判断对应组织中存在中华绒螯蟹白斑病毒；泳道4-6为待检中华绒螯蟹、克氏螯虾、罗氏沼虾的肠道组织，可观察到0.25kb 的特异性条带，可判断对应宿主的肠道组织中存在华绒螯蟹白斑病毒；泳道7-9 为待检中华绒螯蟹、克氏螯虾、罗氏沼虾的肌肉，在华绒螯蟹、克氏螯虾肌肉样品中可观察到0.25kb的特异性条带，可判断对应的组织中存在中华绒螯蟹白斑病毒，而罗氏沼虾的肌肉样品中没有观察到特异性的PCR产物，则可判断对应的组织中无中华绒螯蟹白斑病毒；泳道10-11：南美白对虾肌肉，可观察到 0.25kb的特异性条带，可判断对应宿主的肠道组织中存在华绒螯蟹白斑病毒。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对及试剂盒
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
cctacacagt ccgtcgtgaa g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
cgttccgttg accataggga g 21
<210> 3
<211> 258
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
cctacacagt ccgtcgtgaa ggattattac acctcgaaca acaagaagaa agaaagtcag 60
attcatccag ccttgctcaa tccacccatg aaaccagaaa ccatgaccga gctattttat 120
cacgtggcac ctcacactgt taaccttcaa gtttttcaat tttatgtaca tttcttattt 180
gtggtgtttg aacagtatca tgtatgttcg tcttcgttcg ctttcatccc tgtgggcctc 240
cctatggtca acggaacg 258

Claims (10)

1.一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对，其特征在于，所述引物对根据中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列进行设计。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述的中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述的中华绒螯蟹白斑综合征病毒保守区域的核苷酸序列还包括保持SEQ ID NO.3所示的序列的5’端21个碱基、3’端21个碱基不变，序列中有5-7个碱基随机错配得到的序列。
4.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述的引物对包括：
正向引物(SEQ ID NO.1)：5’-CCTACACAGTCCGTCGTGAAG-3’；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5’-CGTTCCGTTGACCATAGGGAG-3’。
5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于，所述的引物对还包括在上述引物对3’端碱基不变，序列中1-3个碱基错配得到的引物对。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1-5任一项所述的用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含DNA提取试剂、PCR检测试剂和对照质粒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的DNA提取试剂为800-1200mmolTris-HCl、200-300mmol EDTA、4500-5500mmol NaCl、8-12％SDS、8-12％NP40和8000-12000μg/ml蛋白酶K。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR检测试剂为10×PCR缓冲液、4dNTPs Mix、200-300pmol/L引物对、20-30mM MgCl2、3-8U/μL Taq DNA聚合酶；所述的对照质粒含有如SEQ ID NO.3所示的中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列。
10.一种权利要求6所述的试剂盒检测中华绒螯蟹白斑综合征的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在组织总DNA提取管中，加0.5-1mL双蒸水溶解，制备组织总DNA提取液，尔后与0.08-0.12g待检组织混合，50-60℃保温0.5-1小时，沸水浴加热4-6分钟，离心8-12分钟，取上清作为DNA模板；
(2)在待检样品PCR管中，加20-30μL双蒸水，溶解后加0.8-1.2μL DNA模板；
(3)在阳性对照PCR管中，加20-30μL双蒸水溶解；
(4)将步聚2、3的PCR管进行PCR扩增；
(5)PCR反应结束后，取8-10μL反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离，根据特异性条带，判别待检样品中有无中华绒螯蟹白斑病毒。
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