CN113528507A - 一种高通量快速磁珠法提取鸡血基因组dna的试剂盒及提取法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高通量快速磁珠法提取鸡血基因组DNA的试剂盒及提取法。本发明所要保护的一个技术方案是提取DNA的组合物。所述组合物含有细胞悬浮液、裂解液、磁珠悬浮液和结合液。所述组合物中各溶液的配比可为细胞悬浮液300‑500μL，裂解液300‑500μL，磁珠悬浮液5‑20μL，结合液600‑800μL。实验证明，和现有的磁珠分离纯化基因组DNA试剂盒相比，本试剂盒提取DNA得率显著提高(p<0.01)。而本试剂盒配套一板96孔试剂盒，每次操作可完成96个样品，经测试每人可同时操作4‑8套96孔板，即相同时间内每人可操作400‑800个样品，效率得到飞跃式提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高通量快速磁珠法提取鸡血基因组DNA的试剂盒及提取法。
背景技术
核酸的分子生物学检测技术是现代医学、动物生物学发展基础和常规应用的最为重要的手段之一。提取、纯化的基因组DNA可直接用于后续的PCR检测、宏基因组检测、二代测序文库制备等工作。从目前技术发展的程度来看，在实验室获得高质量、高完整度、高纯度的鸡血基因组DNA仍然是一个不简单易行，耗时耗力过程。鸡生长过程中随时要检测是否感染鸡瘟等流行性疾病，传统方法消耗大量的人力和时间，往往难以在需要的时间内完成。开发新的简单、高效、快速的鸡血基因组DNA提取方法，获得高质量样品，具有非常重要的应用价值。
传统的核酸分离方法主要包含细胞破碎、细胞核破碎、DNA萃取、沉淀，高速离心等过程，用SDS进行蛋白变性或蛋白酶K来消化提取组分中的核酸酶和其他蛋白组分，再用乙醇去除盐分，洗涤后可得到核酸DNA。膜吸附的方法也可用来做基因组DNA的提取和纯化，但是膜吸附纯化方法高度依赖离心机，每个样品在每个步骤都使用移液器，步骤繁杂、费时长、回收率低。
磁珠纯化技术是近些年来发展起来的新方法，特点是简单有效，主要原理是在具有超顺磁性的Fe磁核上均匀包被二氧化硅，二氧化硅连接能特异性吸附阴性电荷核酸的能力。磁珠法和传统方法相比，整个过程无需剧毒试剂参与，且避免多步骤高转速离心，步骤较少、且简单易行。但是现有的磁珠分离法存在得率不高或效率不高的问题，且大部分适用于单通道或8通道，无法实现真正意义上的高通量DNA提取；或者是全自动电动化的96通道，为进口大型仪器，不利于普及型应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何高效和/或快速提取动物基因组DNA。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了提取DNA的组合物。所述组合物含有细胞悬浮液、裂解液、磁珠悬浮液和结合液。所述组合物中各溶液的配比可为细胞悬浮液300-500μL，裂解液300-500μL，磁珠悬浮液5-20μL，结合液600-800μL。
所述细胞悬浮液可为Tris-HCl缓冲溶液；
所述裂解液的溶质可为十二烷基硫酸钠(SDS)、NP-40和蛋白酶K，溶剂可为所述Tris-HCl缓冲溶。所述溶质和溶剂的配比可为NP-40 5g，蛋白酶K 100ng，Tris-HCl缓冲溶液100mL。
所述磁珠悬浮液可为直径80-1000nm的Fe-Si磁珠与水的混合液。所述磁珠的浓度可为10-20mg/mL。
所述结合液的溶剂可为100％异丙醇。所述结合液的溶质为异硫氝酸呱。所述溶质与溶剂的配可为286g：1000mL。上文所述组合物可为从动物组织中提取DNA的组合物。上述组合物可为从鸡血中提取DNA的组合物。
所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10mmol/L、pH为8.5。
所述裂解液的pH可为8.5。上文所述裂解液的溶质还可包括叠氮化钠和氯化钠。所述裂解液的溶质的配比可为NP-40 5g，蛋白酶K 100ng，Tris-HCL缓冲溶液100mL，叠氮化钠1g，氯化钠11.58g。
上文所述组合物还可包括漂洗液和洗脱液。
上文所述漂洗液可为乙醇水溶液。上文所述洗脱液为水。上文所述组合物中各溶液的配比可为细胞悬浮液300-500μL，裂解液300-500μL，磁珠悬浮液5-20μL，结合液600-800μL，漂洗液500-1000μL，洗脱液100-200μL。
上文所述乙醇水溶液可为浓度为80％乙醇水溶液。所述水可为去离子水。
上文所述组合物中各溶液的配比具体可为细胞悬浮液400μL，裂解液400μL，磁珠悬浮液5μL，结合液800μL，漂洗液700μL，洗脱液100μL。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了提取DNA的试剂盒。所述试剂盒包括上文所述的提取DNA的组合物。
上文所述试剂盒还可包括离心板和/或磁力搅拌棒。所述磁珠的直径可为80-1000nm。所述磁珠在所述磁珠悬浮液中的浓度具体可为10mg/mL。
上文所述离心板可为96孔深孔离心板。所述磁力搅拌棒可为96孔磁力搅拌棒。所述试剂盒还可包括96孔半自动磁力架。
上文所述的组合物和/或上文所述的试剂盒在提取动物样本DNA中的应用也属于本发明的保护范围。
上文所述动物样本可为鸡血液。所述动物DNA可为动物基因组DNA。
上文所述鸡血液可为新鲜的血液或干血片。所述细胞悬浮液、裂解液、结合液、漂洗液和洗脱液均独立包装，可单独使用。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了提取动物血液样本DNA的方法。所述方法包括在所述动物血液样本中加入上文所述的细胞悬浮液和裂解液后静置，得到裂解混合液；将所述裂解混合液离心后加入上文所述的结合液和磁珠悬浮液，混匀后静置得到与磁珠结合的DNA，将所述与磁珠结合的DNA进行纯化得到纯化的DNA。
上文所述方法中，所述动物血液样本与所述细胞悬浮液、所述裂解液的配比可为动物血液样本：5-20μL，细胞悬浮液400μL，裂解液400μL。所述静置的温度可为56℃，静置时间可为10-20min。所述离心的离心力可为1700g，离心时间可为5min。
上述方法中，所述动物血液样本可为动物新鲜血液。所述动物血液还可为使用动物新鲜血液制备的干血片。上文所述动物可为鸡。所述细胞悬浮液、裂解液、结合液和磁珠悬浮液的体积比可为400:400:800:5。所述纯化可包括使用上文所述的漂洗液和洗脱液对所述的DNA粗提液进行漂洗和洗脱的步骤。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一套适用于半自动方法的高通量DNA提取试剂盒。实验证明，本发明的DNA提取试剂(试剂盒)和现有的磁珠分离纯化基因组DNA试剂盒相比，本试剂盒及相应方法更为高效简单、操作更为方便，并且在使用相同的原料的前提下，采用本发明的试剂盒能够得到更高浓度的DNA，大大提供DNA的提取效果。此外，本试剂盒配套一板96孔试剂盒，每次操作可完成96个样品，经测试每人可同时操作4-8套96孔板，即相同时间内每人可操作400-800个样品，效率得到飞跃式提高。
附图说明
图1为提取不同来源品种的鸡血基因组DNA检测结果图。其中使用的是本发明试剂盒，1-3为青脚鸡、4-7为三黄鸡、8-11为清远麻鸡、12-14为珍珠鸡、15-17为固始鸡、18-20为乌骨鸡、21-23为麻黄鸡。
图2为本发明与其他两种试剂盒提取青脚鸡鸡血基因组DNA效果图。1-4为安迪生物M090085血液DNA提取试剂盒-柱式提取鸡血基因组DNA检测结果、5-8位本发明试剂盒的磁珠法鸡血基因组DNA检测结果、9-12位天根血液DNA提取试剂盒(DP348)的过柱法鸡血基因组DNA检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的干血片为中国各地有代表性的食用鸡品种的鸡血干血片。
下述实施例中的药品和试剂来源：氯化钠(国药，Cat no.10019318)、Tris-HCl(amresco,Cat no.0234)、Sodium Azide(叠氮化钠，Merck Millipore，Cat no.01-0032-00)、异丙醇(国药，80109218)、GITC(异硫氝酸呱，sigma，V900474)、SDS(十二烷基硫酸钠，sigma，L6026)、蛋白酶K(NEB、P8111S)、乙醇(西陇，XL0041)、NP-40(Invitrogen,FNN0021)。
实施例1DNA提取试剂盒的制备
1.试剂盒的制备
1.1配制DNA提取试剂和使用
DNA提取试剂包括六种溶液：细胞悬浮液、裂解液、磁珠悬浮液、结合液、漂洗液和洗脱液。
所述细胞悬浮液成分为Tris-HCL缓冲溶液，Tris-HCL缓冲溶液的浓度为10mmol/L、pH为8.5。
裂解液中是主要溶质为十二烷基硫酸钠(SDS)、NP-40、和蛋白酶K的Tris-HCL缓冲溶，同时溶质中还包括叠氮化钠(Sodium Azide)、氯化钠，溶剂为去离子水。裂解液中各溶质的配比为：十二烷基硫酸钠(SDS)的体积分数为1％-2％(10-20g),NP-40的体积分数为0.5％(5g)，蛋白酶K为100ng，Tris-HCL缓冲溶液100mL(10mmol/L、pH为8.5)，叠氮化钠1g，氯化钠11.68g。
结合液的溶剂为100％异丙醇，溶质为GITC(异硫氝酸呱)，GITC的浓度为2M。磁珠悬浮液：溶质为直径为80-1000nm的Fe-Si磁珠(河南洛阳爱森生物科技有限公司AS316001)，溶剂为去离子水。Fe-Si磁珠的浓度为10-20mg/mL。
漂洗液为80％乙醇水溶液。
洗脱液为去离子水。
DNA提取试剂中的细胞悬浮液、裂解液、磁珠悬浮液、结合液、漂洗液和洗脱液各溶液均独立包装，可单独使用。
1.2DNA提取试剂的使用
步骤1.1配制的DNA提取试剂可配合96孔深孔离心板、96孔磁力搅拌棒和5mm直径钢珠(WXHY-1215L，TBD)，与96孔半自动磁力架配合使用，完成DNA的提取。其中96孔半自动磁力架、96孔磁力搅拌棒、96孔深孔离心板使用专利号ZL202021400342.X中的方法制备得到。
实施例2使用DNA提取试剂盒提取鸡血DNA
使用实施例1制备的DNA提取试剂盒提取中国各地有代表性的食用鸡品种的鸡血干血卡(CW2662M，康为世纪)包括青脚鸡、三黄鸡、清远麻鸡、珍珠鸡、固始鸡、乌骨鸡和麻黄鸡。
将七种鸡血干血片使用实施例1制备的DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取，包括如下步骤：
1)取干血片样品置于与自主研发半自动磁珠吸附磁力架配套的96孔深孔板中。
2)将96孔深孔板中每孔加入到400μL细胞悬浮液和400μL裂解液中，56℃孵化10分钟，得到裂解液混合物。
3)将裂解液混合物常温4000rpm，离心5分钟，观察样品沉淀完全，吸取上清液400μL备用。
4)将上清液转移到新的96孔深孔板中，加入800μL结合液异丙醇和5μL磁珠悬浮液，混匀，静置10分钟。
5)将吸附套按在半自动磁珠吸附磁力架上，将磁力架的磁棒探入96孔深孔板，吸附2min。
6)将吸附好磁珠的磁棒置入漂洗液，30秒，漂洗两遍。
7)磁珠干燥后，置于去离子水中洗脱。
8)用Qubit(ThermoTM)测定浓度，记录3次重复结果，取平均值。
9)电泳检测实验结果见图1。
图1检测结果表明七种食用鸡品种的共23份鸡血干血卡样品，均检测到5000bp左右的鸡血基因组DNA明亮条带，经测定提取的DNA浓度分别为(单位均为ng/μL)：50，210，175，185，190，200，230，240，160，170，150，160，190，180，170，170，165，160，190，210，212，220，220。
实施例3使用不同的试剂盒提取青脚鸡鸡血基因组DNA
分别使用本发明实施例1和2中制备的DNA提取试剂盒和提取方法、以及现有技术中常用的两种DNA提取试剂盒(安迪生物M090085血液DNA提取试剂盒和天根血液基因组DNA提取试剂盒DP348)提取青脚鸡鸡血基因组DNA，然后对提取的DNA进行比较分析。
1.使用本发明制备的试剂盒提取青脚鸡鸡血基因组DNA
将青脚鸡鸡血新鲜血样使用试剂盒进行基因组DNA的提取，包括如下步骤：
1)取20μL新鲜鸡血，置于与半自动磁珠吸附磁力架配套的96孔深孔板中。
2)在深孔板中加入到400μL细胞悬浮液和400μL裂解液中，56℃孵化10分钟，得到裂解液混合物。
3)将裂解液混合物常温1700g，离心5分钟，观察样品沉淀完全，吸取上清液备用。
4)将上清液转移到新的96孔深孔板中，加入800μL裂解液的异丙醇和5μL直径80-1000nm磁珠悬浮液(10mg/mL)至终浓度为0.125mg/mL，混匀，静置10分钟，得到与磁珠结合的DNA。
5)将吸附套按在半自动磁珠吸附磁力架上，将磁力架的磁棒探入96孔深孔板，吸附2min，得到。
6)将吸附好磁珠的磁棒置入漂洗液，30秒，漂洗两遍。
7)磁珠干燥后，置于去离子水中洗脱，得到DNA洗脱液，即为提取后纯化的DNA。
8)用Qubit(ThermoTM)测定DNA洗脱液浓度，记录3次重复结果，取平均值(表1)。
9)取1μL DNA洗脱液，电泳检测实验结果见图2(5-8位点样孔)。
2.使用安迪生物M090085血液DNA提取试剂盒-柱式提取鸡血基因组DNA
将鸡血使用安迪生物M090085血液DNA提取试剂盒-柱式进行基因组DNA的提取，包括如下步骤：
1)取20μL新鲜鸡血，置于2mL离心管，加入500μL溶液A，吹打混匀。
2)室温12000rpm离心2min，弃上清。
3)加入500μL溶液B，充分吹打混匀，静置2min至溶液澄清，转移至离心吸附柱中静置5min。
4)12000rpm离心30s,弃废液。
5)加入700μL通用洗柱液，12000rpm离心30s，弃废液。
6)加入700μL通用洗柱液，12000rpm离心30s，弃废液。
7)12000rpm离心30s，甩干残留液体。
8)将吸附柱放入一个干净的离心管中，滴加50μL洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到DNA洗脱液。用Qubit(ThermoTM)测定DNA洗脱液浓度，记录3次重复结果，取平均值(表1)。
9)取1μL DNA洗脱液电泳检测实验结果见图2(1-4位点样孔)。
3.使用天根血液基因组DNA提取试剂盒提取青脚鸡鸡血基因组DNA
将鸡血使用天根血液基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取，包括如下步骤：
1)取新鲜血液20μL，装入1.5mL或2mL的离心管中，加缓冲液GA至200μL。
2)加20μL Proteinase K溶液，混匀。
3)加200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心，去除管盖内壁水珠。
4)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s,简短离心。
5)将沉淀和溶液转移至放入收集管中的吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
8)重复步骤7。
9)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min,弃废液。将吸附柱放回，室温放置至干燥。
10)将吸附柱转入干净离心管中，向吸附膜中间悬空加50μl洗脱缓冲液TE,室温放置5min,12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，得到DNA洗脱液。用Qubit(ThermoTM)测定DNA洗脱液浓度，记录3次重复结果，取平均值(表1)。
11)取1μL DNA洗脱液电泳检测实验结果见图2(9-12位点样孔)。
统计上述不同试剂盒从鸡血中提取的DNA浓度，结果如表1和图2所示，从表1中的数据可以看出，本发明制备的鸡血DNA提取试剂盒相较其他DNA提取试剂盒提取得率显著提高(p<0.01)(根据3次以上重复试验的结果，用excel软件对测定数据进行统计分析)。
表1 使用不同试剂盒从鸡血中提取的DNA浓度
| 试剂盒 | DNA浓度ng/μL(鸡血总量20μL) |
| 安迪生物M090085血液DNA提取试剂盒 | 115±6.88 |
| 天根血液基因组DNA提取试剂盒DP348 | 215±12.31 |
| 本发明制备试剂盒 | 240±15.17 |
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.提取DNA的组合物，其特征在于：所述组合物含有细胞悬浮液、裂解液、磁珠悬浮液和结合液；所述组合物中各溶液的配比为细胞悬浮液300-500μL，裂解液300-500μL，磁珠悬浮液5-20μL，结合液600-800μL；
所述细胞悬浮液为Tris-HCl缓冲溶液；
所述裂解液的溶质为十二烷基硫酸钠、NP-40和蛋白酶K，溶剂是所述Tris-HCl缓冲溶；所述溶质和溶剂的配比为NP-40 5g，蛋白酶K 100ng，Tris-HCl缓冲溶液100mL；
所述磁珠悬浮液为直径80-1000nm的Fe-Si磁珠与水的混合液，所述磁珠的浓度为10-20mg/mL；
所述结合液的溶剂为100％异丙醇，溶质为异硫氝酸呱，所述溶质与溶剂的配为286g：1000mL。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述裂解液的溶质还包括叠氮化钠和氯化钠，所述裂解液的溶质的配比为NP-40 5g，蛋白酶K 100ng，Tris-HCL缓冲溶液100mL，叠氮化钠1g，氯化钠11.58g。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括漂洗液和洗脱液。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述漂洗液为乙醇水溶液；所述洗脱液为水；所述组合物中各溶液的配比为细胞悬浮液300-500μL，裂解液300-500μL，磁珠悬浮液5-20μL，结合液600-800μL，漂洗液500-1000μL，洗脱液100-200μL。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的组合物，其特征在于：所述组合物中各溶液的配比为细胞悬浮液400μL，裂解液400μL，磁珠悬浮液5μL，结合液800μL，漂洗液700μL，洗脱液100μL。
6.提取DNA的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-6中任一权利要求所述的提取DNA的组合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括离心板和/或磁力搅拌棒；所述磁珠的直径为80-1000nm；所述磁珠在所述磁珠悬浮液中的浓度为10mg/mL。
8.权利要求1-5中任一权利要求所述的组合物和/或权利要求6或7所述的试剂盒在提取动物样本DNA中的应用。
9.提取动物血液样本DNA的方法，其特征在于：所述方法包括在所述动物血液样本中加入权利要求1中所述的细胞悬浮液和裂解液后静置，得到裂解混合液；将所述裂解混合液离心后加入权利要求1中所述的结合液和磁珠悬浮液，混匀后静置得到与磁珠结合的DNA，将所述与磁珠结合的DNA进行纯化得到纯化的DNA。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述动物血液样本与所述细胞悬浮液、所述裂解液的配比为动物血液样本：5-20μL，细胞悬浮液400μL，裂解液400μL；所述静置的温度为56℃，静置时间为10-20min；所述离心的离心力为1700g，离心时间为5min。
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