CN109439655A - 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法 - Google Patents

适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109439655A
CN109439655A CN201811595458.0A CN201811595458A CN109439655A CN 109439655 A CN109439655 A CN 109439655A CN 201811595458 A CN201811595458 A CN 201811595458A CN 109439655 A CN109439655 A CN 109439655A
Authority
CN
China
Prior art keywords
magnetic bead
rna
dna
nanometer magnetic
washing buffer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811595458.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109439655B (zh
Inventor
王燕
方楠
王建伟
伍启熹
刘倩
刘珂弟
唐宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing You Xun Medical Laboratory Laboratory Co Ltd
Original Assignee
Beijing You Xun Medical Laboratory Laboratory Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing You Xun Medical Laboratory Laboratory Co Ltd filed Critical Beijing You Xun Medical Laboratory Laboratory Co Ltd
Priority to CN201811595458.0A priority Critical patent/CN109439655B/zh
Publication of CN109439655A publication Critical patent/CN109439655A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109439655B publication Critical patent/CN109439655B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法。该方法包括采用纳米磁珠对样本进行核酸提取，其中，样本为数量少于50个的细胞。通过采用纳米磁珠对数量少于50个的细胞进行核酸提取，不仅能够实现超微量细胞核酸的提取，而且提取效率和纯度相对比较高。

Description

适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及核酸提取试剂领域，具体而言，涉及一种适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法。
背景技术
临床及生物医学研究中常常需要从各种生物组织或细胞中抽提基因组DNA或mRNA，应用核酸扩增技术测定其成分，这是用于病症的辅助性分析和诊断的一种高度敏感，且最为直接的检测手段。所以核酸提取是生物医学研究和临床上进行基因表达水平检测、基因克隆或测序等工作之前，样品处理的必要步骤。生物样品，如培养的细胞、动植物组织、体液(如血液、分泌物、棉拭子、脓液、痰液、组织液等)、微生物样品等都需要经过适当的处理，将其中的核酸提取出来进行下一步的分析，如基因表达水平检测、基因克隆或测序等。目前常用的核酸提取试剂中都采用胍盐、表面活性剂、酚、氯仿等作为样品裂解、核酸纯化试剂；常用的操作方法有手工法、吸附柱法和磁珠法等。
转录组是指某个物种或特定细胞在某一生理功能状态下，细胞内所有转录的mRNA产物的集合，包含了时间和空间的限定，是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带。转录组分析包括但不限于：编码基因的分析、翻译蛋白的预测、外显子内含子的剪切拼接、转录本的机构分析功能分析，mRNA二级结构，基因的差异表达等等。目前成熟可靠的转录组分析手段包括RT-qPCR分析基因表达量、芯片杂交平台分析某些已知基因的转录活动、或者高通量测序技术等。准确深入地分析转录组，有助于全面理解细胞基因表达和调控网络的作用。
精准医疗是指以患者分子生物病理学特征，如基因组、蛋白质组或代谢组等相关内部环境信息，设计出与患者相匹配的精准医疗诊断和治疗策略。与传统的以病人临床症状和个体特征为基础的诊治方法相比，精准医疗通常能达到更好的治疗效果并且减少副作用的产生。自精准医疗提出以来，采用多种基因组技术(二代测序、RNA表达谱、拷贝数变化)和系统生物方法指导用药成为了一种全新的个性化治疗方法。这就需要对临床样本进行DNA和RNA的分离提取。
核酸提取方法种类很多，如酚、氯仿等有机溶剂抽提法、硅胶膜吸附柱法等。但由于操作过程中使用到各种有机溶剂会危害人体健康，操作步骤繁琐复杂，单位时间通量低不易实现自动化，提取出的核酸浓度纯度较低等因素为传统核酸提取技术的瓶颈。
目前对于临床珍贵的组织样本、穿刺样本或法医取证的少量样本DNA、RNA共提取的方法依然是将细胞裂解液分成两部分，一部分用Trizol法(即硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法)提取RNA，一部分用酚-氯仿-异丙醇-乙酸氨法抽提或者是膜吸附柱的方法提取DNA和RNA。无论是Trizol法还是膜吸附柱法提取核酸，都是基于组织样本或者是穿刺样本，细胞数量远远超过100个。而对于临床微量细胞样本，当细胞数量只有5-20个，或细胞数量小于50个时，现有的技术方案并不适用于同时提取超微量细胞中的DNA和RNA。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法，以解决现有技术中难以对少于50个细胞的超微量样本进行核酸提取的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种核酸提取方法，该方法包括采用纳米磁珠对样本进行核酸提取，其中，样本为数量少于50个的细胞。
进一步地，核酸为DNA和/或RNA。
进一步地，上述方法包括：对样本进行裂解，得到第一裂解液；采用RNA纳米磁珠对第一裂解液进行RNA提取，得到RNA和第二裂解液；采用DNA纳米磁珠对第二裂解液进行DNA提取，得到DNA。
进一步地，上述方法包括：对样本进行裂解，得到第一裂解液；采用RNA纳米磁珠对第一裂解液进行RNA提取，得到纳米磁珠-RNA复合物和第二裂解液；依次用洗涤缓冲液A、洗涤缓冲液B以及洗脱缓冲液Ⅰ对纳米磁珠-RNA复合物进行洗涤和洗脱，得到RNA；采用DNA纳米磁珠对第二裂解液进行DNA提取，得到纳米磁珠-DNA复合物；依次用洗涤缓冲液C和洗脱缓冲液Ⅱ对磁珠-DNA复合物进行洗涤和洗脱，得到DNA。
进一步地，RNA纳米磁珠为oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠，DNA纳米磁珠为表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠；优选地，oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠为四氧化三铁超顺磁珠结构，更优选地，oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠的直径为400～800nm；优选地，表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠为四氧化三铁超顺磁珠结构，更优选地，表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠的直径500～600nm。
进一步地，采用细胞裂解液对样本进行裂解，得到第一裂解液；优选地，细胞裂解液、洗涤缓冲液A以及洗涤缓冲液B中的一种或多种含有TMAC，更优选地，TMAC的浓度为0.2M～2M；进一步优选地，细胞裂解液包括：100mM Tris-HCl、8～10mM EDTA、4～6mM SDS及2MTMAC；洗涤缓冲液A包括：10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl、10mM EDTA及2M TMAC，以及洗涤缓冲液B包括：10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl、1mM EDTA及0.2M TMAC。
进一步地，细胞裂解液、洗涤缓冲液A、洗涤缓冲液B、洗脱缓冲液Ⅰ以及洗涤缓冲液C的pH值均为7.3～7.8；优选地，洗脱缓冲液Ⅰ为10mM Tris-HCl，洗涤缓冲液C包括10mMTris-HCl、0.12～0.18M KCl及1mM EDTA；洗脱缓冲液Ⅱ为超纯水。
进一步地，上述方法包括：对样本进行裂解，得到第一裂解液；采用DNA纳米磁珠对第一裂解液进行DNA提取，得到DNA和第三裂解液；采用RNA纳米磁珠对第三裂解液进行RNA提取，得到RNA。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒，超微量细胞为数量少于50个的细胞，试剂盒包括纳米磁珠。
进一步地，纳米磁珠为DNA纳米磁珠和/或RNA纳米磁珠。
进一步地，RNA纳米磁珠为oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠，DNA纳米磁珠为表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠；优选地，oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠为四氧化三铁超顺磁珠结构，更优选地，oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠的直径为400～800nm；优选地，表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠为四氧化三铁超顺磁珠结构，更优选地，表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠的直径为500～600nm。
进一步地，试剂盒还包括以下任意一种或多种：细胞裂解液、RNA洗涤缓冲液、DNA洗涤缓冲液、RNA洗脱缓冲液以及DNA洗脱缓冲液。
进一步地，RNA洗涤缓冲液包括洗涤缓冲液A以及洗涤缓冲液B；优选地，细胞裂解液、洗涤缓冲液A以及洗涤缓冲液B中的一种或多种含有TMAC，更优选地，TMAC的浓度为0.2M～2M；进一步优选地，细胞裂解液包括：100mM Tris-HCl、8～10mM EDTA、4～6mM SDS及2MTMAC；洗涤缓冲液A包括：10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl、10mM EDTA及21M TMAC，以及洗涤缓冲液B包括：10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl、1mM EDTA及0.2M TMAC。
进一步地，DNA洗涤缓冲液为洗涤缓冲液C，RNA洗脱缓冲液为洗脱缓冲液Ⅰ，DNA洗脱缓冲液为洗脱缓冲液Ⅱ，细胞裂解液、洗涤缓冲液A、洗涤缓冲液B、洗脱缓冲液Ⅰ以及洗涤缓冲液C的pH值均为7.3～7.8；优选地，洗脱缓冲液Ⅰ为10mM Tris-HCl，洗涤缓冲液C包括10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl及1mM EDTA；洗脱缓冲液Ⅱ为超纯水。
应用本发明的技术方案，通过采用纳米磁珠对数量少于50个的细胞进行核酸提取，不仅能够实现超微量细胞核酸的提取，而且提取效率和纯度相对比较高。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明的实施例1所提取的RNA进行基因表达量检测的扩增曲线图；
图2示出了根据本发明的实施例1所提取的RNA进行基因表达量检测的CT值及标准曲线图；
图3示出了根据本发明的实施例1所提取的DNA所构建的文库的库检峰图；
图4示出了根据本发明的实施例2所提取的RNA进行EMT表达量检测结果图；以及
图5示出了根据本发明的实施例2所提取的DNA进行基因突变检测的结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
由于目前Trizol法及膜吸附柱的核酸提取方法都不适用于超微量细胞(数量少于50个的细胞)的提取，为改善这一现状，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种核酸提取方法，该方法包括：采用纳米磁珠对样本进行核酸提取，其中，样本为数量少于50个的细胞。
本申请的核酸提取方法，通过采用纳米磁珠对数量少于50个的细胞进行核酸提取，不仅能够实现超微量细胞核酸的提取，而且提取效率和纯度相对比较高。
在上述提取方法中，核酸提取不仅包括DNA的提取，也包括对RNA的提取。采用纳米磁珠可以实现对同一超微量细胞样本的DNA和RNA的提取。
在本申请的上述发明思想指导下，根据实际应用所需，选择合适的纳米磁珠实现对超微粒细胞样本的DNA和/或RNA进行提取。
在本申请一种优选的实施例中，上述核酸提取方法包括：对样本进行裂解，得到第一裂解液；采用RNA纳米磁珠对第一裂解液进行RNA提取，得到RNA和第二裂解液；采用DNA纳米磁珠对第二裂解液进行DNA提取，得到DNA。
上述方法通过对超微量细胞样本进行裂解后，分别采用对RNA特异性吸附的RNA纳米磁珠进行RNA提取，之后采用DNA特异性吸附的DNA纳米磁珠对剩余的裂解液进行DNA提取，从而实现从同一超微量细胞样本中提取得到DNA和RNA。该方法不仅实现超微量核酸的提取，而且提取效率和纯度相对比较高。
当然，剩余的裂解液用别的提取DNA的试剂盒(如柱提法、酚氯仿异丙醇抽提法)来提取DNA，也同样可以达到同时提取RNA和DNA的目的。
上述提取方法中在对细胞裂解后，也可以先向裂解液中加入DNA纳米磁珠实现DNA的提取，然后再采用RNA纳米磁珠从剩余的裂解液中提取得到RNA。即，对细胞裂解液中的DNA和RNA的提取先后顺序并无特殊要求，可以根据实际需要进行合理选择或调整。在一种更优选的实施例中，上述方法包括：对样本进行裂解，得到第一裂解液；采用DNA纳米磁珠对第一裂解液进行DNA提取，得到DNA和第三裂解液；采用RNA纳米磁珠对第三裂解液进行RNA提取，得到RNA。
在一种更优选的实施例中，上述方法包括：对样本进行裂解，得到第一裂解液；采用RNA纳米磁珠对第一裂解液进行RNA提取，得到纳米磁珠-RNA复合物和第二裂解液；依次用洗涤缓冲液A、洗涤缓冲液B以及洗脱缓冲液Ⅰ对纳米磁珠-RNA复合物进行洗涤和洗脱，得到RNA；采用DNA纳米磁珠对第二裂解液进行DNA提取，得到纳米磁珠-DNA复合物；依次用洗涤缓冲液C和洗脱缓冲液Ⅱ对磁珠-DNA复合物进行洗涤和洗脱，得到DNA。
通过采用两种不同的洗涤缓冲液A和B分别对纳米磁珠-RNA复合物进行洗涤，绝大部分杂质被冲洗掉，而后采用洗脱缓冲液I进行洗脱，所得到的RNA不仅得率高，而且纯度高。而DNA的洗涤和洗脱，较RNA的洗涤和洗脱条件而言相对宽松，因而采用现有的相关洗涤和洗脱试剂即可。
上述方法，可以实现对于珍贵临床超微量样本(比如5-10个细胞，或者＜50个细胞)DNA及RNA的共提取。首先在超微量样本的裂解液中加入如oligo(dT)序列共价结合的纳米磁珠，纳米磁珠与游离到裂解缓冲液中的mRNA形成磁珠-mRNA复合物，在磁场作用下转移至洗涤缓冲液中，洗涤去除磁珠-mRNA复合物上的杂质，在磁场作用下再转移至洗脱缓冲液中，洗脱回收目的mRNA，可将超微量样本中的mRNA捕获下来。
在同一超微量样本裂解液中再接着加入DNA超旋纳米磁珠，DNA磁珠与裂解液中的DNA核酸分子相结合，形成磁珠-DNA复合物，在磁场的作用下，经过洗涤和洗脱步骤将超微量样本中的DNA捕获下来。洗脱下来的DNA可直接用于基因组建库、测序分析等下步操作。
上述方法通过两步免疫磁珠法即可实现超微量细胞中DNA与RNA的共提取，有助于进一步对超微量样本细胞基因组及转录组表达进行分析，从而解决了从超微量细胞中同时提取DNA和RNA的技术难点。
上述方法中，RNA和DNA纳米磁珠可以从现有的适用于的纳米磁珠中选择得到。在一种优选的实施例中，RNA纳米磁珠为oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠，DNA纳米磁珠为表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠；优选地，oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠为四氧化三铁超顺磁珠结构，更优选地，oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠的直径为400～800nm；优选地，表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠珠为四氧化三铁超顺磁珠结构，更优选地，表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠的直径为500～600nm。
上述RNA纳米磁珠和DNA纳米磁珠具均匀、单分散微球及功能化表面，具有超强的顺磁性，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能够有助于磁分离地均匀分散的优点。上述结构的RNA纳米磁珠和DNA磁珠分别具有表面共价偶联了寡聚dT序列，利用磁珠表面的寡聚dT序列可以和mRNA的polyA尾之间的碱基配对，可以快速分离高纯度完整mRNA；表面羧基功能化可直接用于生物偶联DNA，提取更多DNA量的优点。选择在上述直径范围内的纳米磁珠具有实现分离和富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升的有益效果。
上述提取方法中，所用到的各种裂解试剂、洗涤试剂或洗脱试剂可以选择现有的相关试剂，也可以在现有相关试剂的基础上进行改进得到。在一种更优选的实施例中，采用细胞裂解液对样本进行裂解，得到第一裂解液；优选地，细胞裂解液、洗涤缓冲液A以及洗涤缓冲液B中的一种或多种含有TMAC(氯化四甲基胺)，更优选地，TMAC的浓度为0.2M～2M；进一步优选地，细胞裂解液包括：100mM Tris-HCl、8～10mM EDTA、4～6mM SDS及2M TMAC；所述洗涤缓冲液A包括：10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl、10mM EDTA及2M TMAC，以及所述洗涤缓冲液B包括：10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl、1mM EDTA及0.2M TMAC。
在裂解液和洗涤液中添加TMAC试剂，其作用与现有技术中将其用作PCR促进剂(用于去除非特异性扩增，并促进PCR)的作用不同，TMAC试剂在裂解液和洗涤液中有稳定核酸分子的作用，提高氢键结合稳定性，有助于提高mRNA的提取效率和提取纯度。而捕获下来的mRNA可用于细胞表达水平的检测。
在一种更优选的实施例中，细胞裂解液、洗涤缓冲液A、洗涤缓冲液B、洗脱缓冲液Ⅰ以及洗涤缓冲液C的pH值均为7.3～7.8；优选地，洗脱缓冲液Ⅰ为10mM Tris-HCl，所述洗涤缓冲液C包括10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl及1mM EDTA；洗脱缓冲液Ⅱ为超纯水。上述试剂的pH在7.3～7.8，更优选为7.5的情况下，有助于维持RNA和DNA的稳定性，使所提取的RNA和DNA结构相对完整。RNA采用10mM Tris-HCl来洗脱，有平衡洗脱液离子浓度和酸碱度的有益效果，而DNA采用超纯水进行洗脱即可保持DNA的纯度和稳定性。
在本申请另一种典型的实施方式中，提供了一种适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒，超微量细胞为数量少于50个的细胞，试剂盒包括纳米磁珠。本申请通过采用纳米磁珠实现了数量少于50个的细胞中的核酸的提取。
可以根据实际需要，可以选择DNA纳米磁珠或RNA纳米磁珠分别实现DNA和RNA的提取，同时，该试剂盒还可以优选上述纳米磁珠为DNA纳米磁珠和/或RNA纳米磁珠。
为了进一步提高相关纳米磁珠的提取效率和特异性，在一种优选的实施例中，RNA纳米磁珠为oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠，DNA纳米磁珠为表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠；优选地，oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠为四氧化三铁超顺磁珠结构，更优选地，oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠的直径为400～800nm；优选地，表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠珠为四氧化三铁超顺磁珠结构，更优选地，表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠的直径为500～600nm。
上述RNA纳米磁珠和DNA纳米磁珠具均匀、单分散微球及功能化表面的优点。上述结构的RNA纳米磁珠和DNA磁珠分别具有表面共价偶联了寡聚dT序列，利用磁珠表面的寡聚dT序列可以和mRNA的polyA尾之间的碱基配对，可以快速分离高纯度完整mRNA；表面羧基功能化可直接用于生物偶联DNA，提取更多DNA量的优点。选择在上述直径范围内的纳米磁珠具有实现分离和富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升的有益效果。
为了进一步提高试剂盒的使用便利性，在一种优选的实施例中，试剂盒还包括以下任意一种或多种：细胞裂解液、RNA洗涤缓冲液、DNA洗涤缓冲液、RNA洗脱缓冲液以及DNA洗脱缓冲液。当试剂盒中同时包含上述试剂时，便于直接利用试剂盒相关试剂即可实现超微量细胞DNA和RNA的共提取，便于对实现对细胞后续的相关分析或检测。
在一种优选的实施例中，RNA洗涤缓冲液包括洗涤缓冲液A以及洗涤缓冲液B；优选地，细胞裂解液、洗涤缓冲液A以及洗涤缓冲液B中的一种或多种含有TMAC，更优选地，TMAC的浓度为0.2M～2M；进一步优选地，细胞裂解液包括：100mM Tris-HCl、8～10mM EDTA、4～6mM SDS及2TMAC；洗涤缓冲液A包括：10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl、10mM EDTA及2MTMAC，以及洗涤缓冲液B包括：10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl、1mM EDTA及0.2M TMAC。
上述试剂盒中，在裂解液和洗涤液中添加TMAC试剂，其作用与现有技术中将其用作PCR促进剂(用于去除非特异性扩增，并促进PCR)的作用不同，TMAC试剂在裂解液和洗涤液中有稳定核酸分子的作用，提高氢键结合稳定性，有助于提高mRNA的提取效率和提取纯度。而捕获下来的mRNA可用于细胞表达水平的检测。并且，在洗涤缓冲液A以及洗涤缓冲液B中TMAC浓度逐渐降低，其作用在于降低洗涤液离子浓度。上述细胞裂解液相对现有技术中的细胞裂解液，具有增加与核酸分子结合强度的显著优势。
在一种优选的实施例中，DNA洗涤缓冲液为洗涤缓冲液C，RNA洗脱缓冲液为洗脱缓冲液Ⅰ，DNA洗脱缓冲液为洗脱缓冲液Ⅱ，细胞裂解液、洗涤缓冲液A、洗涤缓冲液B、洗脱缓冲液Ⅰ以及洗涤缓冲液C的pH值均为7.3～7.8；优选地，洗脱缓冲液Ⅰ为10mM Tris-HCl，洗涤缓冲液C包括10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl及1mM EDTA；洗脱缓冲液Ⅱ为超纯水。
上述试剂的pH在7.3～7.8，更优选为7.5的情况下，有助于维持RNA和DNA的稳定性，使所提取的RNA和DNA结构相对完整。RNA采用10mM Tris-HCl来洗脱，具有平衡洗脱液离子浓度和酸碱度的有益效果，而DNA采用超纯水进行洗脱即可保持DNA的纯度和稳定性。
在本申请一中最优选的实施例中，采用本申请的试剂盒及方法对超微量细胞进行DNA和RNA共提取的步骤如下：
(1)RNA的提取
A.所用到的试剂盒的成分：
细胞裂解液：100mM Tris-HCl；10mM EDTA；5mM SDS；2M TMAC(氯化四甲基胺)，pH7.5。
特异性吸附RNA的磁珠：oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠。
洗涤缓冲液A：10mM Tris-HCl；0.15M KCl；10mM EDTA；2M TMAC,pH 7.5。
洗涤缓冲液B：10mM Tris-HCl；0.15M KCl；1mM EDTA；0.2M TMAC,pH 7.5。
洗脱缓冲液Ⅰ：10mM Tris-HCl,pH 7.5。
B.具体提取步骤：
1.向超微量细胞中加入细胞裂解液，用移液枪反复吹打细胞20次，以充分裂解分离出超微量细胞中的DNA、RNA。将样本置于75℃金属浴或水浴锅中孵育5分钟。
2.将特异性吸附RNA的纳米磁珠加入上述已充分裂解的细胞液中，在混旋仪或摇床上孵育10分钟，使特异性吸附RNA的纳米磁珠与细胞裂解液中的RNA结合，形成磁珠-RNA复合物。
3.将管子从混旋仪或摇床上取出，放在迷你离心机上，离心3～5秒，使管盖及管壁上的磁珠及液体瞬离至管底，将管子放入磁力架，吸附磁珠-RNA复合物至磁铁面，待溶液至清澈后(约需吸附3～5分钟)，小心将剩余裂解液吸出至一个新的离心管中以用来提取DNA。此时旧管只剩下磁珠-RNA复合物。
4.向磁珠-RNA复合物管中加入洗涤缓冲液A，上下颠倒混匀后放在迷你离心机上，离心3～5秒，使管盖及管壁上的磁珠及液体瞬离至管底，将管子放入磁力架，待溶液至清澈后(约需吸附3～5分钟)，小心将洗涤缓冲液吸出。
5.用洗涤缓冲液B重复上步操作，再洗一遍磁珠-RNA复合物，吸干净洗涤缓冲液。
6.向磁珠-RNA复合物管中加入洗脱缓冲液Ⅰ，用移液抢反复吹吸磁珠复合物，并放在80℃恒温金属浴中孵育2分钟，然后将管子放入磁力架，待溶液至清澈后(约需吸附3～5分钟)，小心将洗脱缓冲液吸出至新的离心管，即得到了提取出的RNA，洗脱缓冲液可直接用于后续的反应。
7.洗脱下来的RNA可直接用于反转录及后续的荧光定量PCR。
(2)超微量细胞DNA的提取
A.所用到的试剂盒的成分：
特异性吸附基因组DNA的纳米磁珠：表面是羧基(-COOH)修饰的超顺纳米磁珠
洗涤缓冲液C：10mM Tris-HCl；0.15M KCl；1mM EDTA,pH 7.5
洗脱缓冲液Ⅱ：超纯水。
B.具体提取步骤：
1.将200μL DNA磁珠加入上一步吸出的装有裂解缓冲液的新管中，充分混匀后，室温下静置孵育5分钟，形成磁珠-DNA复合物。
2.将离心管放入磁力架中，静置3分钟，待溶液至清澈后，小心将剩余裂解液吸出丢弃，取出离心管，此时管中只剩下磁珠-DNA复合物。
3.向管中加入200μL洗涤缓冲液C后放入磁力架中静置，待溶液清澈后(约需吸附3～5分钟)，小心将洗涤缓冲液吸出。
4.重复上一步操作。吸干净洗涤缓冲液C。
5.将离心管从磁力架上取下，加入40μL洗脱缓冲液Ⅱ，用移液抢反复吹吸磁珠复合物，将管子放入磁力架，待溶液至清澈后，小心将洗脱缓冲液Ⅱ吸出至新的离心管，即提取得到了DNA，可直接用于后续的反应。
6.洗脱下来的DNA可直接用于基因组建库及测序分析。
需要说明的是，本申请在提取过程中用到的移液枪的枪头都是经过处理的无RNA酶、DNA酶的枪头，以避免降解。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。以下实施例均采用本申请所提供的试剂盒中的相关试剂进行相应操作。
实施例1
超微量乳腺癌细胞的DNA和RNA共提取
一、实验目的：同时提取5个MCF-7细胞、10个MCF-7细胞、20个MCF-7细胞、40个MCF-7细胞的RNA和DNA，并将RNA反转录后进行RT-PCR测试，DNA提取之后进行打断、扩增、建库、测序。
其中，5个和10个MCF-7细胞提取所用到的试剂盒的成分：
RNA纳米磁珠：oligo(dT)序列共价结合的四氧化三铁超顺纳米磁珠，直径400nm。
DNA纳米磁珠：表面是羧基修饰的四氧化三铁超顺纳米磁珠，直径500nm。
细胞裂解液：100mM Tris-HCl；8mM EDTA；4mM SDS；2M TMAC；pH＝7.3。
洗涤缓冲液A：10mM Tris-HCl；0.12M KCl；10mM EDTA；2M TMAC；pH＝7.3。
洗涤缓冲液B：10mM Tris-HCl；0.12M KCl；1mM EDTA；0.2M TMAC；pH＝7.3。
洗脱缓冲液Ⅰ：10mM Tris-HCl；
洗涤缓冲液C：10mM Tris-HCl、0.12M KCl及1mM EDTA；pH＝7.3。
洗脱缓冲液Ⅱ：超纯水。
20个和40个MCF-7细胞提取所用到的试剂盒的成分：
RNA纳米磁珠：oligo(dT)序列共价结合的四氧化三铁超顺纳米磁珠，直径800nm。
DNA纳米磁珠：表面是羧基修饰的四氧化三铁超顺纳米磁珠，直径600nm。
细胞裂解液：100mM Tris-HCl；10mM EDTA；6mM SDS；2M TMAC；pH＝7.8。
洗涤缓冲液A：10mM Tris-HCl；0.18M KCl；10mM EDTA；2M TMAC；pH＝7.8。
洗涤缓冲液B：10mM Tris-HCl；0.18M KCl；1mM EDTA；0.2M TMAC；pH＝7.8。
洗脱缓冲液Ⅰ：10mM Tris-HCl；
洗涤缓冲液C：10mM Tris-HCl、0.18M KCl及1mM EDTA；pH＝7.8。
洗脱缓冲液Ⅱ：超纯水。
二、实验步骤：
(一)提取超微量细胞RNA、反转录及PCR检测CK19、Her2、MUC1、β-actin的表达情况。
1)用口吸管分别在体式显微镜下吸取5个、10个、20个、40个培养消化后的MCF-7的细胞，分别放入到加有100μL细胞裂解液的无RNase管中，用移液枪反复吹打细胞20次，以充分裂解分离出超微量细胞中的DNA和RNA。将样本置于75℃金属浴或水浴锅中孵育5分钟。
2)将特异性吸附RNA的纳米磁珠加入上述已充分裂解的细胞液中，在混旋仪或摇床上孵育10分钟，使特异性吸附RNA的纳米磁珠与细胞裂解液中的RNA结合，形成磁珠-RNA复合物。
3)将管子从混旋仪或摇床上取出，放在迷你离心机上，离心3～5秒，使管盖及管壁上的磁珠及液体瞬离至管底，将管子放入磁力架，吸附磁珠-RNA复合物至磁铁面，待溶液至清澈后(约需吸附3～5分钟)，小心将剩余裂解液吸出至一个新的离心管中以用来提取DNA。此时旧管只剩下磁珠-RNA复合物。
4)向磁珠-RNA复合物管中加入洗涤缓冲液A，上下颠倒混匀后放在迷你离心机上，离心3～5秒，使管盖及管壁上的磁珠及液体瞬离至管底，将管子放入磁力架，待溶液至清澈后(约需吸附3～5分钟)，小心将洗涤缓冲液吸出。
5)用洗涤缓冲液B重复上步操作，再洗一遍磁珠-RNA复合物，吸干净洗涤缓冲液。
6)向磁珠-RNA复合物管中加入洗脱缓冲液Ⅰ，用移液抢反复吹吸磁珠复合物，并放在80℃恒温金属浴中孵育2分钟，然后将管子放入磁力架，待溶液至清澈后(约需吸附3～5分钟)，小心将洗脱缓冲液吸出至新的离心管，即得到了提取出的RNA，洗脱下来的RNA直接反转录。
7)反转录用的是qiagen的Sensiscript Reverse Transriptase kit，货号为205213。直接按说明书进行反转。
8)反转后的cDNA直接用Qiagen的SYBR试剂做RT-PCR检测特异性基因。
检测的相关基因的扩增曲线图如图1所示。相应基因检测的CT值及标准曲线见图2。从图1和图2可以看出：在样本量在几个或几十个细胞的范围内能够有效提取出RNA，且经过反转录成cDNA后，结果表明各个基因都可实现表达，且检测结果成梯度变化制成标准曲线，准确地反应了目的产物扩增，实现超微量细胞中RNA的高效提取。
(二)提取超微量细胞中的DNA
1)将200μL DNA磁珠加入上一步吸出的装有裂解缓冲液的新管中，充分混匀后，室温下静置孵育5分钟，形成磁珠-DNA复合物。
2)将离心管放入磁力架中，静置3分钟，待溶液至清澈后，小心将剩余裂解液吸出丢弃，取出离心管，此时管中只剩下磁珠-DNA复合物.
3)向管中加入200μL洗涤缓冲液C后放入磁力架中静置，待溶液清澈后(约需吸附3～5分钟)，小心将洗涤缓冲液C吸出。
4)重复上一步操作。吸干净洗涤缓冲液C。
5)将离心管从磁力架上取下，加入40μL洗脱缓冲液Ⅱ，用移液抢反复吹吸磁珠复合物，将管子放入磁力架，待溶液至清澈后，小心将洗脱缓冲液Ⅱ吸出至新的离心管，即得到了提取出的DNA，可直接用于后续的反应。
6)洗脱下来的DNA可直接用于基因组建库及测序分析。其中，提取的DNA经过打断、建库之后文库库检峰图见图3。从图3可以看出，利用本申请的方法和试剂盒所提取得到的DNA能够用于构建文库，且所构建的文库中目的片段的大小合适。
实施例2
外周血中循环结直肠癌肿瘤细胞的RNA和DNA共提取
一、实验目的：提取患者外周血中的循环结直肠癌肿瘤细胞的mRNA和DNA，检测GAPDH、β-actin基因的表达水平及基因是否有突变。
分别取5个、10个和15个细胞作为起始用量，其中，
(a)5个细胞提取所用到的试剂盒的成分为：
RNA纳米磁珠：oligo(dT)序列共价结合的四氧化三铁超顺纳米磁珠，直径800nm。
DNA纳米磁珠：表面是羧基修饰的四氧化三铁超顺纳米磁珠，直径500nm。
细胞裂解液：100mM Tris-HCl；7mM EDTA；4.5mM SDS；2M TMAC；pH＝7.4。
洗涤缓冲液A：10mM Tris-HCl；0.11M KCl；10mM EDTA；2M TMAC；pH＝7.4。
洗涤缓冲液B：10mM Tris-HCl；0.11M KCl；1mM EDTA；0.2M TMAC；pH＝7.4。
洗脱缓冲液Ⅰ：10mM Tris-HCl；
洗涤缓冲液C：10mM Tris-HCl、0.11M KCl及1mM EDTA；pH＝7.4。
洗脱缓冲液Ⅱ：超纯水。
注：三次重复试验，样本编号为A1～A3。
(b)10个细胞提取所用到的试剂盒的成分为：
RNA纳米磁珠：oligo(dT)序列共价结合的四氧化三铁超顺纳米磁珠，直径820nm。
DNA纳米磁珠：表面是羧基修饰的四氧化三铁超顺纳米磁珠，直径620nm。
细胞裂解液：100mM Tris-HCl；13mM EDTA；7mM SDS；2M TMAC；pH＝8.0。
洗涤缓冲液A：10mM Tris-HCl；0.2M KCl；10mM EDTA；2M TMAC；pH＝8.0。
洗涤缓冲液B：10mM Tris-HCl；0.2M KCl；1mM EDTA；0.2M TMAC；pH＝8.0。
洗脱缓冲液Ⅰ：10mM Tris-HCl；
洗涤缓冲液C：10mM Tris-HCl、0.2M KCl及1mM EDTA；pH＝8.0。
洗脱缓冲液Ⅱ：超纯水。
注：三次重复试验，样本编号为B1～B3。
(c)15个细胞提取所用到的试剂盒的成分为：
RNA纳米磁珠：oligo(dT)序列共价结合的氧化硅超顺纳米磁珠，直径800nm。
DNA纳米磁珠：表面是羧基修饰的氧化硅超顺纳米磁珠，直径500nm。
细胞裂解液：100mM Tris-HCl；7mM EDTA；4.5mM SDS；2M TMAC；pH＝7.4。
洗涤缓冲液A：10mM Tris-HCl；0.11M KCl；10mM EDTA；2M TMAC；pH＝7.4。
洗涤缓冲液B：10mM Tris-HCl；0.11M KCl；1mM EDTA；0.2M TMAC；pH＝7.4。
洗脱缓冲液Ⅰ：10mM Tris-HCl；
洗涤缓冲液C：10mM Tris-HCl、0.11M KCl及1mM EDTA；pH＝7.4。
洗脱缓冲液Ⅱ：超纯水。
注：三次重复试验，样本编号为C1～C3。
二、实验步骤：
(一)提取超微量细胞RNA、反转录及2100检测EMT表达
1)向分选或者磁珠捕获的外周血循环肿瘤细胞中加入试剂盒中的裂解缓冲液100μL，用移液枪反复吹打细胞20次，以充分裂解分离出超微量细胞中的DNA、RNA。将样本置于75℃金属浴或水浴锅中孵育5分钟。
2)将特异性吸附RNA的纳米磁珠加入上述已充分裂解的细胞液中，在混旋仪或摇床上孵育10分钟，使特异性吸附RNA的纳米磁珠与细胞裂解液中的RNA结合，形成磁珠-RNA复合物。
3)将管子从混旋仪或摇床上取出，放在迷你离心机上，离心3～5秒，使管盖及管壁上的磁珠及液体瞬离至管底，将管子放入磁力架，吸附磁珠-RNA复合物至磁铁面，待溶液至清澈后(约需吸附3～5分钟)，小心将剩余裂解液吸出至一个新的离心管中以用来提取DNA。此时旧管只剩下磁珠-RNA复合物。
4)向磁珠-RNA复合物管中加入洗涤缓冲液A，上下颠倒混匀后放在迷你离心机上，离心3～5秒，使管盖及管壁上的磁珠及液体瞬离至管底，将管子放入磁力架，待溶液至清澈后(约需吸附3～5分钟)，小心将洗涤缓冲液吸出。
5)向磁珠-RNA复合物管中加入洗涤缓冲B液100μL，上下颠倒混匀后放在迷你离心机上，离心3～5秒，使管盖及管壁上的磁珠及液体瞬离至管底，将所有溶液吸出至一个新的管子，然后将新管子放入磁力架，待溶液至清澈后(约需吸附3～5分钟)，小心将洗涤缓冲液吸出至旧管，然后吹打几次，再吸入新管，以免丢失。待溶液至清澈后(约需吸附3～5分钟)，小心将洗涤缓冲液吸出，然后再洗一遍，吸干净洗涤缓冲液。
6)向磁珠-RNA复合物管中加入13μl洗脱缓冲液Ⅰ，用移液抢反复吹吸磁珠复合物，并放在80℃恒温金属浴中孵育2分钟，然后将管子放入磁力架，待溶液至清澈后(约需吸附3～5分钟)，小心将洗脱缓冲液吸出至新的离心管，即得到了提取出的RNA，洗脱下来的RNA直接反转录。
7)反转录用的是qiagen的Sensiscript Reverse Transriptase kit，货号为205213。直接按说明书进行反转。
8)反转后的cDNA进行PCR扩增。PCR检测结直肠癌EMT的marker表达情况，其中，5个细胞起始量的结果见图4，其他起始量的结果见表1。
图4显示出了结直肠循环肿瘤细胞EMT的情况，从图4可以看出，本申请的方法及试剂盒所提取的RNA能够用于对目标基因的表达量检测。
(二)超微量细胞DNA的提取
1)将200μL DNA磁珠加入上一步吸出的装有裂解缓冲液的新管中，充分混匀后，室温下静置孵育5分钟，形成磁珠-DNA复合物。
2)将离心管放入磁力架中，静置3分钟，待溶液至清澈后，小心将剩余裂解液吸出丢弃，取出离心管，此时管中只剩下磁珠-DNA复合物.
3)向管中加入200μL洗涤缓冲液C后放入磁力架中静置，待溶液清澈后(约需吸附3～5分钟)，小心将洗涤缓冲液C吸出。
4)重复上一步操作。吸干净洗涤缓冲液C。
5)将离心管从磁力架上取下，加入40μL洗脱缓冲液Ⅱ，用移液抢反复吹吸磁珠复合物，将管子放入磁力架，待溶液至清澈后，小心将洗脱缓冲液Ⅱ吸出至新的离心管，即得到了提取出的DNA，可直接用于后续的反应。
6)洗脱下来的DNA扩增后可直接PCR突变检测。
7)一代测序检测基因突变，其中，5个细胞起始量的部分序列的测序结果见图5。
8)10个细胞和15个细胞起始的比较实施例中提取的DNA和RNA的检测结果见表1。
表1：
*cDNA，用来表征所提取的RNA。
上述表1示出了实施例2中RNA和DNA共提取产物的OD值及浓度检测结果。结果表明本发明的试剂盒提取得到的cDNA(表征RNA)和DNA的浓度最高，具有更好的提取得率。并且提取产物的纯度都在1.8～2.0之间，说明提取纯度较高，而其他试剂盒提取纯度不高，均有不同程度的污染，特别是用氧化硅超顺磁珠不能有效区分RNA和DNA，不适用于微量细胞的核酸提取。上述结果表明本发明提供的试剂盒可以完成超微量细胞的DNA和RNA共提取。
从以上的描述中，可以看出，本申请上述的实施例实现了如下技术效果：
1.本发明提供的利用特异性吸附RNA和DNA的纳米磁珠，提取RNA后的裂解液又用来提取DNA，分别从同一批微量细胞中提取出了RNA和DNA，充分利用了临床超微量样本，不需要将本来就很稀少的超微量样本分成两部分，一部分提取DNA，一部分提取RNA。能够节省稀少珍贵样本的使用量并节省核酸提取时间，同时提高提取的浓度和纯度。本申请所提供的试剂盒及方法简便快捷，适用于超微量细胞(5～20个，或者＜50个细胞)的DNA和RNA共提取。可同时用于检测超微量细胞中RNA和DNA的突变、拷贝数变异，以及同时分析同一个超微量样本中的基因转录水平及基因组水平的变化。
2.本申请采用特异性吸附RNA的磁珠提取细胞中的RNA,灵敏度比膜吸附柱以及异丙醇沉淀的灵敏度高，可以提取超微量细胞中的超微量的RNA，而膜吸附柱法及异丙醇沉淀法的灵敏度和特异性均达不到提取超微量细胞中RNA的要求。
3.本申请的提取DNA的方法为在提取完RNA后，直接在裂解液中加入特异性吸附DNA的磁珠提取DNA，不需要采用现有技术方法中的酚氯仿乙醇来提取DNA，避免了剧毒试剂的使用，而且也比膜吸附柱的灵敏度和特异性好，提取的纯度也较高，步骤也相对简单许多。
4.本申请的操作简单，检测时间短。只需要在超微量细胞中加入裂解液，吹打混匀后即裂解出细胞中的RNA和DNA。不需要经过Trizol、氯仿等有毒试剂抽提，并且不需要离心，将样本分为三层，简化了操作过程，节省时间，不需要复杂仪器及特别技巧。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种核酸提取方法，其特征在于，所述方法包括：采用纳米磁珠对样本进行核酸提取，其中，所述样本为数量少于50个的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸为DNA和/或RNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
对所述样本进行裂解，得到第一裂解液；
采用RNA纳米磁珠对所述第一裂解液进行RNA提取，得到RNA和第二裂解液；
采用DNA纳米磁珠对所述第二裂解液进行DNA提取，得到DNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
对所述样本进行裂解，得到所述第一裂解液；
采用RNA纳米磁珠对所述第一裂解液进行RNA提取，得到纳米磁珠-RNA复合物和第二裂解液；
依次用洗涤缓冲液A、洗涤缓冲液B以及洗脱缓冲液Ⅰ对所述纳米磁珠-RNA复合物进行洗涤和洗脱，得到所述RNA；
采用DNA纳米磁珠对所述第二裂解液进行DNA提取，得到纳米磁珠-DNA复合物；
依次用洗涤缓冲液C和洗脱缓冲液Ⅱ对所述磁珠-DNA复合物进行洗涤和洗脱，得到所述DNA。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述RNA纳米磁珠为oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠，所述DNA纳米磁珠为表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠；
优选地，所述oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠为四氧化三铁超顺磁珠结构，更优选地，所述oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠的直径为400～800nm；
优选地，所述表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠为四氧化三铁超顺磁珠结构，更优选地，所述表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠的直径500～600nm。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，采用细胞裂解液对所述样本进行裂解，得到所述第一裂解液；
优选地，所述细胞裂解液、所述洗涤缓冲液A以及所述洗涤缓冲液B中的一种或多种含有TMAC，
更优选地，所述TMAC的浓度为0.2M～2M；
进一步优选地，所述细胞裂解液包括：100mM Tris-HCl、8～10mM EDTA、4～6mM SDS及2M TMAC；所述洗涤缓冲液A包括：10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl、10mM EDTA及2M TMAC，以及所述洗涤缓冲液B包括：10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl、1mM EDTA及0.2M TMAC。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞裂解液、所述洗涤缓冲液A、所述洗涤缓冲液B、所述洗脱缓冲液Ⅰ以及所述洗涤缓冲液C的pH值均为7.3～7.8；
优选地，所述洗脱缓冲液Ⅰ为10mM Tris-HCl，所述洗涤缓冲液C包括10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl及1mM EDTA；所述洗脱缓冲液Ⅱ为超纯水。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
对所述样本进行裂解，得到第一裂解液；
采用DNA纳米磁珠对所述第一裂解液进行DNA提取，得到DNA和第三裂解液；
采用RNA纳米磁珠对所述第三裂解液进行RNA提取，得到RNA。
9.一种适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒，其特征在于，所述超微量细胞为数量少于50个的细胞，所述试剂盒包括纳米磁珠。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述纳米磁珠为DNA纳米磁珠和/或RNA纳米磁珠。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA纳米磁珠为oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠，所述DNA纳米磁珠为表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠；
优选地，所述oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠为四氧化三铁超顺磁珠结构，更优选地，所述oligo(dT)序列共价结合的超顺纳米磁珠的直径为400～800nm；
优选地，所述表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠为四氧化三铁超顺磁珠结构，更优选地，所述表面是羧基修饰的超顺纳米磁珠的直径为500～600nm。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下任意一种或多种：细胞裂解液、RNA洗涤缓冲液、DNA洗涤缓冲液、RNA洗脱缓冲液以及DNA洗脱缓冲液。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA洗涤缓冲液包括洗涤缓冲液A以及洗涤缓冲液B；
优选地，所述细胞裂解液、所述洗涤缓冲液A以及所述洗涤缓冲液B中的一种或多种含有TMAC，
更优选地，所述TMAC的浓度为0.2M～2M；
进一步优选地，所述细胞裂解液包括：100mM Tris-HCl、8～10mM EDTA、4～6mM SDS及2M TMAC；所述洗涤缓冲液A包括：10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl、10mM EDTA及21MTMAC，以及所述洗涤缓冲液B包括：10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl、1mM EDTA及0.2MTMAC。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA洗涤缓冲液为洗涤缓冲液C，所述RNA洗脱缓冲液为洗脱缓冲液Ⅰ，所述DNA洗脱缓冲液为洗脱缓冲液Ⅱ，所述细胞裂解液、所述洗涤缓冲液A、所述洗涤缓冲液B、所述洗脱缓冲液Ⅰ以及所述洗涤缓冲液C的pH值均为7.3～7.8；
优选地，所述洗脱缓冲液Ⅰ为10mM Tris-HCl，所述洗涤缓冲液C包括10mM Tris-HCl、0.12～0.18M KCl及1mM EDTA；所述洗脱缓冲液Ⅱ为超纯水。
CN201811595458.0A 2018-12-25 2018-12-25 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法 Active CN109439655B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811595458.0A CN109439655B (zh) 2018-12-25 2018-12-25 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811595458.0A CN109439655B (zh) 2018-12-25 2018-12-25 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109439655A true CN109439655A (zh) 2019-03-08
CN109439655B CN109439655B (zh) 2021-06-22

Family

ID=65538119

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811595458.0A Active CN109439655B (zh) 2018-12-25 2018-12-25 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109439655B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117143818A (zh) * 2023-10-25 2023-12-01 中国海洋大学三亚海洋研究院 提取海洋鱼脑或皮肤色素细胞组织细胞核的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104673783A (zh) * 2015-01-19 2015-06-03 宝瑞源生物技术(北京)有限公司 磁珠法提取病毒dna/rna的试剂盒以及使用方法
CN104805073A (zh) * 2015-04-21 2015-07-29 益百尚(北京)生物技术有限责任公司 一种用于病毒基因组核酸提取试剂盒及其方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104673783A (zh) * 2015-01-19 2015-06-03 宝瑞源生物技术(北京)有限公司 磁珠法提取病毒dna/rna的试剂盒以及使用方法
CN104805073A (zh) * 2015-04-21 2015-07-29 益百尚(北京)生物技术有限责任公司 一种用于病毒基因组核酸提取试剂盒及其方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WANG J 等: "Simultaneous extraction of DNA and RNA from hepatocellular carcinoma ( HepG2) based on silica-coated magnetic nanoparticles", 《JOURNAL OF NANOSCIENCE ＆ NANOTECH NOLOGY》 *
王珂 等: "ML-超微量磁珠法和Chelex-100法提取脱落细胞的比较研究", 《中国司法鉴定》 *
王颖希 等: "接触性检材的DNA自动化提取", 《刑事技术》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117143818A (zh) * 2023-10-25 2023-12-01 中国海洋大学三亚海洋研究院 提取海洋鱼脑或皮肤色素细胞组织细胞核的方法
CN117143818B (zh) * 2023-10-25 2024-01-30 中国海洋大学三亚海洋研究院 提取海洋鱼脑或皮肤色素细胞组织细胞核的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN109439655B (zh) 2021-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107893101B (zh) 一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒、方法及应用
CN108034658B (zh) 一种检测人葡萄膜黑色素瘤细胞的核酸适体
CN110191962A (zh) 外来体相关核酸的测序和分析
HUE019019T5 (en) Methods for Using miRNA for In vivo Cell Death Detection
CN107760675B (zh) 一种人粪便样本中脱落细胞dna的提取试剂盒及提取方法
CN106867996B (zh) 一种从胸水中提取cfDNA的方法、试剂盒以及构建的cfDNA文库
CN106845154B (zh) 一种用于ffpe样本拷贝数变异检测的装置
CN106967712A (zh) 粪便dna快速提取试剂盒
CN109371018A (zh) 用于游离循环肿瘤dna提取的增强剂、提取外周血中游离循环肿瘤dna的试剂盒及方法
CN106591313B (zh) 卵巢粘液性癌细胞3ao的核酸适配体wyz-1及其筛选方法和应用
CN111487404A (zh) 体液肿瘤细胞dna提取试剂盒
CN113667753B (zh) 用于肺癌诊断的试剂盒、装置及方法
CN105602938A (zh) 血浆cfDNA提取方法
US20120129251A1 (en) Method for deparaffinizing formalin-fixed paraffin-embedded tissue
CN109439655A (zh) 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法
CN107475441A (zh) 一种预测乳腺癌患者对at方案新辅助化疗的反应性的生物标记物
Di et al. Highly efficient and automated isolation technology for extracellular vesicles microRNA
CN107683335A (zh) 用于核酸分离的自动化方法
CN110317804A (zh) 从石蜡包埋组织中提取rna的方法及其试剂盒
CN106520773B (zh) 卵巢粘液性癌细胞3ao的核酸适配体wyz-3及其筛选方法和应用
CN107583052A (zh) miR‑6734‑5p在制备Luminal型乳腺癌诊断工具中的应用
CN113136415A (zh) 一种核酸提取方法及其用途
CN111705111A (zh) 一种改进的胃癌冷冻组织开放染色质检测方法
CN113308460A (zh) 一种提取石蜡切片中细菌dna的试剂盒
CN114457066B (zh) 一种dna提取方法、试剂盒以及构建的dna文库

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant