CN106967712A - 粪便dna快速提取试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了粪便DNA快速提取试剂盒，该提取试剂原理为：对所提取的粪便用粪便处理液进行前处理，离心除去粪便残渣和吸附去掉部分蛋白等杂质，用磁珠裂解液和蛋白酶K将核酸裂解释放出来，释放出来的核酸特异性的结合到混合了特异性探针的磁珠上，通过1轮洗涤液1和2轮洗涤液2的洗涤后，用洗脱液将核酸从磁珠上洗脱下来并把洗脱后的磁珠弃掉，最后得到粪便基因组。

Description

粪便DNA快速提取试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种粪便DNA快速提取试剂盒。

背景技术

结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。源发在结肠部位的癌细胞称为结肠癌，源发在直肠的称为直肠癌；两器官都受影响则称为结肠直肠癌。它是目前全球普遍可见的消化系统癌症，发病率近年来不断上升，其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。结直肠癌也是目前最可预防的肿瘤之一。它通常起源于结肠或直肠上皮的非癌性新生物“息肉”。如果通过筛查，早期发现并摘除，就能阻止它变成肿瘤。医学界认为，如果及早发现，肠癌是最易治愈的癌症。

目前，常用的结直肠癌早期诊断的方法有结肠镜检测、大便隐血检测、粪便RNA检测、粪便DNA检测。结肠镜检测法具有侵入性、肠道穿孔风险高的缺陷。大便隐血检测是非入侵性的，但是检测前需要控制饮食，而且检测灵敏度低、特异性差易出现误差。粪便DNA检测是无创的检测技术，但粪便DNA提取困难，操作繁琐，检测成功率低。所以迫切需要一种能够快速提取粪便DNA的试剂盒。

通过粪便DNA检测进行结直肠癌早期诊断，就要对粪便中的人基因组DNA进行高效提取。但是还有许多难题需要解决，比如，在样本的采集和分离过程中往往会因为 DNA酶的降解作用，各种酶阻抑剂（粘液、细菌和食物残渣等等）和胆盐的存在导致从粪便里提取出来的人体 DNA 产量非常少或者提取出的 DNA 杂质多而难以用于 PCR 扩增。为了解决这些难题，近年来也有许多的研究，通过多组提纯和扩增方法对照来改进 DNA 样本的质量。目前，粪便人基因组DNA的提取方法有：直接提取粪便中人基因组DNA和富集肠壁脱落细胞后提取人基因组DNA两类。其中直接提取粪便中人基因组DNA的方法又包含：柱式离心管吸附提取法以及电泳捕获法。

柱式离心管吸附提取法：虽然此方法操作简单，但特异性差，且样本处理量少。

电泳捕获法：处理量大、提取的DNA浓度和纯度高，但此法需要特殊的电泳装置且提取时间长。

富集肠壁脱落细胞后提取人基因组DNA：特异性好，提取的DNA浓度高，但提取过程细胞损失大，产量低。

发明内容

本发明的目的在于针对上面现有的技术缺陷，提出的一种快速、操作简单、高特异性、可配合中山大学达安基因股份有限公司的核酸自动提取仪Smart32进行自动提取的粪便DNA快速提取试剂盒。

粪便DNA快速提取试剂盒，包括：粪便处理液、探针磁珠、蛋白酶K、裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、96孔板、封板膜、磁棒套。

优选的，其中粪便处理液，是由1~3M 异硫氰酸胍、5%~15%chelex-100、1~3M BSU、0.05~0.2M IDU、0.3~0.8M glycine、0.1~0.3M bestain组成。

优选的，探针磁珠的磁性强，1-3秒即可彻底吸附，易分散，轻轻振荡即可实现单分散；表面结合了特异性探针，可特异性的和人基因组结合，更大程度的提高了核酸的纯度。

优选的，蛋白酶K的浓度为1~3mg/ml，不能直接和裂解结合液接触。

优选的，裂解结合液是由1~3M 胍盐、4~7M 三羟基氨基甲烷盐酸盐、2.5~4M 十四烷基硫酸钠混合而成。

优选的，洗涤液1含有1~3M的胍盐溶液，并含有体积浓度为35%~50%的醇溶液。

优选的,洗涤液2含有0.5~2M 三羟基氨基甲烷盐酸盐，并含有体积浓度为35%~50%的醇溶液。

优选的，洗脱液为1~3M 的盐酸盐溶液，PH：7~9。

优选的，粪便DNA快速提取试剂盒中的探针磁珠、裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、96孔板、封板膜组成了一个预分装板。

优选的，其中的预分装板上的排列如下：第一列（第七列）是裂解结合液，第二列（第八列）是磁珠，第三列（第九列）是洗涤液1，第四列（第十列）是洗涤液2，第五列（第十一列）是洗涤液2，第六列（第十二列）是洗脱液，配合磁棒套可配套自动提取仪进行提取。

其中自动提取仪所述程序的流程及原理为先在第二列（第八列）吸磁；从第二列（第八列）到第一列（第七列）进行裂解细胞释放出核酸，磁珠和释放出的核酸结合后；磁珠又被吸到第三列（第九列）进行洗涤，去除蛋白杂质等；磁珠又被吸到第四列（第十列）进行洗涤，去除离子等；磁珠又被吸到第五列（第十一列）再次进行洗涤，去除离子等；磁珠又被吸到第六列（第十二列）进行洗脱，将结合在磁珠上的核酸洗脱下来；最后将不含核酸的磁珠洗弃到第四列（第十列）。此时，第六列（第十二列）就是所提取的核酸，可立即用检测或者4℃暂时保存4小时或者-20℃长期保存。

所述上机程序，具体如下表：

表1

本发明的有益效果：

本发明具有高度自动化的优势，减少了人工操作的环节，有效地节省了时间。本试剂盒提取的核酸比传统的核酸提取方法，具有更高的纯度，且降低了成本。在配合自动化仪器下，可以实现大批量样本的自动化提取，更能突显出其优点。

具体实施方法

以下实施案例用于解释本发明，而并非限制本发明。

本说明书中公开的所有特征，除非特别叙述，均可被其他等效或者类似的特征所替换。

此次实验做了本发明与天根的粪便DNA提取试剂盒（柱提法）的比较，各提取了十个同样的样本。

实施过程：

粪便DNA快速提取试剂盒，提取步骤如下：

1.用灭菌的枪头或者灭菌刀片取180-250mg的粪便样本于1.5ml EP管中，置于冰上；

2.往EP管加入400ul 粪便处理液，在常温下振荡混匀，12000rpm 离心10min；

3.将粪便DNA快速提取试剂盒的预分装板从试剂盒取出，并1500rpm离心1分钟；

4.将经过粪便处理液处理后的上层水层，加入到粪便DNA快速提取试剂盒的预分装板的第一列（第七列）；

5.向第一列（第七列）加入50μl蛋白酶K；

6.上机，设置好上机程序，开始提取：

表2

7.程序运行完后，即提取完成，第六列（第十二列）即为提取好的核酸；

8.用Nanodrop 2000C 测核酸浓度，结果如下：

表3

结论：

通过表3中相同样本不同方法的核酸提取浓度比较，可以得出本发明提取的核酸比传统法提取的核酸更纯，浓度更高，并且人工操作少，减少操作难度和时间。

上述实施例只是对本发明方案的举例说明或解释，而不应理解为对本发明方案的限制，显然，本领域的技术人员可对本发明进行各种修改和变型而不脱离本发明的精神和范围。倘若这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则皆应属本发明的保护范围。

Claims (10)

1.粪便DNA快速提取试剂盒，包括：粪便处理液、探针磁珠、蛋白酶K、裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、96孔板、封板膜、磁棒套。

2.根据权利要求1所述的粪便DNA快速提取试剂盒，其特征在于：粪便处理液是由1~3M异硫氰酸胍、5%~15%chelex-100、1~3M BSU、0.05~0.2M IDU、0.3~0.8M glycine、0.1~0.3Mbestain组成。

3.根据权利要求1所述的粪便DNA快速提取试剂盒，其特征在于：磁珠的磁性强，1-3秒即可彻底吸附，易分散，轻轻振荡即可实现单分散；表面结合了特异性探针，可特异性的和人基因组结合。

4.根据权利要求1所述的粪便DNA快速提取试剂盒，其特征在于：蛋白酶K，为1~3mg/ml，不能直接和裂解结合液接触。

5.根据权利要求1所述的粪便DNA快速提取试剂盒，其特征在于：裂解结合液，是由1~3M胍盐、4~7M 三羟基氨基甲烷盐酸盐、2.5~4M 十四烷基硫酸钠混合而成。

6.根据权利要求1所述的粪便DNA快速提取试剂盒，其特征在于：洗涤液1：为1~3M的胍盐溶液，并含有体积浓度为35%~50%的醇溶液。

7.根据权利要求1所述的粪便DNA快速提取试剂盒，其特征在于：洗涤液2：为0.5~2M 三羟基氨基甲烷盐酸盐，并含有体积浓度为35%~50%的醇溶液。

8.根据权利要求1所述的粪便DNA快速提取试剂盒，其特征在于：洗脱液：1~3M 的盐酸盐溶液，PH：7~9。

9.根据权利要求1所述的粪便DNA快速提取试剂盒，其特征在于：探针磁珠、裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、96孔板、封板膜组成了一个预分装板。

10.根据权利要求9所述的粪便DNA快速提取试剂盒，其特征在于：预分装板的排列如下：第一列（第七列）是裂解结合液，第二列（第八列）是磁珠，第三列（第九列）是洗涤液1，第四列（第十列）是洗涤液2，第五列（第十一列）是洗涤液2，第六列（第十二列）是洗脱液，配合磁棒套可配套自动提取仪进行提取。