CN109929836A - 一种粪便人源基因组dna快速提取及纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因纯化检测技术领域，具体涉及一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法。本发明采用柱式离心管吸附对粪便上清中的基因组进行提取，操作简便快速，最大可提取20g的粪便，显著提高粪便总基因组得率，且人基因组占比显著高于现有的方法和成品试剂盒，采用本发明方法提取纯化得到的基因组纯度高，质量稳定。

Description

一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法

技术领域

本发明属于基因纯化检测技术领域，具体涉及一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法。

背景技术

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率高，且呈逐年上升的趋势。结直肠癌早期常无明显临床症状，就诊时大部分患者已进展为中晚期，所以早期诊断对于降低结直肠癌的发病率和致死率起到关键作用。

常用的结直肠癌早期诊断的方法有结肠镜检测、大便隐血检测、粪便RNA检测和粪便DNA检测等。结肠镜检测是诊断结直肠癌的常规方法，但是该方法具有侵入性，肠道穿孔风险高，且检测前需要肠道准备，操作繁琐。大便隐血检测虽为非侵入性检测，但检测前需控制饮食，且检测灵敏度低，特异性差，易出现误诊。粪便RNA检测和粪便DNA检测同为无创检测技术，由于粪便中人类核酸全部来自于肠壁脱落细胞，能够直观反映肠壁组织异常情况，因此极大的提高了检测特异性。然而，粪便RNA提取困难，操作繁琐，检测成功率低。粪便DNA检测无疑成为结直肠癌无创诊断的最佳手段。

粪便DNA大多来源于肠道细菌，人基因组含量很少。且粪便成分复杂，其中大量多糖、胆酸等成分会对下游反应产生抑制。目前，粪便人基因组的提取方法分为两类：直接提取粪便人基因组和富集肠壁脱落细胞后提取人基因组。

直接提取法可以同时提取到肠壁脱落细胞和散落在粪便中的人基因组，因此DNA损失少，产率高，适合应用于对DNA模板数量要求高的下游检测。主要包括三种方法：柱式离心管吸附提取法、磁珠捕获法和电泳捕获法。

富集肠壁脱落细胞后提取人基因组，能够保证提取的DNA全部来源于肠壁脱落细胞，特异性好，提取DNA产物浓度高，且粪便中的抑制成分去除彻底。但该方法只能提取到未凋亡脱落细胞中的DNA，而散落在粪便中的人基因组被遗失，且提取过程细胞损失大，故产率低，该方法适用于对提取产物纯度要求高的下游检测。主要包括三种方法：离心淘洗法、密度梯度离心法和免疫磁珠法。

目前常见的提取方法是先对粪便中的脱落细胞进行保存，在处理过程中先离心取沉淀，随后对沉淀进行裂解释放核酸，这种处理方式会使得得到的基因组DNA中，菌基因组DNA比例较高，人基因组含量在总基因组含量中的占比较低，且杂质不易去除，在后续采用硅胶膜纯化时，容易造成堵塞。大多数提取方法和成品试剂盒都是针对粪便中的菌基因组提取。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，本发明采用柱式离心管吸附对粪便上清中的基因组进行提取，操作简便快速，最大可提取20g的粪便，显著提高粪便总基因组得率，且人基因组占比显著高于现有的方法和成品试剂盒，采用本发明方法提取纯化得到的基因组纯度高，质量稳定。

本发明的粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，按照以下步骤进行：

(1)取出已装入粪便样本的粪便保存管，粪便样本和保存液混匀后至少保存4h；

(2)将粪便保存管放入离心机中离心取2～6mL上清，离心速度为2000-5000rpm，离心时间为5-10min，将上清转移至新的离心管中；

(3)在步骤(2)最终得到的上清中加入色素吸附沉淀剂，在30-40℃的条件下孵育处理10-20min，期间混匀数次；

(4)孵育完成后，离心取上清，离心速度为5000-8000rpm，离心时间5-10min，选择性再次离心取上清，离心速度为10000-14000rpm，离心时间3-5min；

(5)取步骤(4)最终得到的上清1-4mL 25-40℃条件下进行RNA消化，RNaseA用量为2-5mg，消化时间为10-20min；

(6)RNA消化结束后，加入4-8mg蛋白酶K进行蛋白质消化，加入0.5-1倍上清体积的缓冲液BS，55-65℃条件下进行消化，消化时间为10-20min，孵育结束后，冷却至室温，3000-5000rpm离心3-5min，取上清；

(7)加入0.5-1倍步骤(6)中上清体积的无水乙醇，颠倒混匀5-10次，将混合液转移至吸附柱中，4000-5000rpm离心1-3min，取上清；

(8)向步骤(7)得到的上清中加入洗涤液WB1 2mL，进行离心，离心速度4000-5000rpm，离心1-3min，离心结束后，倒去流出液，加入洗涤液WB2 2mL，进行离心，离心速度4000-5000rpm，离心1-3min，离心结束后，倒去流出液，重复洗涤1-3次，洗涤结束后，吸附柱室温干燥3-5min；

(9)吸附柱加入200-500μL洗脱液EB洗脱核酸，室温放置5-10min，使核酸充分的从吸附膜上剥离，进行离心，离心速度4000-5000rpm，离心1-3min；

(10)采用核酸纯化试剂盒进一步纯化离心后的核酸，得到纯化后的核酸。

(11)采用酶标仪对纯化后的粪便总基因组进行浓度和纯度测定，采用Q-PCR方法对人和菌的基因组含量进行测定。

其中，所述的粪便保存管的容量为30-60mL，要求密闭性较好且防爆，选择Axygen，Corning，ThermoFisher品牌产品。

所述的粪便样本用量为5-20g，是新鲜样本或冻存样本

所述的粪便保存液减少粪便细菌的裂解和繁殖，降低上清中菌基因组含量。

所述的步骤离心是在常温下进行。

所述的色素吸附沉淀剂采用硫酸铵和氯化钙、硫酸铝铵和醋酸铵、纤维素、PVPP或PVP10中的一组多个组合联合。

所述的洗脱液EB包含Tris-HCl成分，浓度为10mM，pH8.0。

所述的缓冲液BS的配方成分及浓度为：EDTA 50mM，NaCl 500mM，十二磺基硫酸钠1％，盐酸胍，pH 8.0。

所述的吸附柱从天根公司购买，特异性吸附核酸，最大装量达4mL。

所述的洗涤液WB1的配方成分及浓度为：盐酸胍1M，醋酸钠0.5M，无水乙醇30％。

所述的洗涤液WB2的配方成分及浓度为：无水乙醇75％。

所述的核酸纯化试剂盒是柱式腐殖酸清除剂、DNA Clean&concentrator-25(ZYMO)或醋酸钠和异丙醇。

所述的纯化后的核酸应用于酶切、PCR、荧光定量PCR、文库构建、Southern杂交、芯片检测和高通量测序类下游分子生物学实验。

所述的Q-PCR方法中人基因组采用GAPDH区域进行引物和探针设计，其序列如下：

GAPDH-F：5’-ATGGAGGTCCTCTTGTGTCC-3’

GAPDH-R：5’-TCCAACTACCCATGACTCAGC-3’

GAPDH-P：5’-TGGTGGCTGTGGCATGGTGCCAAG-3’

菌基因组采用16S区域的rDNA进行引物和探针设计，其序列如下：

Eub-F：5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’

Eub-R：5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’

Eub-P：5’-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’。

与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：

(1)本发明使用的保存液不仅可以常温保存运输，且在保存阶段即完成对细胞的裂解，且裂解成分主要针对人源细胞进行裂解，所以提取的基因组DNA中，人基因组DNA比例较高；硅胶膜纯化前已经是粗提的核酸，不再含有粒径较大的颗粒，可以有效避免堵塞硅胶膜的现象发生，所以提取前的预处理阶段为关键步骤。

(2)本发明所采用引物探针为针对人源和细菌的特异性区域设计的序列，且经过了大量的筛选和验证得到的特异性和扩增效率最佳的序列。能够准确的对总基因组DNA中的人源基因组DNA和菌基因组DNA进行定量。

(3)从本发明实施例总基因组浓度和纯度的对比结果表和总基因组Q-PCR检测对比结果表中可以看出，本发明提取的基因组总量更多，纯度也更高，且人基因组DNA占比显著高于对比试剂盒的占比，对于后续针对粪便中人源基因组DNA的筛查和检测，如肠癌筛查等具有更大优势。

(4)本发明的操作步骤较为简洁明了，操作简单，耗时短。

(5)本发明在处理步骤中采用的色素吸附沉淀剂，可以有效去除在提取中极难去除且对下游实验影响特别大的色素，有效提高提取核酸的纯度，降低对下游相关实验的抑制。

(6)与本发明方法步骤配合的粪便保存液，可以室温保存粪便样本长达一个月以上，且含有温和的裂解条件，可以针对性的裂解人源细胞，降低细菌的裂解，有效提高人源基因组DNA在总基因组DNA中的含量。

(7)本发明只需简单的离心取上清，即可得到富含人源基因组DNA的上清粗提液。

(8)本发明在提取步骤中，洗脱液EB洗脱后的核酸已满足普通PCR及荧光定量PCR的浓度和纯度要求，采用核酸纯化试剂盒进一步纯化后的核酸，纯度更高，杂质及盐离子进一步降低，可以满足高通量测序的要求。

(9)本发明提取中所采用的缓冲液BS和洗涤液WB1和WB2的组分及其含量和比例，可以更有效的对基因组DNA进行保护，维持基因组片段的长度，并可以有效提高基因组得率，降低杂质含量。

(10)本发明提取的粪便基因组纯度更高，更有利于后续的酶切、PCR、荧光定量PCR、文库构建、Southern杂交、芯片检测和高通量测序等各种下游分子生物学实验。

(11)本发明可以采用更大量粪便样本进行基因组提取，得率更高，可以起到人基因组的富集作用。

附图说明

图1是实施例1和实施例2 1％琼脂糖凝胶电泳检测结果；

其中1、3、5、7为实施例2提取后的粪便总基因组跑胶结果；2、4、6、8为实施例1纯化后粪便总基因组跑胶结果；

图2是实施例1和实施例3 1％琼脂糖凝胶电泳检测结果；

其中1、3、5、7为实施例3提取后的粪便总基因组跑胶结果；2、4、6、8为实施例1纯化后粪便总基因组跑胶结果；

图3是实施例1和实施例4 1％琼脂糖凝胶电泳检测结果；

其中1、2、3、4为实施例1纯化后的粪便总基因组跑胶结果；5、6、7、8为实施例4提取后粪便总基因组跑胶结果。

具体实施方式

现结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

1.1粪便保存和预处理

1.1.1取10g粪便样本放入粪便保存管中，充分和粪便保存液混匀，室温静置4h。

1.1.2室温3000rpm离心5min，转移4mL上清至新的离心管中。

1.1.3分别加入100mM的硫酸铵500μL和750mM的氯化钙500μL，上下颠倒数次混匀，37℃孵育15min。

1.1.4室温5000rpm离心5min，将上清转移至新的离心管中。

1.1.5室温12000rpm再次离心5min，将上清转移至新的离心管中。

1.2粪便总基因组提取

1.2.1加入30μL浓度为100mg/mL的RNaseA(购自天根)，上下颠倒混匀，37℃孵育15min。

1.2.2孵育结束后，加入200μL浓度为10mg/mL的蛋白酶K(购自Solarbio)，混匀，加入3mL的缓冲液BS，颠倒混匀后，65℃水浴15min，冷却至室温。

1.2.3加入3mL无水乙醇，上下颠倒混匀。

1.2.4将混合液转移至吸附柱中(购自天根，最大装量4mL)。室温下，4000rpm离心2min，弃上清。

1.2.5加入2mL洗涤液WB1，5000rpm离心1min，弃上清。

1.2.6加入2mL洗涤液WB2，5000rpm离心1min，弃上清。

1.2.7重复步骤1.2.6两次。结束后，吸附柱室温干燥3min。

1.2.8在吸附膜上加入300μL洗脱液EB，室温静置5min。

1.2.9室温5000rpm离心1min，流出液即为提取的粪便总基因组。

1.3纯化粪便总基因组。

1.3.1按照DNA Clean&concentrator-25(购自ZYMO)试剂盒的操作步骤，对提取的粪便总基因组进行纯化。

1.4浓度和纯度测定以及人和菌基因组含量测定。

1.4.1采用酶标仪对纯化后的粪便总基因组进行浓度和纯度测定。采用Q-PCR方法对人和菌的基因组含量进行测定。

实施例2

选取市场上常用的粪便基因组提取试剂盒，QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，实验样本与实施例1相同。

2.1粪便中总基因组提取和定量。

2.1.1按照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(购自QIAGEN，货号51604)试剂盒的操作步骤提取220mg粪便总基因组。

2.1.2采用酶标仪对提取后的粪便总基因组进行浓度和纯度测定。采用Q-PCR方法对人和菌的基因组含量进行测定，并计算人菌比。

实施例3

选取市场上常用的粪便基因组提取试剂盒，TIANamp Stool DNA Kit，实验样本与实施例1相同。

3.1粪便中总基因组提取和定量。

3.1.1按照粪便基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，购自天根，货号DP328-2)的操作步骤提取220mg粪便中的总基因组。

3.1.2采用酶标仪对提取后的粪便总基因组进行浓度和纯度测定。采用Q-PCR方法对人和菌的基因组含量进行测定，并计算人菌比。

实施例4

选取市场上常用的粪便基因组提取试剂盒，金麦格粪便基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)，实验样本与实施例1相同。

4.1粪便中总基因组提取和定量。

4.1.1按照金麦格粪便基因组DNA提取试剂盒(磁珠法，购自金麦格)的操作步骤提取200μL粪便上清中的总基因组。

4.1.2采用酶标仪对提取后的粪便总基因组进行浓度和纯度测定。采用Q-PCR方法对人和菌的基因组含量进行测定，并计算人菌比。

5.1其中人基因组采用GAPDH区域进行引物和探针设计，其序列如下：

GAPDH-F：5’-ATGGAGGTCCTCTTGTGTCC-3’

GAPDH-R：5’-TCCAACTACCCATGACTCAGC-3’

GAPDH-P：5’-TGGTGGCTGTGGCATGGTGCCAAG-3’

5.2其中菌基因组采用16S区域的rDNA进行引物和探针设计，其序列如下：

Eub-F：5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’

Eub-R：5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’

Eub-P：5’-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’

5.3电泳检测提取或纯化后的粪便总基因组，结果如图1～图3所示(M:1kbDNALadder(宝生物工程(大连)有限公司))。

5.4酶标仪对提取后的总基因组进行浓度和纯度测定。

表1：本发明和QIAGEN试剂盒提取的总基因组浓度和纯度的对比结果

表2：本发明和天根试剂盒提取的总基因组浓度和纯度的对比结果

表3：本发明和金麦格试剂盒提取的总基因组浓度和纯度的对比结果

5.5Q-PCR对人和菌的基因组含量进行测定。

表4：本发明和QIAGEN试剂盒提取的总基因组Q-PCR检测对比结果

表5：本发明和天根试剂盒提取的总基因组Q-PCR检测对比结果

表6：本发明和金麦格试剂盒提取的总基因组Q-PCR检测对比结果

从图1-图3可以看出，本发明提取和纯化后的粪便总基因组主带清晰明亮，与QIAGEN试剂盒，天根试剂盒以及金麦格试剂盒提取的粪便基因组主带一致。

从表1-表6可以看出，本发明提取和纯化后的粪便基因组总量较高，且OD260/OD280的范围在1.82-1.93，优于QIAGEN试剂盒提取的1.59-1.74，优于天根试剂盒提取的1.69-1.79，优于金麦格试剂盒提取的1.62-1.74。本发明提取的粪便基因组所含杂质更少，对后续的检测应用产生的抑制性更低，有利于得到更佳的结果。

从人基因组占比中也可以看出，本发明提取和纯化后的粪便总基因组中人基因组占比的范围在4.37％-10.92％，远远高于QIAGEN试剂盒提取的0.35％-0.68％，天根试剂盒提取的0.20％-0.47％，金麦格试剂盒提取的0.26％-0.39％，说明本发明对粪便中人基因组的提取有更强的特异性，这主要因为本发明采用的粪便保存液裂解性质温和，可以减少细菌的裂解，同时可强烈抑制微生物繁殖，且有利于人基因组的释放，在提取过程中也可以对人基因组起到进一步的富集作用。含有较高人基因组占比的粪便基因组对于应用于后续的基于粪便样本的早筛，如肠癌筛查等，具有很大优势。

虽然结合附图描述了本发明的实施方式，但是专利所有者可以在所附权利要求的范围之内做出各种变形或修改，只要不超过本发明的权利要求所描述的保护范围，都应当在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于按照以下步骤进行：

(1)取出已装入粪便样本的粪便保存管，粪便样本和保存液混匀后至少保存4h；

(2)将粪便保存管放入离心机中离心取2～6mL上清，离心速度为2000-5000rpm，离心时间为5-10min，将上清转移至新的离心管中；

(3)在步骤(2)最终得到的上清中加入色素吸附沉淀剂，在30-40℃的条件下孵育处理10-20min，期间混匀数次；所述的色素吸附沉淀剂采用硫酸铵和氯化钙、硫酸铝铵和醋酸铵、纤维素、PVPP或PVP10中的一组多个组合联合；

(4)孵育完成后，离心取上清，离心速度为5000-8000rpm，离心时间5-10min，选择性再次离心取上清，离心速度为10000-14000rpm，离心时间3-5min；

(5)取步骤(4)最终得到的上清1-4mL 25-40℃条件下进行RNA消化，RNaseA用量为2-5mg，消化时间为10-20min；

(6)RNA消化结束后，加入4-8mg蛋白酶K进行蛋白质消化，加入0.5-1倍上清体积的缓冲液BS，55-65℃条件下进行消化，消化时间为10-20min，孵育结束后，冷却至室温，3000-5000rpm离心3-5min，取上清；所述的缓冲液BS的配方成分及浓度为：EDTA 50mM，NaCl500mM，十二磺基硫酸钠1％，盐酸胍，pH 8.0；

(7)加入0.5-1倍步骤(6)中上清体积的无水乙醇，颠倒混匀5-10次，将混合液转移至吸附柱中，4000-5000rpm离心1-3min，取上清；

(8)向步骤(7)得到的上清中加入洗涤液WB1 2mL，进行离心，离心速度4000-5000rpm，离心1-3min，离心结束后，倒去流出液，加入洗涤液WB2 2mL，进行离心，离心速度4000-5000rpm，离心1-3min，离心结束后，倒去流出液，重复洗涤1-3次，洗涤结束后，吸附柱室温干燥3-5min；所述的洗涤液WB1的配方成分及浓度为：盐酸胍1M，醋酸钠0.5M，无水乙醇30％；

(9)吸附柱加入200-500μL洗脱液EB洗脱核酸，室温放置5-10min，使核酸充分的从吸附膜上剥离，进行离心，离心速度4000-5000rpm，离心1-3min；所述的洗脱液EB包含Tris-HCl成分，浓度为10mM，pH8.0；所述的洗涤液WB2的配方成分及浓度为：无水乙醇75％；

(10)采用核酸纯化试剂盒进一步纯化离心后的核酸，得到纯化后的核酸。

(11)采用酶标仪对纯化后的粪便总基因组进行浓度和纯度测定，采用Q-PCR方法对人和菌的基因组含量进行测定。

2.根据权利要求1所述的一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于所述的粪便保存管的容量为30-60mL，要求密闭性较好且防爆，选择Axygen，Corning，ThermoFisher品牌产品。

3.根据权利要求1所述的一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于所述的粪便样本用量为5-20g，是新鲜样本或冻存样本

4.根据权利要求1所述的一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于所述的粪便保存液减少粪便细菌的裂解和繁殖，降低上清中菌基因组含量。

5.根据权利要求1所述的一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于所述的步骤离心是在常温下进行。

6.根据权利要求1所述的一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于所述的吸附柱从天根公司购买，特异性吸附核酸，最大装量达4mL。

7.根据权利要求1所述的一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于所述的核酸纯化试剂盒是柱式腐殖酸清除剂、DNA Clean&concentrator-25(ZYMO)或醋酸钠和异丙醇。

8.根据权利要求1所述的一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于所述的纯化后的核酸应用于酶切、PCR、荧光定量PCR、文库构建、Southern杂交、芯片检测和高通量测序类下游分子生物学实验。

9.根据权利要求1所述的一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于所述的Q-PCR方法中人基因组采用GAPDH区域进行引物和探针设计，其序列如下：

GAPDH-F：5’-ATGGAGGTCCTCTTGTGTCC-3’

GAPDH-R：5’-TCCAACTACCCATGACTCAGC-3’

GAPDH-P：5’-TGGTGGCTGTGGCATGGTGCCAAG-3’

菌基因组采用16S区域的rDNA进行引物和探针设计，其序列如下：

Eub-F：5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’

Eub-R：5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’

Eub-P：5’-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’。