CN114250304A - 一种快速检测循环肿瘤dna基因突变的方法、系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药分析技术领域，具体公开了一种快速检测循环肿瘤DNA基因突变的方法、系统及其应用。本发明以BRAF V600E基因序列作为体外生物标志物，建立了基于三维DNA步行器和CRISPR/Cas12a的荧光检测策略。所述方法包括：采用三维DNA步行器识别和结合靶DNA，在核酸内切酶驱动下循环剪切轨道链S，产生的输出链OD与crRNA特异性结合，并激活Cas12a的非特异性反式裂解活性，从而切割信号报告分子，产生荧光信号进行检测。本发明提供了一个快速、灵敏、特异性好的ctDNA检测平台，在早期临床诊断和生物医学研究方面具有良好的潜力。

Description

一种快速检测循环肿瘤DNA基因突变的方法、系统及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药分析技术领域，特别是涉及一种快速检测循环肿瘤DNA基因突变的方法、系统及其应用。
背景技术
癌症是全球第二大死亡原因。据估计，到2030年，癌症病例数将增加到2460万，癌症死亡人数将增加到1300万。因此，早期诊断和治疗癌症对于降低癌症死亡率具有重要意义。常见的肿瘤标记物包括蛋白质，如癌胚蛋白、甲胎蛋白和前列腺特异性抗原，以及调节致癌基因的各种RNA和DNA。其中，直接来源于肿瘤或循环肿瘤细胞的循环肿瘤DNA(ctDNA)在外周血中以单链或双链DNA形式存在。ctDNA不仅在化学和生化稳定性方面优于RNA，而且比循环肿瘤细胞更容易从血液中分离出来，对检测更敏感。值得注意的是，ctDNA携带导致异常细胞增殖或分化的基因突变，提供了关于肿瘤分子特征的准确信息，并被认为可以用于监测较长半衰期的肿瘤状态。
目前，已有报道称多种ctDNA与不同的癌症密切相关。特别是超过80％的甲状腺乳头状癌患者的病例特征是位于人类7号染色体上的BRAF基因(V-raf小鼠肉瘤病毒癌基因同源基因B1)发生突变。BRAF V600E突变是指胸腺苷啶在1799核苷酸位置转化为腺嘌呤，导致600处残基缬氨酸取代为谷氨酸。研究表明，BRAF V600E突变与甲状腺乳头状癌的侵袭性行为、疾病复发和疾病特异性死亡率相关。因此，迫切需要一种敏感的技术来实现BRAF V600E的早期检测，以防止肿瘤的进展。
传统的检测ctDNA的分析技术包括聚合酶链反应、DNA测序、表面增强拉曼散射和DNA离合器探针等。然而，由于外周血中ctDNA丰度低，这些方法存在操作繁琐、检测时间长、成本高、易受生物环境干扰、假阳性或假阴性率高等局限性。
近年来，快速、简单的比色法、化学发光法、电化学法、电化学发光法等检测方法已被广泛应用于核酸的检测。其中，利用不同扩增策略的荧光方法(包括滚环扩增、链置换扩增和DNA分子机器等)受到了研究者越来越多的关注。例如，有研究团队提出了一种新的基于流式细胞术的传感策略，结合了无酶扩增和磁分离技术。但是这些方法仍存在不稳定性和易受环境干扰等缺点。
因此，仍需不断的进行研究，以开发出一种操作简单、方便快捷、稳定性好、不易受环境干扰、精确度高的ctDNA检测手段。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种快速检测循环肿瘤DNA基因突变的方法、系统及其应用，用于解决现有技术中ctDNA检测方法操作复杂、检测时间长、易受生物环境干扰、假阳性或假阴性率高等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种快速检测循环肿瘤DNA基因突变的方法，包括如下步骤：采用三维DNA步行器识别和结合靶DNA，在核酸内切酶驱动下循环剪切轨道链S，产生的输出链OD与crRNA特异性结合，并激活Cas12a的非特异性反式裂解活性，从而切割信号报告分子，产生荧光信号，以检测循环肿瘤DNA基因突变。
进一步，所述循环肿瘤DNA基因突变为循环肿瘤DNA BRAF V600E基因突变，即所述靶DNA，所述靶DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述三维DNA步行器包括包括步行链DW、轨道链S，以核酸内切酶为驱动力，所述步行链DW序列如SEQ ID NO.1所示：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGATTTCTCTGTAGCTAGACCAAACACGCCCGTCAGAGAAATCCTCAGC，
所述轨道链S序列如SEQ ID NO.2所示：
TTTTTTTTTTGCTGAGGATATGAACCAACCAAACAAT。
进一步，所述核酸内切酶为限制性核酸内切酶Nb.BbvCI。
进一步，所述crRNA序列如SEQ ID NO.4所示：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUUGUUUGGUUGGUUCAUAU。
进一步，所述信号报告分子序列如SEQ ID NO.5所示：TTATT。
进一步，所述信号报告分子的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团；优选地，所述荧光基团包括但不限于HEX、FAM、CY5和TAMRA等，所述猝灭基团包括但不限于BHQ1、BHQ3、MGB、IOWA等。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)将生物素修饰的步行链DW变性后形成发夹结构，然后将生物素修饰的轨道链S和发夹状DW加入到含链霉亲和素磁珠的结合缓冲液中，孵育形成DW-S-MBs混合液；接着用TE缓冲液通过磁分离洗涤磁珠，并用TE缓冲液重悬后形成纯化的DW-S-MBs溶液；
(2)将DW-S-MBs纯化溶液、靶DNA、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶缓冲液混合反应，以触发三维DNA步行器扩增反应；
(3)使用磁分离后的上清液触发CRISPR/Cas12a荧光反应系统，并灭活Cas12a蛋白；
(4)最后通过测量荧光信号强度获得靶DNA的浓度。
进一步，所述步骤(1)中，将生物素修饰的步行链DW在95℃水浴条件下变性，形成发夹结构；优选地，变形时间为5分钟。
进一步，所述步骤(1)中，轨道链S和发夹状DW的摩尔比为(5～40)：1，优选为(5～20)：1，更优选为10:1。
进一步，所述步骤(1)中，将生物素修饰的轨道链S和发夹状DW加入到含链霉亲和素磁珠的结合缓冲液中，在金属浴中振荡孵育形成DW-S-MBs混合液。
进一步，所述步骤(1)中，孵育温度为37℃，孵育时间为30～60分钟，优选为40分钟。
进一步，所述步骤(1)中，所述结合缓冲液包含以下成分：20mM Tris、1M NaCl、1mMEDTA、pH 7.5，0.0005％TritonX·100。
进一步，所述步骤(1)中，所述TE缓冲液包含以下成分：10mmol L-1Tris·HCl，1mmol L-1EDTA，pH 8.0。
进一步，所述步骤(1)中，所述含链霉亲和素磁珠的结合缓冲液制备方法包括如下步骤：将链霉亲和素磁珠原液用结合缓冲液洗涤，然后将洗涤过的磁珠悬浮在结合缓冲液中。
进一步，所述步骤(2)中，限制性核酸内切酶的浓度为5～15U，优选为7～12.5U，更优选为7.5～10U，最优选为7.5U。
进一步，所述步骤(2)中，反应时间为20～60分钟，优选为30～40分钟，更优选为40分钟。
进一步，所述步骤(3)中，所述CRISPR/Cas12a荧光反应系统包含：Cas12a、CRISPR·crRNA、10×NEBuffer、信号报告分子Reporter和RNase抑制剂；优选地，所述CRISPR/Cas12a荧光反应系统包含：Cas12a(1μM、1μL)、CRISPR·crRNA(1μM、1μL)、10×NEBuffer 2.1(6μL)、信号报告分子Reporter(25μM、1μL)和RNase抑制剂(20U)。
进一步，所述步骤(3)包括如下步骤：使用经过磁分离后的上清液触发CRISPR/Cas12a荧光反应系统，在37℃孵育25分钟，然后在95℃下终止反应5分钟，以灭活Cas12a。
进一步，所述步骤(4)中，使用荧光分光光度计测量荧光信号强度，测量参数为：激发波长525nm，发射波长范围为540nm至640nm，激发和发射的狭缝分别设置为5nm和10nm，检测电压为600V，556nm处的荧光强度用来量化靶DNA的浓度。
本发明第二方面提供一种三维DNA步行器，用于检测循环肿瘤DNA基因突变，包括步行链DW、轨道链S，以核酸内切酶为驱动力，所述步行链DW序列如SEQ ID NO.1所示：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGATTTCTCTGTAGCTAGACCAAACACGCCCGTCAGAGAAATCCTCAGC，
所述轨道链S序列如SEQ ID NO.2所示：
TTTTTTTTTTGCTGAGGATATGAACCAACCAAACAAT。
进一步，所述核酸内切酶为限制性核酸内切酶Nb.BbvCI。
本发明第三方面提供一种用于检测循环肿瘤DNA基因突变的系统，包括第二方面所述的三维DNA步行器，还包括CRISPR/Cas12a荧光反应系统，所述CRISPR/Cas12a荧光反应系统包含：Cas12a、CRISPR·crRNA、10×NEBuffer、信号报告分子Reporter和RNase抑制剂。
进一步，所述CRISPR/Cas12a荧光反应系统包含：Cas12a(1μM、1μL)、CRISPR·crRNA(1μM、1μL)、10×NEBuffer 2.1(6μL)、信号报告分子Reporter(25μM、1μL)和RNase抑制剂(20U)。
本发明第四方面提供根据第一方面所述的方法在制备用于检测循环肿瘤DNA基因突变的试剂中的应用。
本发明第五面提供根据第二方面所述的三维DNA步行器在制备用于检测循环肿瘤DNA基因突变的试剂中的应用。
本发明第六方面提供根据第三方面所述的系统在制备用于检测循环肿瘤DNA基因突变的试剂中的应用。
如上所述，本发明的快速检测循环肿瘤DNA基因突变的方法、系统及其应用，具有以下有益效果：
本发明选择BRAF V600E基因序列作为体外生物标志物，建立了基于三维DNA步行器和CRISPR/Cas12a的荧光检测策略。在靶DNA存在的情况下，三维DNA步行器可识别和结合，在特异性内切酶(Nb.BbvCI)驱动下循环剪切轨道链S，产生的输出链OD与crRNA特异性结合，并激活Cas12a的非特异性反式裂解活性，从而切割信号报告基因探针(即信号报告分子Reporter)，产生显著增强的荧光信号。
本发明提供的循环肿瘤DNA基因突变检测方法结合了三维DNA步行器强大的扩增能力和CRISPR/Cas12a的高特异性和可编程性，整个过程最多只需要70分钟。本方法可在1fM～20nM范围内检测BRAF V600E，检测限为0.37fM。此外，本方法有可能用于人血清中靶DNA的检测。其他的肿瘤生物标志物可以通过改变捕获的探针的序列来检测。
综上所述，本发明不仅为快速检测ctDNA提供了一个良好的平台，而且在早期临床诊断和生物医学研究方面显示出了良好的潜力。
附图说明
图1为本发明基于三维DNA步行器和CRISPR/Cas12a系统的荧光扩增策略用于BRAFV600E基因的检测的流程示意图。
图2为本发明的荧光放大策略的可行性分析结果图。(A)荧光扩增策略的12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图像(靶DNA的浓度为0.1μM)。(B)荧光信号响应于三维DNA步行器和CRISPR/Cas12a的荧光方法的可行性图像。
图3为本发明实施例中的检测方法的实验条件优化结果图。(A)S和DW比值的优化。(B)Nb.BbvCI浓度的优化。(C)Nb.BbvCI反应时间的优化。(D)Nb.BbvCI不同反应时间的荧光信号强度差异(ΔF＝F-F0，其中F和F0分别表示靶DNA存在和不存在时产生的荧光信号强度)。本实验均采用1μM的靶DNA浓度。误差棒表示从三次测试中获得的测量值的标准偏差。
图4为本发明实施例中的检测方法的特异性分析结果图。(A)突变型靶DNA(BRAFV600E)和野生型DNA(BRAF)在不同比例下的荧光信号强度差异(ΔF＝F-F0，其中F和F0分别表示突变型靶DNA存在和不存在时产生的荧光信号强度，野生型DNA的浓度固定为10nM)。(B)本发明的荧光方法对几种不同靶类似序列的荧光信号进行响应图像。误差棒表示从三次测试中测量值的标准偏差。
图5为本发明实施例中的检测方法的可重复性和稳定性分析结果图。(A)三维DNA步行器对不同浓度靶DNA样品3次检测的重复性。(B)三维DNA步行器在4℃下保存11天的稳定性。误差棒表示从三次测试中获得的测量值的标准偏差。
图6为本发明实施例中的检测方法的灵敏度分析结果图。(A)设计的荧光扩增策略对不同浓度的靶DNA的荧光信号强度(从a～k分别为0、1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、100pM、1nM、10nM、20nM、100nM、1μM)。(B)绘制了荧光强度与1fM～20nM之间不同浓度的靶DNA之间的关系图。插图显示了荧光强度与靶DNA浓度在1fM～20nM之间的不同对数的相应校准曲线。误差棒表示从三次测试中获得的测量值的标准偏差。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明提供了一种快速检测循环肿瘤DNA基因突变的方法，基于三维DNA步行器和CRISPR/Cas12a荧光反应系统的高灵敏度和选择性来实现患者样本中低丰度ctDNA的检测。
具体地，本发明选择BRAF V600E基因序列作为体外检测的生物标志物，采用三维DNA步行器对靶DNA进行鉴定和结合。在特异性核酸内切酶(Nb.BbvCI)介导的循环剪切作用下，三维DNA步行器被迅速驱动，将少量靶DNA转化为大量输出链OD。输出链OD与crRNA特异性结合可激活Cas12a的非特异性反式切割活性，从而切割信号报告分子。最后，利用荧光分光光度计检测荧光信号强度。值得注意的是，本发明中信号报告分子被设计为只包含5个碱基的寡核苷酸单链，由于距离较短，荧光猝灭效应很强，背景信号很低。在此基础上，本发明的实验方案为ctDNA的临床诊断和生化研究提供了一种很有前途的生物分子检测方法。
下面具体的例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行具体的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
以下涉及到的三维DNA步行器的步行链DW和轨道链S是已设计好有7个碱基互补配对的序列，并通过5’端修饰生物素稳定的连接到链霉亲和素包被的磁珠上。5’端到3’端序列依次是：
步行链DW：
Bio-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGATTTCTCTGTAGCTAGACCAAACACGCCCGTCAGAGAAATCCTCAGC；
轨道链S：Bio-TTTTTTTTTTGCTGAGGATATGAACCAACCAAACAAT；
轨道链S-FAM：
Bio-TTTTTTTTTTGCTGAGGATATGAACCAACCAAACAAT-FAM。
涉及到的靶DNA(BRAF V600E基因)为含有突变位点(T碱基突变为A碱基)的21个碱基序列。5’端到3’端序列依次是：
靶DNA：TGGTCTAGCTACAGAGAAATC。
涉及到的CRISPR·RNA(crRNA)是含有一段短回文序列的41个碱基的RNA序列。5’端到3’端序列依次是：
crRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUUGUUUGGUUGGUUCAUAU。
涉及到的信号报告分子被设计为只包含5个碱基的寡核苷酸单链，一端用荧光基团(HEX)修饰，另一端用淬灭基团(BHQ1)修饰。5’端到3’端序列依次是：
信号报告分子Repoter：HEX-TTATT-BHQ1。
涉及到的链霉亲和素包被的磁珠(直径1μm，浓度4mg mL-1)、限制性核酸内切酶(Nb.BbvCI)和
Figure BDA0003462533320000081
缓冲液以及
Figure BDA0003462533320000082
Lba Cas12a(Cpf1)核酸酶和10×NEBuffer2.1均购自新英格兰实验室(北京，中国)。
具体实施过程如下：
1、三维DNA步行器的制备
如图1所示，首先，将三维DNA步行器上的已由生物素修饰的步行链DW和轨道链S的DNA干粉在4℃离心机中设置12000rpm离心10分钟，并分别溶解在TE缓冲液(10mM Tris·HCl、1mM EDTA，pH＝8.0)中，以得到10μM的原液，各三次3分钟冰上溶解混匀后储存在-20℃备用。将50μL的链霉亲和霉磁珠原液准确地移液到放入磁分离架上的离心管中。磁珠用50μL结合缓冲液(20mM Tris、1M氯化钠、1mM EDTA、pH 7.5，0.0005％Triton X·100)磁分离洗涤3次，弃去上清液。接着，将洗涤过的磁珠悬浮在50μL的结合缓冲液中。此外，将生物素修饰的步行链DW在95℃的水浴中变性5分钟，然后缓慢冷却到室温，形成发夹结构，4℃保存后使用。然后，将9μL的轨道链S(10μM)和1.8μL发夹状DW(5μM)加入洗涤过的磁珠溶液中，在金属浴中37℃孵育40分钟。由于链霉亲和素和生物素之间的特异性相互作用，生物素修饰的DNA可以稳定地与磁珠结合，形成DW-S-MBs的混合物。再用50μL TE缓冲液通过磁分离洗涤组合磁珠5次。最后，用等体积的TE缓冲液重悬，形成纯化的DW-S-MBs溶液，4℃保存后使用。
2、荧光信号检测
如图1所示，首先，加入2μL DW-S-MBs纯化溶液、不同浓度的靶DNA(1μL)、Nb.BbvCI(7.5U)和10×CutSmart缓冲液(5μL)触发三维DNA步行器扩增反应。在体积不足的地方补充了超纯水，最终体积为50μL。接着，将三维DNA步行器在37℃下孵育40分钟。然后，使用磁分离反应液触发CRISPR/Cas12a系统的荧光反应，CRISPR/Cas12a系统包含Cas12a蛋白(1μM、1μL)、CRISPR·crRNA(1μM、1μL)、10×缓冲液2.1(6μL)、荧光探针Reporter(25μM、1μL)和RNase抑制剂(20U)。随后在37℃孵育25分钟。再在95℃下终止反应5分钟，以灭活Cas12a蛋白。最后，用荧光分光光度计测量荧光信号强度。
3、荧光方法的表征
将三维DNA步行器和CRISPR/Cas12a系统的产物分别与2μL 6×loading buffer混合进行12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用1×TBE缓冲液(89mM硼酸；1mM EDTA；pH 8.3)在120V恒定电压下分析40分钟。电泳后，摇晃凝胶，在室温下用GelredⅢ核酸染色40分钟，最后用Bio-rad ChemDocXRS系统成像。
结果如图2A所示，第1道的条带代表靶DNA(100nM)；第2道的条带表明，当添加靶DNA和步行器时，由于靶DNA和步行器的结合，靶DNA条带变得较浅；3号泳道是步行器和Nb.BbvCI；第4泳道的条带为靶DNA、步行器和Nb.BbvCI反应后的产物，即输出链OD。从图2A中看到，靶DNA带上方出现一条较深的条带。这一结果表明，靶DNA可以激活由内切酶驱动的三维DNA步行器。当加入CRISPR/Cas12a系统时，观察到第5道的输出链OD条带变浅，表明crRNA与输出链OD结合并激活了Cas12a的顺式切割活性。上述结果说明了三维DNA步行器的成功构建。
同时，荧光法还证明了本发明方法的可行性，结果如图2B所示，当三维DNA步行器与CRISPR/Cas12a系统结合时，荧光信号强度随着靶DNA的存在而显著增加。这可能是因为Cas12a具有较强的敏感性。然而，没有靶DNA或内切酶，荧光信号也增加。可能的原因是悬浮液中存在剩余的未结合S链，导致空白组的荧光信号增加。
优化实验参数
由于最终荧光信号强度与激活的Cas12a的存在和浓度直接相关，而激活的Cas12a又取决于内切酶驱动的三维DNA步行器产生的输出链OD的浓度，因此本实施例优化了一些实验条件以获得最佳的检测性能，包括构成步行器的S和DW的比值、Nb.BbvCI的浓度和反应时间。
首先，S链不仅是输出链的直接来源，而且也是三维DNA步行器的可裂解底物。固定在磁珠上的S和DW的比值可能直接影响步行器的效率，因此S和DW的比值是一个关键因素。为了明确比值的影响，将S浓度固定在1800nM，DW浓度分别固定在360nM、180nM、90nM、60nM和45nM。如图3A所示，当DW为180nM时，即S与DW的比值为10：1时，荧光信号强度达到最大值。当S链浓度增加时，荧光信号的降低，可能是由于同一磁珠上高密度DNA链之间的电荷排斥和空间位阻效应所致。因此，所有后续实验均选择了10：1的比例(S：DW)。
其次，Nb.BbvCI也是三维DNA步行器的重要组成部分，其浓度和反应时间对提高步行器的效率至关重要。如图3B所示，荧光强度随着Nb.BbvCI浓度的增加而增加。当Nb.BbvCI的浓度升高时为7.5U时，荧光强度达到最大值。然而，当Nb.BbvCI的浓度持续增加，荧光信号趋于稳定，这可能是由于酶浓度过饱和所致。因此，本实验以7.5U作为Nb.BbvCI的最佳浓度，确保了检测方法的良好性能。
最后，对Nb.BbvCI的反应时间进行了优化。在图3C中，随着反应时间的增加，荧光信号强度也在增加。荧光差值(ΔF、ΔF＝F-F0，其中F和F0分别表示靶DNA存在和不存在情况下产生的荧光信号的强度)在40分钟时达到最大值(图3D)。随着反应时间的延长，信噪比迅速降低，可能是由靶DNA触发更多的DW，进而释放更多的输出链OD。因此，背景荧光信号也迅速增加。上述结果表明，40分钟是本发明方法的最佳响应时间。
5、构建的荧光方法的特异性、可重复性和稳定性验证
首先，在最佳实验条件下，结合CRISPR/Cas12a系统评估突变型靶DNA和野生型DNA(单碱基错配DNA)的不同比例以验证特异性。将10nM野生型DNA与不同浓度的突变型靶DNA混合，形成不同浓度比的异质样品，分别为1:100000，1:10000，1:1000，1:100，1:10和1:1，然后进行荧光信号检测。如图4A所示，荧光信号差值与突变型靶DNA的含量呈正相关。当突变型靶DNA和野生型DNA的比值高达1：100000时，突变型靶DNA仍然可以与异质样本区分开来。
同时，检测本发明的荧光策略对不同序列的多个靶标类似物的荧光信号响应以验证特异性，包括单碱基错配DNA(野生型靶DNA)、双碱基错配DNA、三碱基错配DNA和非互补DNA。所有DNA序列均列于表1中，且浓度均为10nM。从图4B可以看出，突变型靶DNA的荧光信号强度明显高于其他DNA序列，说明本发明的检测方法可以区分碱基错配序列，识别非互补序列。
上述结果清楚地表明，本发明的荧光策略具有高序列特异性。
表1
Figure BDA0003462533320000101
Figure BDA0003462533320000111
然后，对1pM、100pM和10nM的靶DNA样本进行3次重复检测实验，以验证本发明的检测方法的可重复性。如图5A所示，三种不同浓度的靶DNA检测结果的相对标准差分别为0.20％、0.53％和0.35％。上述结果表明，本发明的检测方法具有良好的可重复性。
最后，将合成的三维DNA步行器在4℃下保存相应的天数，对靶DNA进行荧光检测，以验证其稳定性。如图5B所示，观察到11天试验中荧光信号强度无显著变化，相对标准差(RSD)为0.99％。上述结果表明，本发明合成的三维DNA步行器在长期存储过程中具有良好的稳定性。
6、验证本发明荧光方法的分析性能
度对不同浓度的靶DNA进行荧光定量检测，以验证其灵敏度。荧光光谱响应图如图6A所示，随着靶DNA浓度在0～1μM之间的变化，荧光强度逐渐增强。据此绘制了荧光信号强度与靶DNA浓度的关系曲线，如图6B所示，1fM～20nM范围内的靶DNA浓度的对数值与荧光强度有良好的线性关系，回归方程表示为F＝26.39548LgC(fM)+441.96191，相关系数为0.999。同时，根据3σ规则，计算检测极限为0.37fM。
7、检测人血清样品中靶DNA
为了进一步评价本发明检测方法的实际应用能力，进行了回收实验。将0.1pM、10pM和1000pM的靶DNA与稀释6倍的健康人血清样本混合，荧光检测后计算回收率，结果如表2所示。从表2中可以看出，回收率在97.46％～102.91％之间，相对标准差小于1.03％，说明本发明的检测方法具有在实际生物样品中检测BRAF V600E的潜在适用性。
表2
Sample Added(pM) Detected(pM) Recovery(％)(n＝3) RSD(％)
1 0.1 0.103 102.91 0.25
2 10 10.184 101.84 1.03
3 1000 974.612 97.46 0.35
综上所述，本发明研究开发了一种基于三维DNA步行器结合CRISPR/Cas12a系统的荧光扩增策略，实现了BRAF V600E的快速检测，整个过程最多只需要70分钟。由于三维DNA步行器具有强大的扩增能力，Cas12a具有较高的特异性和灵敏度，因此本发明的方法可以在fM水平上检测BRAF V600E。同时，信号报告分子的有效设计使本发明的检测方法具有较好的特异性，能区分单碱基错匹配序列，可用于人血清样本中BRAF V600E的检测。另外，本发明提供的荧光传感策略可以通过改变捕获的信号报告分子的序列来检测其他生物标志物，因此本发明的方法还具有可编程性。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆医科大学国际体外诊断研究院
<120> 一种快速检测循环肿瘤DNA基因突变的方法、系统及其应用
<130> PYZYK2118076-HZ
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 步行链DW
<400> 1
tttttttttt ttttttttta ggatttctct gtagctagac caaacacgcc cgtcagagaa 60
atcctcagc 69
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 轨道链S
<400> 2
tttttttttt gctgaggata tgaaccaacc aaacaat 37
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 靶DNA
<400> 3
tggtctagct acagagaaat c 21
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> crRNA
<400> 4
uaauuucuac uaaguguaga uauuguuugg uugguucaua u 41
<210> 5
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 信号报告分子Repoter
<400> 5
ttatt 5
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单碱基错配DNA
<400> 6
tggtctagct acagtgaaat c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 双碱基错配DNA
<400> 7
tggactagct acagtgaaat c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 三碱基错配DNA
<400> 8
tggactagct agagtgaaat c 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 非互补DNA
<400> 9
gctagagatt ttccacactg a 21

Claims (10)

1.一种快速检测循环肿瘤DNA基因突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用三维DNA步行器识别和结合靶DNA，在核酸内切酶驱动下循环剪切轨道链S，产生的输出链OD与crRNA特异性结合，并激活Cas12a的非特异性反式裂解活性，从而切割信号报告分子，产生荧光信号，以检测循环肿瘤DNA基因突变。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述循环肿瘤DNA基因突变为循环肿瘤DNABRAF V600E基因突变，即所述靶DNA，所述靶DNA序列如SEQ ID NO.3所示；
所述三维DNA步行器包括包括步行链DW、轨道链S，以核酸内切酶为驱动力，所述步行链DW序列如SEQ ID NO.1所示，所述轨道链S序列如SEQ ID NO.2所示；
所述核酸内切酶为限制性核酸内切酶Nb.BbvCI；
所述crRNA序列如SEQ ID NO.4所示；
所述信号报告分子序列如SEQ ID NO.5所示，所述信号报告分子的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将生物素修饰的步行链DW变性后形成发夹结构，然后将生物素修饰的轨道链S和发夹状DW加入到含链霉亲和素磁珠的结合缓冲液中，孵育形成DW-S-MBs混合液；接着用TE缓冲液通过磁分离洗涤磁珠，并用TE缓冲液重悬后形成纯化的DW-S-MBs溶液；
(2)将DW-S-MBs纯化溶液、靶DNA、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶缓冲液混合反应，以触发三维DNA步行器扩增反应；
(3)使用磁分离后的上清液触发CRISPR/Cas12a荧光反应系统，并灭活Cas12a蛋白；
(4)最后通过测量荧光信号强度获得靶DNA的浓度。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，将生物素修饰的步行链DW在95℃水浴条件下变性，形成发夹结构；
和/或，所述步骤(1)中，轨道链S和发夹状DW的摩尔比为(5～40)：1；
和/或，所述步骤(1)中，将生物素修饰的轨道链S和发夹状DW加入到含链霉亲和素磁珠的结合缓冲液中，在金属浴中振荡孵育形成DW-S-MBs混合液；
和/或，所述步骤(1)中，孵育温度为37℃，孵育时间为30～60分钟。
和/或，所述步骤(1)中，所述结合缓冲液包含以下成分：20mM Tris、1M NaCl、1mMEDTA、pH 7.5，0.0005％TritonX·100；
和/或，所述步骤(1)中，所述TE缓冲液包含以下成分：10mmol L-1 Tris·HCl，1mmol L-1EDTA，pH 8.0；
和/或，所述步骤(1)中，所述含链霉亲和素磁珠的结合缓冲液制备方法包括如下步骤：
将链霉亲和素磁珠原液用结合缓冲液洗涤，然后将洗涤过的磁珠悬浮在结合缓冲液中。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，限制性核酸内切酶的浓度为5～15U；
和/或，所述步骤(2)中，反应时间为20～60分钟。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述CRISPR/Cas12a荧光反应系统包含：Cas12a、CRISPR·crRNA、10×NEBuffer、信号报告分子Reporter和RNase抑制剂；
和/或，所述步骤(3)包括如下步骤：使用经过磁分离后的上清液触发CRISPR/Cas12a荧光反应系统，在37℃孵育25分钟，然后在95℃下终止反应5分钟，以灭活Cas12a；
和/或，所述步骤(4)中，使用荧光分光光度计测量荧光信号强度，测量参数为：激发波长525nm，发射波长范围为540nm至640nm，激发和发射的狭缝分别设置为5nm和10nm，检测电压为600V，556nm处的荧光强度用来量化靶DNA的浓度。
7.一种三维DNA步行器，其特征在于，包括步行链DW、轨道链S，以核酸内切酶为驱动力，所述步行链DW序列如SEQ ID NO.1所示，所述轨道链S序列如SEQ ID NO.2所示。
8.根据权利要求7所述的三维DNA步行器，其特征在于：所述核酸内切酶为限制性核酸内切酶Nb.BbvCI。
9.一种用于检测循环肿瘤DNA基因突变的系统，其特征在于：包括权利要求7～8任一项所述的三维DNA步行器，还包括CRISPR/Cas12a荧光反应系统，所述CRISPR/Cas12a荧光反应系统包含：Cas12a、CRISPR·crRNA、10×NEBuffer、信号报告分子Reporter和RNase抑制剂。
10.根据权利要求1～6任一项所述的方法、权利要求7～8任一项所述的三维DNA步行器、权利要求9所述的系统在制备用于检测循环肿瘤DNA基因突变的试剂中的应用。
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