CN110578002A - 用于检测循环肿瘤dna突变的质控品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种制备用于循环肿瘤DNA(ctDNA)突变检测技术的质控品的方法和通过该方法制备的质控品。本公开还涉及该质控品在检测ctDNA突变和相关方法例如微滴式数字PCR(ddPCR)、扩增阻滞突变系统PCR(ARMS)PCR和高通量测序(NGS)中的用途。

Description

用于检测循环肿瘤DNA突变的质控品及其制备方法

技术领域

本公开一般涉及生物检测和诊断领域。具体而言，本公开涉及用于检测循环肿瘤DNA(ctDNA)突变的质控品及其制备方法。本公开还涉及上述质控品在检测ctDNA中的用途。

技术背景

循环肿瘤DNA(循环肿瘤DNA；ctDNA)是一种存在于血液中的单链或双链形式的DNA分子，其片段长度在约144-166bp。先前的研究表明，ctDNA具有许多肿瘤相关的分子生物学突变，例如序列突变、甲基化改变等。检测ctDNA中的肿瘤相关突变有助于有助于肿瘤诊断(例如早期肿瘤诊断)。不仅如此，ctDNA突变检测还可以用于监控肿瘤进展、预后以及指导用药等。

目前，用于检测ctDNA中肿瘤相关突变的技术包括微滴式数字PCR(ddPCR)、扩增阻滞突变系统PCR(ARMS)PCR和高通量测序(NGS)的方法等。基于这些方法进行ctDNA突变检测的技术越来越成熟，相关的体外诊断试剂具有广泛的临床应用价值。对于上述方法的试剂开发及性能验证、检测过程质量控制以及不同检测方法和平台结果一致性的比较，需要大量稳定的ctDNA参考品作为标准。因此，ctDNA标准品的建立显得尤为重要。

目前的ctDNA质控品制备方法通常采用超声打断或人工合成获得片段化的DNA。超声打断会对DNA造成损伤，影响检测效率和准确性，且产生的DNA片段的长度分布与真实cfDNA(细胞游离DNA；cell free DNA)/ctDNA存在较大差异。因此，本领域对于改善的ctDNA质控品制备方法存在需要。

发明内容

在一个方面，本公开提供了一种制备用于循环肿瘤DNA(ctDNA)突变检测技术的质控品的方法，所述方法包括：

a.将来自不具有目标基因突变的野生型细胞系的基因组DNA酶切消化以获得野生型DNA片段；

b.获得包含目标基因序列突变的突变型DNA片段和/或包含目标基因拷贝数变异的突变型DNA片段，

其中获得包含目标基因序列突变的突变型DNA片段包括：

i)将来自多种突变型细胞系的基因组DNA各自酶切消化并将所得DNA片段混合，所述多种细胞系各自包含一种或多种目标基因序列突变；

ii)将多种质粒酶切消化并将所得DNA片段混合，所述多种质粒各自包含一种或多种目标基因序列突变；或者

iii)将包含多种目标基因序列突变的一种质粒酶切消化以获得DNA片段；

其中获得包含目标基因拷贝数变异的突变型DNA片段包括：

将一种或多种细菌人工染色体DNA酶切消化并将所得的DNA片段混合，所述一种或多种细菌人工染色体各自包含一种拷贝数变异的目标基因的拷贝；

c.将来自步骤a的野生型DNA片段和来自步骤b的包含目标基因序列突变的突变型DNA片段和/或包含目标基因拷贝数变异的突变型DNA片段混合，从而获得所述质控品。

在一些实施方案中，使用步骤b i)来制备突变型DNA片段。图1显示了通过将来自突变型细胞系例如肿瘤细胞系的基因组DNA酶切消化以获得突变型DNA片段的示意图。

在一些实施方案中，使用步骤b ii)来制备突变型DNA片段。在另一些实施方案中，使用步骤b iii)来制备突变型DNA片段。图2显示了通过将包含多种目标基因突变的单一质粒进行酶切以获得突变型DNA片段的示意图。

在一些实施方案中，使用细菌人工染色体(BAC)制备包含目标基因拷贝数变异的突变型DNA片段。图3显示了通过将细菌人工染色体酶切消化以获得突变型DNA片段的示意图。

在一些实施方案中，所述目标基因突变包括以下表1中列出的一种或多种基因突变。

表1.目标基因突变

在上述方法的一些实施方案中，在步骤a和b中将DNA酶切消化为平均长度约160bp的片段。例如，平均长度为140-180bp、150-170bp或155-165bp。

可以根据目标基因突变来选择不具有该目标突变的野生型细胞系。例如，可以使用已知不具有特定目标基因突变的细胞系作为野生型细胞系，或者可以对细胞系的目标基因进行测序和/或检测其拷贝数，并选择不显示目标基因序列突变/拷贝数变异的细胞系作为野生型细胞系。在一些实施方案中，所述野生型细胞系可以选自BEAS-2B、GM12878和GM24385细胞系。

在一些实施方案中，使用步骤b i)来制备包含目标基因序列突变的突变型DNA片段，并且所述突变型细胞系是肿瘤细胞系。根据不同的目标基因突变，可以使用具有该目标基因突变的肿瘤细胞系来制备突变型DNA片段。

在一些实施方案中，所述肿瘤细胞系包括选自NCI-H1975、HCC827、NCI-H441、NCI-H2228、A2058、Hs746T、HCC1954和MDA-MB-468中的一种或多种细胞系。上述肿瘤细胞系分别具有如表2中所示的目标基因突变。

表2.细胞系和相关目标基因突变

在一些实施方案中，使用Atlantis酶对来自细胞的基因组DNA进行酶切消化。即在步骤a中使用Atlantis酶对野生型细胞系的基因组DNA进行酶切消化和/或在步骤b中使用Atlantis酶对突变型细胞系的基因组DNA进行酶切消化。

对于使用的具体质粒和细菌人工染色体，可以根据需要插入的目标突变基因的数量、大小和其它特性来选择。在一些实施方案中，在步骤b ii)或b iii)中使用的质粒可以选自pUC19、pUC18和pUC57和本领域已知的其它质粒。

对于在步骤b ii)或b iii)中使用的质粒，其中插入的目标基因突变的序列长度可以变化，例如根据质粒本身的长度和性质，以及所插入的目标基因突变的数量具体选择。在一些实施方案中，插入的目标基因突变的序列长度为约200bp至约3kb，例如约300bp至约2.5kb，约400bp至约2.2kb，或约500bp至约2kb。

在一些实施方案中，在步骤b中使用NEB dsDNA片段化酶对所述质粒和/或细菌人工染色体进行酶切消化。

在上述方法的一些实施方案中，以期望的目标基因序列突变频率和/或拷贝数变异的目标基因的拷贝数来混合所述野生型DNA片段和突变型DNA片段，以模拟天然循环肿瘤DNA(ct DNA)中的突变频率和/或拷贝数。

在一些实施方案中，在步骤c中的混合使得所述质控品中所述目标基因序列突变的频率为0.1％至10％，例如0.2％至5％，或0.5％至3％。在一些实施方案中，在步骤c中的混合使得所述质控品中所述拷贝数变异的目标基因的拷贝数为2.2至20，例如2.5至15，或3至10。对于不同的目标基因突变，可以使用不同的突变频率和/或拷贝数。

可以选择不同的基质来制备质控品。在一些实施方案中，在步骤c中将所述野生型DNA片段和所述突变型DNA在健康人血浆中混合，从而获得所述质控品。

在一个方面，本公开涉及通过本公开的方法制备的质控品。

在另一个方面，本公开涉及包含本公开的质控品的试剂盒。

在一个方面，本公开涉及本公开的质控品或试剂盒在检测ctDNA突变中的用途。在一些实施方案中，通过自微滴式数字PCR(ddPCR)、扩增阻滞突变系统PCR(ARMS)PCR和高通量测序(NGS)的方法检测ctDNA突变。

在另一个方面，本公开涉及本公开的质控品或试剂盒在ctDNA检测技术中的用途，例如用于ctDNA检测技术中的试剂开发及性能验证、检测过程质量控制以及不同检测方法和平台结果一致性的比较等。在一些实施方案中，所述ctDNA检测技术选自ddPCR、ARMS PCR和NGS的方法。

在一个方面，本公开涉及本公开的质控品在制备用于检测ctDNA突变的试剂盒中的用途。在一些实施方案中，所述试剂盒用于通过选自ddPCR、ARMS PCR和NGS的方法检测ctDNA突变。

附图说明

图1显示了在本公开的制备质控品的方法中，通过将来自突变型细胞系例如肿瘤细胞系的基因组DNA酶切消化以获得突变型DNA片段的步骤的示意图。

图2显示了在本公开的制备质控品的方法中，通过将包含多种目标基因突变的单一质粒进行酶切以获得突变型DNA片段的步骤的示意图。

图3显示了在本公开的制备质控品的方法中，通过将来自细菌人工染色体(BAC)的DNA酶切消化以获得突变型DNA片段的步骤的示意图。

图4显示了使用不同的片段化酶消化细胞核小体DNA所获得的DNA片段的长度分布。小图A：使用NEB dsDNA获得的结果；小图B：使用MNase(微球菌核酸酶)获得的结果；小图C：使用Atlantis酶获得的结果。

图5显示了使用超声打断法或本公开的酶切消化的方法制备的DNA片段建立的NGS文库的有效测序深度的结果。

图6显示了对细胞来源的基因组DNA、质粒DNA或细菌人工染色体DNA进行片段化后获得的DNA片段的长度分布。

图7显示了对于本公开的质控品，使用ddPCR和NGS法检测的目标基因拷贝数与理论值之间的相关性的图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1.ctDNA质控品的片段化酶的选择

从细胞来源的基因组DNA制备ctDNA质控品涉及通过超声打断或酶切方法将DNA片段化。本实施例测试了3种酶对核小体DNA的片段化效果，包括dsDNA片段化酶、MNase(微球菌核酸酶)和Atlantis酶消化。获得的DNA片段大小分布结果如图4所示。

该结果显示，相较于使用MNase消化获得的DNA片段，使用dsDNA片段化酶或Atlantis酶消化获得的DNA片段大小分布更接近天然ctDNA。因此，对于野生型细胞系，选择Atlantis酶消化细胞核小体DNA来制备质控品的本底DNA(野生型DNA)，对于突变型细胞系例如肿瘤细胞系，选择Atlantis酶或NEB dsDNA片段化酶制备突变型DNA片段。

进一步，检测了超声打断的DNA、NES dsDNA片段化酶活Atlantis酶酶切的DNA与真实的cfDNA进行NGS建库效率的比较，方法如下：取30ng片段化的DNA样本，通过加接头、PCR扩增等步骤制备全基因组预文库。随后，用带有特定序列的RNA探针与预文库杂交，特异性地捕获人类基因组中目标基因区域，用链霉亲和素磁珠富集被探针捕获的DNA片段。使用富集的DNA作为模板进行扩增得到最终的文库。对终文库定量和质控后，用Illumina NextSeq550基因测序仪对终文库进行高通量测序。用在相同中位测序深度下(10000×)的有效测序深度作为评价建库效率的指标。有效测序深度的结果示于图5中。

结果显示，采用超声打断法制备的质控品的有效测序深度明显低于酶切方法，而NEB dsDNA片段化酶或Atlantis酶消化的DNA片段有效测序深度差异不大。综合考虑，在后续实施例中使用Atlantis酶切的DNA片段来制备质控品。

实施例2.ctDNA质控品制备方法

1.野生型DNA片段的制备：

用ZYMO Nucleosomal DNA Prep Kit，使用Atlantis酶酶切和提取ATCC beas-2b——正常野生型细胞系基因组DNA，得到大小为140-170bp的DNA片段。

2.突变型DNA片段的制备：

对于细胞基因组DNA来源的突变型DNA片段的制备同野生型DNA片段的制备步骤。

质粒或细菌人工染色体来源的突变型DNA的制备如下：

a)对所需突变基因及突变类型，合成包含目标基因突变的DNA序列并克隆到pUC57质粒或细菌人工染色体中。

b)取质粒或细菌人工染色体DNA，用NEB dsDNA片段化酶酶切。磁珠片段选择后，得到大小为140-170bp的DNA片段。

3.质控品的制备

用Qubit3.0对细胞来源或片段化的质粒DNA、片段化的细菌人工染色体DNA进行定量，用ddPCR计算拷贝数浓度。根据需要将片段化突变型DNA与野生型DNA按照拷贝数比例混合，得到不同突变频率和基因拷贝数的ctDNA阳性质控品，以不掺入突变片段的野生型DNA片段作为阴性质控品。

4.DNA片段长度分布检测

使用LabChip分别对从野生型细胞基因组DNA、质粒和BAC制备的DNA片段进行长度分布检测。其结果示于图6中。

上述结果显示，本发明的细胞基因组DNA来源的DNA片段分布与真实的cfDNA高度相似；质粒或细菌人工染色体来源片段化DNA片段主要分布在100-300bp的范围内，与细胞基因组DNA来源的DNA片段和cfDNA片段范围相近。

实施例3.细胞系ctDNA质控品制备和检测

用ZYMO Nucleosomal DNA Prep Kit提取野生型细胞系BEAS-2B核小体DNA并通过上述方法片段化，作为质控品的本底DNA；分别提取肿瘤细胞系NCI-H1975、HCC827、NCI-H441、NCI-H2228、A2058、Hs746T、HCC1975、MDA-MB-468(均购自ATCC)核小体DNA，并通过上述方法片段化。各个细胞系的突变基因信息参见以上表2。

按照最终SNV/Indel/Fusion突变频率分别为2％、0.5％，CNV为5，将来自野生型细胞系DNA的片段和来自肿瘤细胞系DNA的片段混合，获得质控品1、质控品2和质控品3。对配制的质控品用ddPCR和NGS分别检测。质控品种的理论突变频率以及通过ddPCR和NGS检测的突变频率如以下表3中所示。

表3.细胞系质控品检测结果

检测结果显示，ddPCR与NGS平台均能检测质控品1和质控品2中的全部6个SNV/Indel/Fusion突变，均能检出质控品3中的全部3个CNV；并且检出的突变比例与预期混合比例符合，阴性质控品未检出突变。

实施例4.多质粒ctDNA质控品的制备和检测

用ZYMO Nucleosomal DNA Prep Kit提取野生型细胞系BEAS-2B核小体DNA并通过上述方法片段化，作为质控品的本底DNA；合成目的突变基因序列，并克隆至质粒中，共获得11种质粒。质粒1-11所含突变信息见以下表4。同时使用覆盖拷贝数变异的目标基因MET的细菌人工染色体BAC1。

用NEB片段化酶将质粒片段化后，将质粒1至质粒11的DNA片段按照2％的预定突变频率掺入本底DNA中，并将BAC1的DNA片段按照目标基因预定拷贝数为5掺入本底DNA中，获得质控品4。对配制的质控品4用ddPCR和NGS分别检测突变基因频率和拷贝数变异，结果见以下表5。

表4.质粒突变信息

表5.质控品4检测结果

检测结果显示，ddPCR与NGS平台均能检测以上质控品4中包括的8个基因中的12个突变，包括SNV/Indel/Fusion/CNV四种突变类型，且检出的突变比例与预期符合。检出的突变频率大多分布在2％附近，且阴性质控品中没有检出突变。

实施例5.包含多种突变的单质粒ctDNA质控品的制备和检测

用ZYMO Nucleosomal DNA Prep Kit提取野生型细胞系BEAS-2B核小体DNA并通过上述方法片段化，作为质控品的本底DNA；合成目的突变基因序列，并将多条序列克隆到一种质粒中，获得包含6种突变基因序列的质粒12和包含5种突变基因序列的质粒13。质粒12和13所含突变信息见以下表6。质粒12的全长序列如SEQ ID NO:12所示，且质粒13的全长序列如SEQ ID NO:13所示。同时使用覆盖拷贝数变异的目标基因MET的细菌人工染色体BAC1。

用NEB片段化酶将质粒片段化后，将质粒12和质粒13的DNA片段按照2％的预定突变频率掺入本底DNA中，并将BAC1的DNA片段按照目标基因预定拷贝数为5掺入本底DNA中，获得质控品5。对配制的质控品5用ddPCR和NGS分别检测突变基因频率和拷贝数变异，结果见以下表7。

表6.质粒突变信息

表7.质控品5检测结果

检测结果显示，ddPCR与NGS平台均能检测以上质控品5中包括的8个基因中的12个突变，包括SNV/Indel/Fusion/CNV四种突变类型，且检出的突变比例与预期符合。检出的突变频率大多分布在2％附近，且阴性质控品中没有检出突变。

并且，由于质粒12和质粒13各自含有5-6个突变，同一质粒中的5-6个突变的突变频率十分接近，较混合各自包含不同突变的多种质粒DNA片段或混合各自包含不同突变的多种细胞系基因组DNA片段所得的质控品，能够获得更为一致的结果。

实施例6.细菌人工染色体ctDNA拷贝数变异质控品的制备和检测

用ZYMO Nucleosomal DNA Prep Kit提取野生型细胞系BEAS-2B核小体DNA并通过上述方法片段化，作为质控品的本底DNA。选择包含目的突变的BAC1、BAC2和BAC3，其各自的突变信息如以下表8中所示。用NEB片段化酶将BAC片段化后，将BAC1/BAC2/BAC3的DNA片段按照目的基因的最终拷贝数为5的预定拷贝数掺入本底DNA中，获得质控品6。

对配制的质控品6使用NGS检测突变基因的拷贝数，其结果见以下表9。

表8.细菌人工染色体突变信息

表9.质控品6检测结果

从检测结果上看，NGS平台均能检测质控品6中的3个CNV，且检出的突变比例与预期较为符合，阴性质控品中没有检出拷贝数变异。并且，细菌人工染色体制备的拷贝数变异质控品与细胞制备的质控品相比，不会引入细胞系突变或未知突变，能更好地对实验及分析流程进行质控。

实施例7.质控品的稳定性

为了检测本发明方法制备的ctDNA质控品的稳定性，将ctDNA质控品1和质控品2(参见实施例3)置于-20℃的储存温度下保存，分别在0、3和6个月时进行NGS检测。检测结果见以下表10。

表10.ctDNA质控品的稳定性结果

以上结果显示，在保存6个月后，ctDNA阳性质控品均可检出相应突变，且突变频率检测值与理论值相符，阴性质控品未检出任何突变。上述结果表明，本公开的方法制备的ctDNA质控品具有良好的稳定性。

序列表

<110> 广州燃石医学检验所有限公司

<120> 用于检测循环肿瘤DNA突变的质控品及其制备方法

<130> C19P4449

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CCDC6-RET

<400> 1

gctgcagcca ggccaggatg gggaccacca attaggaaag ctggtgggga agcggcagtg 60

gccacatctg ggaaggcctc cttggctcac acccttaccg agggctgggt gttgcctgaa 120

cggaggctcc agggccgagg cctcaggctg agctgcactg tgggatatgg cccctcccag 180

gaatcccagg ccacctccca gcctgagatg ggaactgcca gggccctgtg gccactgggt 240

gctcagcttc ctccctggag gctcctgccg aggagctatt cacgccacca taagctgcgt 300

ggctcaccgt tcactcacac ccttggctct gagcctctgt tacttccaga actgggcttg 360

gcttccagcg ccctggacag tgctagtagg aacactgaag gggcaggcca ccaccaggag 420

agggcagagg cctgcctggc cgggacaagg aggctccagg atactcggca cagcctggag 480

gctctgagta gcacatgcag acctgcaggc caggctcccc agaaaggcac ccccttctga 540

cttcagtgcc cctccatcca cactgctgct cccctgcccg atgctgtgac cctgaccact 600

gcctctcacc tagatgggaa cggcacctca tcacagtccc accccacaga ctgtccccac 660

acagcgccct atggaaatgg gggcagaaca caggcctcgt ctgcccagcg ttggcagccc 720

ctcacaggat ggcctctgtc tccccagctg gcctccctcc ctggaaggca gctggggagg 780

gcaggggatc ttccctgccc cgcagggacc ctcaccagga tcttgaaggc atccacggag 840

acctggttct ccatggagtc cagcgagggc cggcgggcac cggaagagga gtagctgacc 900

gggaaggcct gggcgggcct ccggaaggtc atctcagctg aggagatggg tggcttgtgg 960

gcaaacttgt ggtagcagtg gatgcagaag gcagacagca gcaccgagac gatgaaggag 1020

aagaggacag cggctgcgat caccgtgcgg caaggaatta tttaacaatt atgactattc 1080

atttaggcca agccataagg gaaaggaaag gaaaagatgc agtttgtgtg cttggaggga 1140

agggatatct tcttggccac ctcaaatcca tttgagaagc aggtaccgta taaattagca 1200

gttatcatct cactgagaga tccaacaatt atttcacaag ggaccattaa gaaatttggg 1260

tcactattat gatcatcctc attcaacagg taaggagtga agggtcaagt gtgattacgc 1320

aattgccaaa ggtccacatg acttgacaag gattacctaa aaccttcaaa agcagtccac 1380

acaaggcaac cccagtcact taagaaacct gaaaacaagg atctaaaggg taatgttcta 1440

aatatacttc ctgttcagaa cacttactta gtatcttaaa gaataagaag ttactgaagt 1500

tcaatcccat tttaagaaca cccatattat aaactataga tttatgaaaa ataagagtct 1560

agaaattttt cttgagaaac aaataagtat ccaggagtta atcagatgct cacagccaga 1620

cctcattatt acaaactaat ctgacacagc taactcacat cattctactg taggaaggac 1680

acaagcaatc tcattaaaca tctacaccaa acaaggtcac tctgagacga tgacaaagtg 1740

agacaaaaca agatcactgt gaaacccaca aaatacaaac atatcccatc tcggcaaaat 1800

tgagtaacca ctacttcttt actaattaca gctgtagcct ggctctaatc tgccttccct 1860

aaaggtactg agatacccaa tcacagaatc gctcccactt tctgaaaaca cccaatctaa 1920

aaagaacctt tgcttccctg cttccatcaa cccttcccaa tattactcaa ccaaagcccc 1980

aagtttccaa taggttcttt ctaacacccc tttctgctct ttaatgtgtt ttcccctcaa 2040

tgcaatgaac gataaaccca agcttgttca atatgtgcct agaggtcttt gagggcacaa 2100

atga 2104

<210> 2

<211> 2011

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KRAS G12V

<400> 2

ctatttcaaa gacaaggcga tatgcttatt ttccatctcc actgatgtta aatttaacat 60

gaagatccaa attacatgta aaatatgcta ataaatatgt tctgaaaatg agttaacaag 120

gacagttggg gaatgtcccc tcctggaggt ctttgagatt aaataaatcc tcatctgctt 180

gggatggaag ttctactcca tgaccttcaa ggtgtcttac aggtctttac ttatcattct 240

gctgctggtc tttactttgg taaattttca ttaaactaaa aaaatctgaa aataatcctc 300

aaaaacatga taacaattta aatttactca aggaattttt ttttaaatcc tagtatttcc 360

ttgagtaaat ttaaaaatga caacaaagca aaggtaaagt tggtaatagt acctttatat 420

aaaccacacc ttaggcaaat aattcatttt gtaaaattta tccggtagtt gtaggttctc 480

taatgttgag aagaagatag gaaaatactg ctgatgaagt ttaaaaaaat caaccatcaa 540

acaattatat ttcactagta caattaaatc taacctttac atatgatgtc acaataccaa 600

gaaacccata aaaataaaag ttacaataaa aagattgtct tttaggtcca gataggatac 660

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acaagtttat attcagtcat tttcagcagg ccttataata aaaataatga aaatgtgact 1080

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aagttgttct atctaaatag ccagactgct gttctgcggc ggctaaaggc tctcaaagga 1380

tcatatcatg acttcactca tgtagagact tcacagtgct ctacaccctg tagcacaccc 1440

tcacaaaagt tgctgacagc tatctccact cttattgtta cagttttcct agtggacccc 1500

cacctctaag tgttagaagt caatatgcaa cagctacaga aaaactttta aagcatcatg 1560

gcagtagttc tcttggataa atattaacag taagaatcag atgagagttg agagaatgag 1620

tgtcaaataa agctggattg tgtcatgggg aaataaaaat ttaaacactg aggcaaagaa 1680

gaacaatatt tgacgacatt ttaatgtgtg aaatatctct ggggaaaata ggagtccgag 1740

gttgcaatga gccgagatgg cgccactgca ctccagcctg gcgatagagc aagactccgt 1800

ctcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatctc tggggaaaat aaagctaaaa accaagagaa 1860

ctccgaatta actgttcagt acaatacata atcctgtatc accgctgcac aaaaaaagat 1920

aaagattaga aagccgggtg cggcggctca tgcctgtaat cccagcactt tcagaggcca 1980

aggcgggtgg atcacctgag gccaggagtt c 2011

<210> 3

<211> 2024

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ERBB2 A775_G776insYVMA

<400> 3

gtcggcagtt ctgatgggag gggcaagagc tggaggcagt gtttggggga gggcagttac 60

agcggagaag ggagcggggc caagccctag ggtggtgaag gatgtttgga ggacaagtaa 120

tgatctcctg gaaggcaggt aggatccagc ccacgctctt ctcactcata tcctcctctt 180

tctgcccagg gcatctggat ccctgatggg gagaatgtga aaattccagt ggccatcaaa 240

gtgttgaggg aaaacacatc ccccaaagcc aacaaagaaa tcttagacgt aagcccctcc 300

accctctcct gctaggagga caggaaggac cccatggctg caggtctggg ctctggtctc 360

tcttcattgg ggtttgggga gatatgactc ccgcaaacct agactatttt tttggagacg 420

gagtcttgct ctgtcaccca ggctggagtg cagtggcgtt atctcggctc actgcaacct 480

ccacctcctg gactcaagcg attttcatgc ctcaggctcc tgagtagctg ggattacaag 540

cgcccgctaa tttttttttt ttttttgaga cagagtctcg ctctgtcacc caggctagag 600

tgaaatggtg cggtctcagc tcagcctccc aggttaaagc gattcttctc cctcagtctc 660

ctgagtagct gggattacag gcgcgagcca ccacgcccgg ctaatttttg tatttttagt 720

agagatggga tttcaccatg ttggccaggt tggtgtcaaa ctcctgacct catgatccgc 780

ccgcctcggc ctcccaaagt gctgggatta caggtgtgag ccaccgtgcc cggcctaatc 840

tttgtatttt tagtagagac agggtttcac catgttgtcc aggctggtac tttgagcctt 900

cacaggctgt gggccatggc tgtggtttgt gatggttggg aggctgtgtg gtgtttgggg 960

gtgtgtggtc tcccataccc tctcagcgta cccttgtccc caggaagcat acgtgatggc 1020

atacgtgatg gctggtgtgg gctccccata tgtctcccgc cttctgggca tctgcctgac 1080

atccacggtg cagctggtga cacagcttat gccctatggc tgcctcttag accatgtccg 1140

ggaaaaccgc ggacgcctgg gctcccagga cctgctgaac tggtgtatgc agattgccaa 1200

ggtatgcacc tgggctcttt gcaggtctct ccggagcaaa cccctatgtc cacaaggggc 1260

taggatgggg actcttgctg ggcatgtggc caggcccagg ccctcccaga aggtctacat 1320

gggtgcttcc cattccaggg gatgagctac ctggaggatg tgcggctcgt acacagggac 1380

ttggccgctc ggaacgtgct ggtcaagagt cccaaccatg tcaaaattac agacttcggg 1440

ctggctcggc tgctggacat tgacgagaca gagtaccatg cagatggggg caaggttagg 1500

tgaaggacca aggagcagag gaggctgggt ggagtggtgt ctagcccatg ggagaactct 1560

gagtggccac ctccccacaa cacacagttg gaggacttcc tcttctgccc tcccaggtgc 1620

ccatcaagtg gatggcgctg gagtccattc tccgccggcg gttcacccac cagagtgatg 1680

tgtggagtta tggtgtgtga tggggggtgt tgggaggggt gggtgaggag ccatggctgg 1740

agggaggatg agagctggga tggggagaat tacggggcca cctcagcatg tgaagggagg 1800

gaaggggctg cctgtgcccc accttgcagg gtctgtgcac ttcccaggat tagggaaaga 1860

ccgggtaggg tctgtctcct ggcatcacat ctccccctgc tacctgccat gatgctagac 1920

tcctgagcag aacctctggc tcagtacact aaagctccct ctggccctcc cactcctgac 1980

cctgtctctg ccttaggtgt gactgtgtgg gagctgatga cttt 2024

<210> 4

<211> 2066

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALK-EML4(E6:A20)

<400> 4

ctgccaagcc acagagttgg agaagagcca catcatgaaa agatctctga attggtgtct 60

ggggatctgt gctctaattc cgcctcttgt tacttacaag ctgagccatg aggaccaggt 120

cacaggacct ctttggactg cagtttccct ctctgtaggc agggatggta actcctgccc 180

tgtttcccta accactgcca ctccccaccc tctagggttg tcaatgaaat gaattcacca 240

acataaaatg gttttgaaaa atcctaaaga gctctaccaa tgtgagtgac cattatcact 300

cctacatgtg aggatgttct ggaaggcaaa ctccatggaa gccagaacaa aattgtgatt 360

cagtgggtag attctgtgtg taaagcccag ccccccaaca catgggccag ggcaaatgag 420

tcacccgcta tgtgctcagt tccctcctct atgcaatgga ccgaccgtga tcagattagg 480

gttacctgag gatcgaatga attgaaatgt gtaaattgcc gagcacgtag taaccatgca 540

acaagtgtta gctcctatta tcctgtccct ttgagggatg gcaccatatg gggacacagt 600

gtgtgctgcc atctcccttc taccggcaga tccctttgcc tgcaggggcc tggcctgcga 660

gggctctcaa gagcctttcc ctctgccctt ttcaagcctc tgcccatctg tcctgggcat 720

gtctctgcca gcagtaagag ctggttggga ccacactgag ttctctgtga cctgcaggtc 780

agctcacctt ggctcacagg ctgaacagaa atatactcag aaaccgattt tcctatctct 840

ctgcctggag ggtggtggag ggctggtttg gggaagagtg ggctagtgca ttacataggg 900

tgggagccaa acaggagctg cgccggtgga agcatgtggg agctagaagt gacgtctagg 960

ggtgggggcg agctttcacc atcgtgatgg acactgaagg agctccccac cccctgatca 1020

gccaggagga tactagttac tatatttaga gtagaaaacc actcagagac attgtcattc 1080

agcctaggtc ataaggctat tatgcataag agccaggacc aaccactaaa cacagttatt 1140

ccccattcac tgctcttcct atcacatacc gccgactcta tttaaaaaaa aaaaaaaaag 1200

ttttcggacc agaagtggtg gctcacgcct gtaatcccaa cactttggga ggctgaggca 1260

ggaggactgc ttgagcccag gagtttgaga ccaacctagg caacaaagtg agaccccatc 1320

tctatgataa atacaaaaat cagccaggta tgtggtgcgc gcctgtagtc ccagctactt 1380

gggaggcttc agtgagagga ctgcttgagc ccaggaggcc aaggctgcag tgagccaagg 1440

cagtgactgc actccagccg gggcaacaga gcaagaccct ctctcttaaa agttttgata 1500

tataatgtat taagaattat cttcataaat aaaatttcat ttttcccttt aaagtatctc 1560

aaacattact taatctatgt tgtattataa agaagggaga aagtaagacc tactaaagaa 1620

gaatgccagc aaaattcaac ttcatttaga atgtctatgt aaaaacaaat gacctaaaga 1680

ctattacaaa tatttctttc ttttcttttt ggaacgaaag aagtaaaaat ccacagaaat 1740

caagttaaat ctctaaaaaa agctttaacc acgttgcagc tggttactat aatagaacag 1800

aaaataaggc taactatgaa acatagaaat gagctgtgaa aaccatgcac agaaaggacg 1860

tgctttcatt aagaacagca tgcttcaatt aaatttgcag gcaatctaaa gagaatgtaa 1920

aactgatgta taaaacttac ctacagtgca attaaattaa atacgcattc gccaaaagtc 1980

tgctctcttt ttttggtctg aacaagccaa caacagcaag tagccagaag ttacaatcaa 2040

tataaaagaa aaacttaaga ggaaat 2066

<210> 5

<211> 2093

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD74-ROS1

<400> 5

ccctcaacct tcctagtcct tcctggtcct ctgacactgg cacagtgcca ctgcttacca 60

ctgcagttat ggtgcccgcg gcttctggtg ttggggacct ccgtgccgtt ggggaagaca 120

caccagcagt agccgatgct cccatagcac tggagtggca gatagttgcc gttctcgtcg 180

cacttgggcc tgaatgaacc cgggtggaca gcagggatgt ggctgacctc ttcctggcac 240

ttggtcagta ctgaagcgac aggcatgatg aggacacagt gagtgagtga gctctgaacc 300

agggtctgag cagagctaaa gacccacaca ccactgctgt gggcttaatg ccttcttccc 360

aagtggcttt actcactcca gccatcacac ggatgggaaa actgaggcct agaccaacaa 420

ggtctgagat caaaaaggaa gtgaatggcc atgtgtccaa ttcacctcag aagttgatgg 480

tttcttctga cactcaaagc ccattacagt tttgggccag gcacagtggc tcatgcctgt 540

aatcttagca ctttgggagg ccgaggtggg cggatcactt gaggtcagga gttcaagacc 600

agcctggcca acatggtgaa accctgtctc tactaaaaat acaaaaatta gctgggcgtg 660

gtggcacatg cctataatcc cagctactcg ggaggccgag gcaggagaat tgcttgaacc 720

cgggaggctg aggttgcagt gagctgagat cgcaccactg cactccagcc tgggcgacag 780

agccagactc tatctcaaaa acaaacaatc aaacaaaaaa acaccattac agtttggaat 840

tgcacttgcg attctgattc tagagaaaag caatgggcac cttggtaagt ctaagcttcc 900

tgttactggg agttctcaag tagaaatggg gtttaccgtt tgttggagat gtcttagagg 960

ggtttaagca tcagctagga gttggagata gcatgtaagg tgccttctat gaatctgatg 1020

cagaaactga ggccccaggc acttcaacta aatttaactg tcagcagtat gcgtaagtca 1080

agggcacagg caagaaatga taccttaaat taggaaagcc aaggtggaaa gaggaagatg 1140

agaactcatc agagaaaaat caagatggta aaatcaacag gacctgatta ctgagtagag 1200

ggaaaaatca catatggcac tgagatttcc tgcctatgtg attagaaaga caatatatca 1260

taaactaaaa taaaatacac agtggaagag gtagatattg gggaagaaac aaaggtctta 1320

ggcctgttat gtataatgta ggagtggtca taaggctggt ataatgtgaa tagaattata 1380

tggctggata gaacagattg tgaacagcct tggaagccta attaggagca tggaattgat 1440

gtggtaggaa ttaagggggt ggctgattat tattggggag aaaaatgaca tgatgataat 1500

gatgttttag aaagatcaca tcacatgaat ggaatagttt aatagtttgg ataataagat 1560

tatatatata tatatatata tatatatata tatatagtca ccattatcta ttgctaatgt 1620

taagaatgta ctgatattta ttactgaacc tttaggtaat aagctagtgt gtagacagac 1680

atggtaacat acctccaact aatataatat tctcactgat tccactatat tcaccaaacc 1740

ctagattatt tgcagctact actctgaact gaaatattcc tttcaggttt ttggacttcc 1800

atgtgcaaac actactgcag gatccattaa atgtcatctt ccaccttaaa ttctggttct 1860

gtaaattatt tgaagtgctc tttctgcaaa aaataataaa tacagaaaat atacatgaca 1920

atatacctgt tatttctagt tgttcataga tcttcttagt gactgaacgc cagagagtgt 1980

cctttggcac aatttaccct tgacctcatt cctctcccat aatctggcaa cacagatgct 2040

aacagcatgg ttttatagtg atcctagtga ggcatggagc caattaactc agc 2093

<210> 6

<211> 2011

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MET 3028+1G>T

<400> 6

acttcaaaga tttctgctgt gtatcaaaac tgaagtaaaa atattctgag actttattgt 60

tccatcataa cagtacaatt atttacctct tatgggaagt cttctctgcc ctccacccca 120

ccgtccagga cagaattaat gtcccattgt ctctgttgat tactgtttag tcatacttct 180

atggtacata ccacactgta ctggaatcat ttatttatat gtctgtctcc ccttctatac 240

ttcagttcct gttttttgta catcttttta tccctaatac ctagttacaa atacaaacag 300

ctaagtacca cataagtact taagggatca gtgtccccta attatttgaa cactggagca 360

taattgagga atctcttatt atcctgaagg cagttatgcc atttgtagaa tggtaataac 420

cagttggtat ttgggaccca aagtgctaca acctgtgtag tacaaatatc tatcatggct 480

aaatgctgac ttttctttat ttgtcatttt tagtggaagc aagcaatttc ttcaaccgtc 540

cttggaaaag taatagttca accagatcag aatttcacag gattgattgc tggtgttgtc 600

tcaatatcaa cagcactgtt attactactt gggtttttcc tgtggctgaa aaagagaaag 660

caaattaaag gtgcattttt gttactgttc atttttagaa gttaccttaa gaacacagtc 720

attacagttt aagattgtcg tcgattcttg tgtgctgtct tatatgtagt ccataaaacc 780

catgagttct gggcactggg tcaaagtctc ctggggccca tgatagccgt ctttaacaag 840

ctctttcttt ctctctgttt taagatctgg gcagtgaatt agttcgctac gatgcaagag 900

tacacactcc tcatttggat aggcttgtaa gtgcccgaag tgtaagccca actacagaaa 960

tggtttcaaa tgaatctgta gactaccgag ctacttttcc agaagttata tttcagttta 1020

ttgttctgag aaatacctat acatatacct cagtgggttg tgacattgtt gtttattttt 1080

ggttttgcat ttatattttt ataaaaacct aaaggaagta tttacctctg ccaagtaagt 1140

atttgacaca aaattacatg gctcttaatt ttaaaagaac ccatgtatat attacattat 1200

gattttagag tccataagct ctcatttcac aaaaaggtta atttgagcaa aagtaatttg 1260

tttatcatct aagtgcaata gtaagaaatt gcgaagctct cttttacaat ccaggaagag 1320

ttaagttaca aaatatactt atttaaatgt aagttggaac tgctacattt tttacctgtt 1380

gaagcccaaa cattgaaatt atactgttag taattcttcg aagtgttttc aatgaactgt 1440

tagtacacag cctttttccc accatattct aggacttgaa tgtattttga gacttagcca 1500

aggaaaacct tcaattatgc catgaaaaaa aggaggggtc aatatcatca gctttgtaaa 1560

acactatgcc tagtaatgtt caggttaatc agagttttca tgttgtttta tttaaatctc 1620

ctggtaaaag caaaaggtct gtattgtatc agctccatta tctttagaag ttacaggatg 1680

tgagtcaagt acaagcattt ccttggttga atatttacca ttggacaaat aaaatgagtc 1740

acagatcatt gaggatactg gaaaagttag aagttgctca tccaaacaag ttcaagagca 1800

atgaagcact taacatttta acattttcaa cacttactac ctcttatgtt ttgaagttta 1860

tgttatttct atggagatac acatagtaaa cattgtcttt gccctgattc cattcacctt 1920

taaaaatcca ttcgtttaac cgtgtggaaa aatcaaacct agtttattgt tttgaaattt 1980

agatctattt agtattttat gtgcacattt a 2011

<210> 7

<211> 2011

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BRAF V600E

<400> 7

ctgtgattct cctcaatgtc tggcttaaca gcagccagct ggattctcat atttgctttt 60

gcactcagtc tgttgcaatg tgttgttttg gttgaaggat ataaagaaaa tcttgtctca 120

caaagggaag atcttgtgga ccctctaaaa cggtgtgagg gaccctttta agaatgctgt 180

tttagggaat gattcatatg actgagcttt ccacagcttg ctgcaatgca cacaagtttt 240

tgttcccttc ttttagaact tctctttctt cttttccaca aagcaaaaaa caagaagaaa 300

gaaagagcta tgcaagacag cacaaggctg ttaatctacc tctcattttt ttttgtcttt 360

cctcttccag ctgccccata attatgagat actttctagt ctaaaggaag taactttcca 420

atttaggctt aaataagatt gcgaaacagc ttctctgtta aaaggagtag ttctcttagc 480

aaaaccataa taatggctgt ggatcacacc tgccttaaat tgcatacctg tttttttttt 540

caacagggta cacagaacat tttgaacaca aaatacttta aacaatttag aataaaatat 600

gaaacactgt ttataagaca tatatttttg tttgaaatac actgaaactg gtttcaaaat 660

attcgtttta agggttcata tttatttaag aataaaatat gaaacactgt ttataagaca 720

tatatttttg tttgaaatac actgaaactg gtttcaaaat attcgtttta agggtaaaga 780

aaaaagttaa aaaatctatt tacataaaaa ataagaacac tgatttttgt gaatactggg 840

aactatgaaa atactatagt tgagaccttc aatgactttc tagtaactca gcagcatctc 900

agggccaaaa atttaatcag tggaaaaata gcctcaattc ttaccatcca caaaatggat 960

ccagacaact gttcaaactg atgggaccca ctccatcgag atttctctgt agctagacca 1020

aaatcaccta tttttactgt gaggtcttca tgaagaaata tatctgaggt gtagtaagta 1080

aaggaaaaca gtagatctca ttttcctatc agagcaagca ttatgaagag tttaggtaag 1140

agatctaatt tctataattc tgtaatataa tattctttaa aacatagtac ttcatctttc 1200

ctcttagagt caataagtat gtctaaaaca atgattagtt ctatttagcc tatataacct 1260

gcttttaaga tttttggggc ttgaaatgtg ttaggatgag gtgagatgct ttcctaagtt 1320

tataggagaa cctaaaactt tcccattaga ttttagcaat gtaggcccag atattctctt 1380

ggcactcctg ggcgagcagt aaaggctctt cattggaatg aagatgctgc agatagtatc 1440

ttagtctgca cttagggaag agaaatatta tgtttttctc acctcattgt tatataattt 1500

agagtcttca gttatatctc aactaccact gagcaaggtc agaggtctga aagggactaa 1560

tagatagcta caaaactatc agttttatag tgctgataaa atgtaagcaa gcaatcaaaa 1620

actcctacta ttgtaaagac ttctgataga ttttcttgta atgttcagtt gtcgagaaac 1680

caaaagcagg ctgtggtatc ctgctctcct atacatgcat gcacaatcct ttattaattc 1740

tctttacagt atatcgaact tagcatgaaa actgttttta cataatgtga agacaaaatg 1800

cagaagaaaa agtcaggatg ttttcaaact tcgcagacaa atttcaggaa ggatactatt 1860

actcttgagg tctctgtgga tgattgactt ggcgtgtaag taactgaaaa acaaaacatc 1920

attttaacct gagtagggct aaaggactct ggcctcgaaa tctacagaac atacttgggg 1980

gtgtaaagac ttatttagaa tcatgataca a 2011

<210> 8

<211> 2010

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR 19del (COSM6225)

<400> 8

atttgtcctt ccaaatgagc tggcaagtgc cgtgtcctgg cacccaagcc catgccgtgg 60

ctgctggtcc ccctgctggg ccatgtctgg cactgctttc cagcatggtg agggctgagg 120

tgacccttgt ctctgtgttc ttgtcccccc cagcttgtgg agcctcttac acccagtgga 180

gaagctccca accaagctct cttgaggatc ttgaaggaaa ctgaattcaa aaagatcaaa 240

gtgctgggct ccggtgcgtt cggcacggtg tataaggtaa ggtccctggc acaggcctct 300

gggctgggcc gcagggcctc tcatggtctg gtggggagcc cagagtcctt gcaagctgta 360

tatttccatc atctacttta ctctttgttt cactgagtgt ttgggaaact ccagtgtttt 420

tcccaagtta ttgagaggaa atcttttata accacagtaa tcagtggtcc tgtgagacca 480

attcacagac caaaggcatt tttatgaaag gggccattga ccttgccatg gggtgcagca 540

cagggcggga ggagggccgc ctctcaccgc acggcatcag aatgcagccc agctgaaatg 600

ggctcatctt cgtttgcttc ttctagatcc tctttgcatg aaatctgatt tcagttaggc 660

ctagacgcag catcattaaa ttctggatga aatgatccac acggacttta taacaggctt 720

tacaagcttg agattctttt atctaaataa tcagtgtgat tcgtggagcc caacagctgc 780

agggctgcgg gggcgtcaca gcccccagca atatcagcct taggtgcggc tccacagccc 840

cagtgtccct caccttcggg gtgcatcgct ggtaacatcc acccagatca ctgggcagca 900

tgtggcacca tctcacaatt gccagttaac gtcttccttc tctctctgtc atagggactc 960

tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt cccgtcgcta tcaagacatc tccgaaagcc 1020

aacaaggaaa tcctcgatgt gagtttctgc tttgctgtgt gggggtccat ggctctgaac 1080

ctcaggccca ccttttctca tgtctggcag ctgctctgct ctagaccctg ctcatctcca 1140

catcctaaat gttcactttc tatgtctttc cctttctagc tctagtgggt ataactccct 1200

ccccttagag acagcactgg cctctcccat gctggtatcc accccaaaag gctggaaaca 1260

ggcaattact ggcatctacc cagcactagt ttcttgacac gcatgatgag tgagtgctct 1320

tggtgagcct ggagcatggg tattgttttt ggtatttttt ggatgaagaa atggaggcat 1380

aaagaaattg gctgaccctt atatggctgg gatagggttt aagccccttg ttatttctga 1440

ctctgaaact tgcattcaat tcactccacc aagttatctc atctttgaaa tggctttttt 1500

taaaggtgcc tagaatatga tggcgtgcag tctataaact gttgcccacc ttctgtactt 1560

tctctcagaa taattcacat tcttctccag tgtctgttga ttgttacttt gtggaataag 1620

ttcttggaaa attccacaag attattgtta tcttcttact accaattcta ttgaactttc 1680

tccaccttct ctgggccttc cccagccagt ggtgggaaga tgctggctgg agtctgacag 1740

agcctcttct acactggcct gggcttgctg tgagttggtg gaaacctttg ctcttgtccc 1800

aacacagagc aagtgaaaga ggaggtcaag gggctcaggc agcggactag ggaagcagaa 1860

tcgaggaaaa ggaaaaatgg ctgacttatt acctcaaaac tctagagaat ttagttgatc 1920

ttacagccaa gaaggacaaa agccagagag taatatcctc cgcctcatgt ctaacccaca 1980

gaatacatag caagtaaaga gaacatgggc 2010

<210> 9

<211> 2021

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR-V769_D770insASV

<400> 9

ttggggattc cctcattctc agtcagacag aaaagagggc cccattgtgt gcctgattgc 60

aaataaattt agcttcctca gcccaagaat agcagaaggg ttaaaataaa gtctgtattt 120

atggctctgt caaaggaagg cccctgcctt ggcagccagc cggaattagc agggcagcag 180

atgcctgact cagtgcagca tggatttccc atagggagcc tgggggcaca gcacagagag 240

accacttctc tttagaaatg ggtcccgggc agccaggcag cctttagtca ctgtagattg 300

aatgctctgt ccatttcaaa acctgggact ggtctattga aagagcttat ccagctactc 360

tttgcagagg tgctgtgggc agggtcccca gcccaaatgc ccacccattt cccagagcac 420

agtcagggcc aagcctggcc tgtggggaag ggaggccttt ctccctgctg gctcggtgct 480

ccccggatgc cttctccatc gcttgtcctc tgcagcaccc acagccagcg ttcctgatgt 540

gcagggtcag tcattaccca gggtgttccg gaccccacac agattcctac aggccctcat 600

gatattttaa aacacagcat cctcaacctt gaggcggagg tcttcataac aaagatacta 660

tcagttccca aactcagaga tcaggtgact ccgactcctc ctttatccaa tgtgctcctc 720

atggccactg ttgcctgggc ctctctgtca tggggaatcc ccagatgcac ccaggagggg 780

ccctctccca ctgcatctgt cacttcacag ccctgcgtaa acgtccctgt gctaggtctt 840

ttgcaggcac agcttttcct ccatgagtac gtattttgaa actcaagatc gcattcatgc 900

gtcttcacct ggaaggggtc catgtgcccc tccttctggc caccatgcga agccacactg 960

acgtgcctct ccctccctcc aggaagccta cgtgatggcc agcgtggcca gcgtggacaa 1020

cccccacgtg tgccgcctgc tgggcatctg cctcacctcc accgtgcagc tcatcacgca 1080

gctcatgccc ttcggctgcc tcctggacta tgtccgggaa cacaaagaca atattggctc 1140

ccagtacctg ctcaactggt gtgtgcagat cgcaaaggta atcagggaag ggagatacgg 1200

ggaggggaga taaggagcca ggatcctcac atgcggtctg cgctcctggg atagcaagag 1260

tttgccatgg ggatatgtgt gtgcgtgcat gcagcacaca cacattcctt tattttggat 1320

tcaatcaagt tgatcttctt gtgcacaaat cagtgcctgt cccatctgca tgtggaaact 1380

ctcatcaatc agctaccttt gaagaatttt ctctttattg agtgctcagt gtggtctgat 1440

gtctctgttc ttatttctct ggaattcttt gtgaatactg tggtgatttg tagtggagaa 1500

ggaatattgc ttcccccatt caggacttga taacaaggta agcaagccag gccaaggcca 1560

ggaggaccca ggtgatagtg gtggagtgga gcaggtgcct tgcaggaggc ccagtgagga 1620

ggtgcaagga gctgacagag ggcgcagctg ctgctgctat gtggctgggg ccttggctaa 1680

gtgtccccct ttccacaggc tcgctccaga gccagggcgg ggctgagaga gcagagtggt 1740

caggtagccc tgcctgggtg ctggagacag gcacagaaca acaagccagg tatttcacag 1800

ctggtgcgga cccagaaaga cttctgcttt tgccccaaac ccctcccatc tccatcccag 1860

tcttgcatca gttatttgca ctcaacttgc taagtcctat ttttttctaa caatgggtat 1920

acatttcatc ccattgactt taaaggattt gcaggcaggc cctgtctctg agaatacgcc 1980

gttgcccgtc atctctctcc gacagcaggg cagggggtcc a 2021

<210> 10

<211> 2011

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR T790M

<400> 10

ataaatttag cttcctcagc ccaagaatag cagaagggtt aaaataaagt ctgtatttat 60

ggctctgtca aaggaaggcc cctgccttgg cagccagccg gaattagcag ggcagcagat 120

gcctgactca gtgcagcatg gatttcccat agggagcctg ggggcacagc acagagagac 180

cacttctctt tagaaatggg tcccgggcag ccaggcagcc tttagtcact gtagattgaa 240

tgctctgtcc atttcaaaac ctgggactgg tctattgaaa gagcttatcc agctactctt 300

tgcagaggtg ctgtgggcag ggtccccagc ccaaatgccc acccatttcc cagagcacag 360

tcagggccaa gcctggcctg tggggaaggg aggcctttct ccctgctggc tcggtgctcc 420

ccggatgcct tctccatcgc ttgtcctctg cagcacccac agccagcgtt cctgatgtgc 480

agggtcagtc attacccagg gtgttccgga ccccacacag attcctacag gccctcatga 540

tattttaaaa cacagcatcc tcaaccttga ggcggaggtc ttcataacaa agatactatc 600

agttcccaaa ctcagagatc aggtgactcc gactcctcct ttatccaatg tgctcctcat 660

ggccactgtt gcctgggcct ctctgtcatg gggaatcccc agatgcaccc aggaggggcc 720

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gatatgtgtg tgcgtgcatg cagcacacac acattccttt attttggatt caatcaagtt 1260

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tatttctctg gaattctttg tgaatactgt ggtgatttgt agtggagaag gaatattgct 1440

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cattgacttt aaaggatttg caggcaggcc ctgtctctga gaatacgccg ttgcccgtca 1920

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agacacccac ccggcctggg caggtcctcc t 2011

<210> 11

<211> 2011

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR L858R

<400> 11

cctctcccac ctgccagcct ggcccttgca gagagatgca ggctgccatt cttaggccaa 60

agcctgggac agttgggctc agcaaggtag gcatccgtca agcaaggagg agcaggggtc 120

agcagtgacc ccagcagcca gcagggagaa aggtgcatgt gacaaggaca ccagaggccg 180

tgggtcagga tcagccaggg tcagggtagc atttctagga attcactctg ttgggcgctg 240

tgctggctgc ttctcacata ttattccttt cttactctca gagcagagat ttcaattgca 300

gcgagattgt ggaggcagcc agggaggtgg ggagggtggt gtcttctaaa agcattttca 360

gtatccatgt ggtttcagta ataataataa taataaacca gtgaaaagta aaacaggaca 420

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gtaagttcaa gcccaggtct caactgggca gcagagctcc tgctcttctt tgtcctcata 660

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gcgggttaca tcttctttca tgcgcctttc cattctttgg atcagtagtc actaacgttc 780

gccagccata agtcctcgac gtggagaggc tcagagcctg gcatgaacat gaccctgaat 840

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tactggtgaa aacaccgcag catgtcaaga tcacagattt tgggcgggcc aaactgctgg 1020

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tctctccctg caggatatat aagtcccctt caatagcgca attgggaaag gtcacagctg 1380

ccttggtggt ccactgctgt caaggacacc taaggaacag gaaaggcccc atgcggaccc 1440

gagctcccag ggctgtctgt ggctcgtggc tgggacaggc agcaatggag tccttctctc 1500

ccttcactgg ctcggtttct cttagggacc ctcacagcac taaggggtgc gcgtcccctg 1560

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ggctcctagc agccaccaac ccatgatgct gggccctgaa aacacacgca gacctggatg 1680

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ggtgctcaga aacctaccag agcagccctg aactccgtca gactgaaatc ccctgttgcc 1800

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<210> 12

<211> 5607

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒

<400> 12

atgtcagacg aaagtaagtc ctacacacta tgcgaccgcg acaagagtca aattactaac 60

atacggccaa acagacggca agcgcaaagc cgaagaggag ccttcatctc ctgcaccatc 120

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cctacgccaa cagctccaac taccacaagt ttatattcag tcattttcag caggccttat 660

aataaaaata atgaaaatgt gactatatta gaacatgtca cacataaggt taatacacta 720

tcaaatactc caccagtacc ttttaataca aactcacctt tatatgaaaa attatttcaa 780

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ctcacaattg ccagttaacg tcttccttct ctctctgtca tagggactct ggatcccaga 1440

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cctcgatgtg agtttctgct ttgctgtgtg ggggtccatg gctctgaacc tcaggcccac 1560

cttttctcat gtctggcagc tgctctgctc tagaccctgc tcatctccac atcctaaatg 1620

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gacaactgtt caaactgatg ggacccactc catcgagatt tctctgtagc tagaccaaaa 4020

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tctaatttct ataattctgt aatataatat tctttaaaac atagtacttc atctttcctc 4200

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tactcagaaa ccgattttcc tatctctctg cctggagggt ggtggagggc tggtttgggg 4740

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gactctattt aaaaaaaaaa aaaaaagttt tcggaccaga agtggtggct cacgcctgta 5100

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acctaggcaa caaagtgaga ccccatctct atgataaata caaaaatcag ccaggtatgt 5220

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ggagaacaca ggaatctgaa tgtgtatgcc acaacggcgt atgcccagta gtgttcaccg 5340

atgggtctgc cactggacca gcagacacaa gaatatacta ttttaaagag gggaaaatat 5400

tgaaatggga gtctctgact ggaactgcta agcatattga agaatgctca tgttacgggg 5460

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cagacaatcc ccgaccgaat gacccaa 5607

<210> 13

<211> 4900

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒

<400> 13

atataggtaa gtgtaatgac ccttatccag gtaataataa caatggagtc aagggattct 60

catacctgga tggggctaac acttggctag ggaggacaat aagcacagcg tctggatacg 120

agatgttaaa agtgccaaat gcattgacag atgatagatc aaagcccatt caaggtcaga 180

caattgtatt aaacgctgac tggagtggtt acagtggatc tttcatggac tattgggctg 240

aaggggactg ctatcgagcg tgtttttatg tggagttgat acgtggaaga cccaaggagg 300

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ataaaaccca tgagttctgg gcactgggtc aaagtctcct ggggcccatg atagccgtct 420

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actgtctcag gggtctcatt acccgactat ggtgtaagct ggattcgcca gcctccacga 1860

aagggtctgg agtggctggg agtaatatgg ggtagtgaaa ccacatacta taattcagct 1920

ctcaaatcca gactgaccat catcaaggac aacttgccta taatcccagc tactcgggag 1980

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ccactgcact ccagcctggg cgacagagcc agactctatc tcaaaaacaa acaatcaaac 2100

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accgtttgtt ggagatgtct tagaggggtt taagcatcag ctaggagttg gagatagcat 2280

gtaaggtgcc ttctatgaat ctgatgcaga aactgaggcc ccaggcactt caactaaatt 2340

taactgtcag cagtatgcgt aagtcaaggg cacaggcaag aaatgatacc ttaaattagg 2400

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tcattcaaca ggtaaggagt gaagggtcaa gtgtgattac gcaattgcca aaggtccaca 3660

tgacttgaca aggattacct aaaaccttca aaagcagtcc acacaaggca accccagtca 3720

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cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct 3900

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ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca 4020

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gtacgtattt tgaaactcaa gatcgcattc atgcgtcttc acctggaagg ggtccatgtg 4260

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cctacgtgat ggccagcgtg gccagcgtgg acaaccccca cgtgtgccgc ctgctgggca 4380

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actatgtccg ggaacacaaa gacaatattg gctcccagta cctgctcaac tggtgtgtgc 4500

agatcgcaaa ggtaatcagg gaagggagat acggggaggg gagataagga gccaggatcc 4560

tcacatgcgg tctgcggagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg 4620

gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa 4680

gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct 4740

cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgactc 4800

cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac 4860

cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag 4900

<210> 14

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KRAS p.G12V

<400> 14

aacatcatgg accctgacat actcccaagg aaagtaaagt tcccatatta atggttacat 60

ataacttgaa acccaaggta catttcagat aacttaactt tcagcataat tatcttgtaa 120

taagtactca tgaaaatggt cagagaaacc tttatctgta tcaaagaatg gtcctgcacc 180

agtaatatgc atattaaaac aagatttacc tctattgttg gatcatattc gtccacaaaa 240

tgattctgaa ttagctgtat cgtcaaggca ctcttgccta cgccaacagc tccaactacc 300

acaagtttat attcagtcat tttcagcagg ccttataata aaaataatga aaatgtgact 360

atattagaac atgtcacaca taaggttaat acactatcaa atactccacc agtacctttt 420

aatacaaact cacctttata tgaaaaatta tttcaaaata ccttacaaaa ttcaatcatg 480

aaaattccag ttgactgcag acgtgtatcg taatgaactg tacttcattt acaaactcct 540

<210> 15

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR p.E746_A750del

<400> 15

tacaagcttg agattctttt atctaaataa tcagtgtgat tcgtggagcc caacagctgc 60

agggctgcgg gggcgtcaca gcccccagca atatcagcct taggtgcggc tccacagccc 120

cagtgtccct caccttcggg gtgcatcgct ggtaacatcc acccagatca ctgggcagca 180

tgtggcacca tctcacaatt gccagttaac gtcttccttc tctctctgtc atagggactc 240

tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt cccgtcgcta tcaagacatc tccgaaagcc 300

aacaaggaaa tcctcgatgt gagtttctgc tttgctgtgt gggggtccat ggctctgaac 360

ctcaggccca ccttttctca tgtctggcag ctgctctgct ctagaccctg ctcatctcca 420

catcctaaat gttcactttc tatgtctttc cctttctagc tctagtgggt ataactccct 480

ccccttagag acagcactgg cctctcccat gctggtatcc acccc 525

<210> 16

<211> 495

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR p.T790M

<400> 16

ctctcccact gcatctgtca cttcacagcc ctgcgtaaac gtccctgtgc taggtctttt 60

gcaggcacag cttttcctcc atgagtacgt attttgaaac tcaagatcgc attcatgcgt 120

cttcacctgg aaggggtcca tgtgcccctc cttctggcca ccatgcgaag ccacactgac 180

gtgcctctcc ctccctccag gaagcctacg tgatggccag cgtggacaac ccccacgtgt 240

gccgcctgct gggcatctgc ctcacctcca ccgtgcagct catcatgcag ctcatgccct 300

tcggctgcct cctggactat gtccgggaac acaaagacaa tattggctcc cagtacctgc 360

tcaactggtg tgtgcagatc gcaaaggtaa tcagggaagg gagatacggg gaggggagat 420

aaggagccag gatcctcaca tgcggtctgc gctcctggga tagcaagagt ttgccatggg 480

gatatgtgtg tgcgt 495

<210> 17

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR p.L858R

<400> 17

gcgggttaca tcttctttca tgcgcctttc cattctttgg atcagtagtc actaacgttc 60

gccagccata agtcctcgac gtggagaggc tcagagcctg gcatgaacat gaccctgaat 120

tcggatgcag agcttcttcc catgatgatc tgtccctcac agcagggtct tctctgtttc 180

agggcatgaa ctacttggag gaccgtcgct tggtgcaccg cgacctggca gccaggaacg 240

tactggtgaa aacaccgcag catgtcaaga tcacagattt tgggcgggcc aaactgctgg 300

gtgcggaaga gaaagaatac catgcagaag gaggcaaagt aaggaggtgg ctttaggtca 360

gccagcattt tcctgacacc agggaccagg ctgccttccc actagctgta ttgtttaaca 420

catgcagggg aggatgctct ccagacattc tgggtgagct cgcagcagct gctgctggca 480

gctgggtcca gccagggtct cctggtagtg tgagccagag ctgctttggg aacagtactt 540

<210> 18

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BRAF p.V600E

<400> 18

tatatttttg tttgaaatac actgaaactg gtttcaaaat attcgtttta agggtaaaga 60

aaaaagttaa aaaatctatt tacataaaaa ataagaacac tgatttttgt gaatactggg 120

aactatgaaa atactatagt tgagaccttc aatgactttc tagtaactca gcagcatctc 180

agggccaaaa atttaatcag tggaaaaata gcctcaattc ttaccatcca caaaatggat 240

ccagacaact gttcaaactg atgggaccca ctccatcgag atttctctgt agctagacca 300

aaatcaccta tttttactgt gaggtcttca tgaagaaata tatctgaggt gtagtaagta 360

aaggaaaaca gtagatctca ttttcctatc agagcaagca ttatgaagag tttaggtaag 420

agatctaatt tctataattc tgtaatataa tattctttaa aacatagtac ttcatctttc 480

ctcttagagt caataagtat gtctaaaaca atgattagtt ctatttagcc tatataacct 540

<210> 19

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALK EML4-ALK

<400> 19

gtctctgcca gcagtaagag ctggttggga ccacactgag ttctctgtga cctgcaggtc 60

agctcacctt ggctcacagg ctgaacagaa atatactcag aaaccgattt tcctatctct 120

ctgcctggag ggtggtggag ggctggtttg gggaagagtg ggctagtgca ttacataggg 180

tgggagccaa acaggagctg cgccggtgga agcatgtggg agctagaagt gacgtctagg 240

ggtgggggcg agctttcacc atcgtgatgg acactgaagg agctccccac cccctgatca 300

gccaggagga tactagttac tatatttaga gtagaaaacc actcagagac attgtcattc 360

agcctaggtc ataaggctat tatgcataag agccaggacc aaccactaaa cacagttatt 420

ccccattcac tgctcttcct atcacatacc gccgactcta tttaaaaaaa aaaaaaaaag 480

ttttcggacc agaagtggtg gctcacgcct gtaatcccaa cactttggga ggctgaggca 540

ggaggactgc ttgagcccag gagtttgaga ccaacctagg caacaaagtg agaccccatc 600

tctatgataa atacaaaaat cagccaggta tgtggtgcgc gcctgtagtc ccagctactt 660

gggaggcttc agtgagagga ctgcttgagc ccagga 696

<210> 20

<211> 476

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MET c.3028+1G>T

<400> 20

gtcgtcgatt cttgtgtgct gtcttatatg tagtccataa aacccatgag ttctgggcac 60

tgggtcaaag tctcctgggg cccatgatag ccgtctttaa caagctcttt ctttctctct 120

gttttaagat ctgggcagtg aattagttcg ctacgatgca agagtacaca ctcctcattt 180

ggataggctt gtaagtgccc gaagtgtaag cccaactaca gaaatggttt caaatgaatc 240

tgtagactac cgagctactt ttccagaagt tatatttcag tttattgttc tgagaaatac 300

ctatacatat acctcagtgg gttgtgacat tgttgtttat ttttggtttt gcatttatat 360

ttttataaaa acctaaagga agtatttacc tctgccaagt aagtatttga cacaaaatta 420

catggctctt aattttaaaa gaacccatgt atatattaca ttatgatttt agagtc 476

<210> 21

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ERBB2 p.A775_G776insYVMA

<400> 21

ggttggtgtc aaactcctga cctcatgatc cgcccgcctc ggcctcccaa agtgctggga 60

ttacaggtgt gagccaccgt gcccggccta atctttgtat ttttagtaga gacagggttt 120

caccatgttg tccaggctgg tactttgagc cttcacaggc tgtgggccat ggctgtggtt 180

tgtgatggtt gggaggctgt gtggtgtttg ggggtgtgtg gtctcccata ccctctcagc 240

gtacccttgt ccccaggaag catacgtgat ggcatacgtg atggctggtg tgggctcccc 300

atatgtctcc cgccttctgg gcatctgcct gacatccacg gtgcagctgg tgacacagct 360

tatgccctat ggctgcctct tagaccatgt ccgggaaaac cgcggacgcc tgggctccca 420

ggacctgctg aactggtgta tgcagattgc caaggtatgc acctgggctc tttgcaggtc 480

tctccggagc aaacccctat gtcc 504

<210> 22

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ROS1 CD74-ROS1

<400> 22

tgcctataat cccagctact cgggaggccg aggcaggaga attgcttgaa cccgggaggc 60

tgaggttgca gtgagctgag atcgcaccac tgcactccag cctgggcgac agagccagac 120

tctatctcaa aaacaaacaa tcaaacaaaa aaacaccatt acagtttgga attgcacttg 180

cgattctgat tctagagaaa agcaatgggc accttggtaa gtctaagctt cctgttactg 240

ggagttctca agtagaaatg gggtttaccg tttgttggag atgtcttaga ggggtttaag 300

catcagctag gagttggaga tagcatgtaa ggtgccttct atgaatctga tgcagaaact 360

gaggccccag gcacttcaac taaatttaac tgtcagcagt atgcgtaagt caagggcaca 420

ggcaagaaat gataccttaa attaggaaag ccaaggtgga aagaggaaga tgagaactca 480

tcagagaaaa atcaagatgg taaaatcaac aggacctgat tactgagtag agggaaaaat 540

cacatatggc actgagattt cctgcctatg tgattagaaa gacaatatat cataaactaa 600

aataaaatac acagtggaag aggtagatat tggggaagaa acaaaggtct taggcctgtt 660

atgtataatg taggagtggt cataaggctg gtataatgtg aatagaatta tatggctgga 720

tagaacagat tgtgaacagc cttggaagcc 750

<210> 23

<211> 722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RET CCDC6-RET

<400> 23

gcgttggcag cccctcacag gatggcctct gtctccccag ctggcctccc tccctggaag 60

gcagctgggg agggcagggg atcttccctg ccccgcaggg accctcacca ggatcttgaa 120

ggcatccacg gagacctggt tctccatgga gtccagcgag ggccggcggg caccggaaga 180

ggagtagctg accgggaagg cctgggcggg cctccggaag gtcatctcag ctgaggagat 240

gggtggcttg tgggcaaact tgtggtagca gtggatgcag aaggcagaca gcagcaccga 300

gacgatgaag gagaagagga cagcggctgc gatcaccgtg cggcaaggaa ttatttaaca 360

attatgacta ttcatttagg ccaagccata agggaaagga aaggaaaaga tgcagtttgt 420

gtgcttggag ggaagggata tcttcttggc cacctcaaat ccatttgaga agcaggtacc 480

gtataaatta gcagttatca tctcactgag agatccaaca attatttcac aagggaccat 540

taagaaattt gggtcactat tatgatcatc ctcattcaac aggtaaggag tgaagggtca 600

agtgtgatta cgcaattgcc aaaggtccac atgacttgac aaggattacc taaaaccttc 660

aaaagcagtc cacacaaggc aaccccagtc acttaagaaa cctgaaaaca aggatctaaa 720

gg 722

<210> 24

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR p.A767_V769dup

<400> 24

tctctgtcat ggggaatccc cagatgcacc caggaggggc cctctcccac tgcatctgtc 60

acttcacagc cctgcgtaaa cgtccctgtg ctaggtcttt tgcaggcaca gcttttcctc 120

catgagtacg tattttgaaa ctcaagatcg cattcatgcg tcttcacctg gaaggggtcc 180

atgtgcccct ccttctggcc accatgcgaa gccacactga cgtgcctctc cctccctcca 240

ggaagcctac gtgatggcca gcgtggccag cgtggacaac ccccacgtgt gccgcctgct 300

gggcatctgc ctcacctcca ccgtgcagct catcacgcag ctcatgccct tcggctgcct 360

cctggactat gtccgggaac acaaagacaa tattggctcc cagtacctgc tcaactggtg 420

tgtgcagatc gcaaaggtaa tcagggaagg gagatacggg gaggggagat aaggagccag 480

gatcctcaca tgcggtctgc g 501

Claims (16)

1.一种制备用于循环肿瘤DNA(ctDNA)突变检测技术的质控品的方法，所述方法包括：

a.将来自不具有目标基因突变的野生型细胞系的基因组DNA酶切消化以获得野生型DNA片段；

b.获得包含目标基因突变序列的突变型DNA片段和/或包含目标基因拷贝数变异的突变型DNA片段，

其中获得包含目标基因突变序列的突变型DNA片段包括：

i)将来自多种突变型细胞系的基因组DNA各自酶切消化并将所得DNA片段混合，所述多种细胞系各自包含一种或多种目标基因序列突变；

ii)将多种质粒酶切消化并将所得DNA片段混合，所述多种质粒各自包含一种或多种目标基因突变序列；或者

iii)将包含多种目标基因突变序列的一种质粒酶切消化以获得DNA片段；

其中获得包含目标基因拷贝数变异的突变型DNA片段包括：

将一种或多种细菌人工染色体DNA酶切消化并将所得的DNA片段混合，所述一种或多种细菌人工染色体各自包含一种拷贝数变异的目标基因的拷贝；

c.将来自步骤a的野生型DNA片段和来自步骤b的包含目标基因序列突变的突变型DNA片段和/或包含目标基因拷贝数变异的突变型DNA片段混合，从而获得所述质控品。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述目标基因突变包括表1中列出的一种或多种基因突变。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤a和b中将DNA酶切消化为平均长度约160bp的片段。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述野生型细胞系选自BEAS-2B、GM12878和GM24385细胞系。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在步骤a中使用Atlantis酶对所述野生型细胞系的基因组DNA进行酶切消化。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述突变型细胞系是肿瘤细胞系，例如选自NCI-H1975、HCC827、NCI-H441、NCI-H2228、A2058、Hs746T、HCC1975和MDA-MB-468。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在步骤b中使用Atlantis酶对所述突变型细胞系的基因组DNA进行酶切消化。

8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在步骤b中使用的质粒选自pUC19、pUC18和pUC57。

9.如权利要求1-5和8中任一项所述的方法，其中在步骤b中使用NEB dsDNA片段化酶对所述质粒进行酶切消化。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在步骤b中使用NEB dsDNA片段化酶对所述细菌人工染色体进行酶切消化。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在步骤c中的混合使得所述质控品中所述目标基因序列突变的频率为0.1％至10％，例如0.2％至5％。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在步骤c中的混合使得所述质控品中所述拷贝数变异的目标基因的拷贝数为2.2-20，例如3至10。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中在步骤c中将所述野生型DNA片段和所述突变型DNA在健康人血浆中混合。

14.通过权利要求1-13中任一项所述的方法制备的质控品。

15.一种试剂盒，其包含如权利要求14所述的质控品。

16.如权利要求14所述的质控品或如权利要求15所述的试剂盒在检测ctDNA突变中的用途，例如在通过选自微滴式数字PCR(ddPCR)、扩增阻滞突变系统PCR(ARMS)PCR和高通量测序(NGS)的方法检测ctDNA突变中的用途。