CN108424955A

CN108424955A - 一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法及其应用

Info

Publication number: CN108424955A
Application number: CN201810439346.XA
Authority: CN
Inventors: 李河南; 王晓雪; 李浩浩; 李圆; 徐志兰; 花园; 林文楚; 洪波; 王伟
Original assignee: Hefei Cas Jinzhen Biomedical Co ltd; Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Current assignee: Hefei Cas Jinzhen Biomedical Co ltd; Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Priority date: 2018-05-09
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2018-08-21
Anticipated expiration: 2038-05-09
Also published as: CN108424955B

Abstract

本发明公开了一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法及其应用，属于基因检测领域。它包括通过搜索数据库选择癌症靶向用药基因，化疗耐药或敏感基因以及癌症驱动基因的变异位点及其上下游延长100bp作为靶点区间，合成与靶点区间相应配对的捕获探针，捕获待测样品DNA的目标区域并且构建高通量测序文库，然后进行高通量测序获取目的片段的序列，从而获得癌症相关基因点突变和插入缺失变异、拷贝数变异、基因融合变异的结果。本发明能够一次性检测105个癌症相关基因的多种类型的突变，具有捕获效率高，均一性好的特点。

Description

一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法及其应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，更具体地说，涉及一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法及其应用，可同时检测多个癌症相关基因融合、拷贝数变异、点突变和插入缺失变异。

背景技术

在中国，由肿瘤引起的死亡逐年递增。癌症已经成为影响大众健康的重要因素。2015年，统计结果表明新增4292000例肿瘤患者，2814000例死亡。随着诊断普及，肺癌确诊和死亡比例都在增加。农村患癌比例高于城市。美国肿瘤发生率为45％，死亡率为30％，这个比例也是逐年递增。但随着肿瘤早期筛查，诊断，以及多种肿瘤治疗方法，如免疫疗法，靶向疗法，液态活检等技术的应用，已经展现出好的趋势。在某些实体肿瘤，出现了死亡率递减的情况，比如乳腺癌，卵巢癌等。这主要归于人们健康意识提高，以及诊断技术的进步。

传统的实体肿瘤诊断，主要通过病理切片。确诊后进行放化疗等标准治疗方法。随着科学发展，近几年出现了液态活检，免疫疗法，靶向药精准治疗等方法。肿瘤早筛，CTC(循环肿瘤细胞)和液态活检可以提供辅助医生判断结果。主要思路通过捕获外周血中的肿瘤细胞或肿瘤细胞DNA，对患者进行早期筛查，以及后期跟踪治疗效果判断。治疗上，免疫疗法通过促进免疫系统产生抗体来同抗原以及癌细胞结合，从而阻断抗原蛋白的促生长功能或让其被免疫细胞所灭。靶向药治疗，主要是通过针对性靶点，阻断肿瘤生长和扩散的分子药。

肿瘤用药指导的伴随诊断随着药物效用与基因突变的关系被发现而不断发展。有关文献指出，EGFR突变与吉非替尼和厄洛替尼的药效高度相关，如EGFR Exon18-24没有突变，会产生吉非替尼耐药性，而有突变的患者，使用吉非替尼有效。又有文献报道，KRAS突变与EGFR突变同时出现，EGFR-TKIs可能无效。

随着美国国立综合癌症网络中心在其指南中发布和用药相关的分子伴随诊断试剂，该技术开始慢慢从实验室走向临床。目前肿瘤治疗中一线疗法还是化疗、放疗。在抑制或杀灭癌细胞的同时，对正常的细胞产生损伤。副作用大，破坏身体免疫，直接导致化疗几个疗程后，患者身体已不再适合化疗。所以靶向治疗就是在这种背景下产生。非小细胞肺癌是肺癌中最常见，约占肺癌总数的80％～85％。目前已有5类非小细胞肺癌的靶向药经FDA或CFDA批准上市，分别是针对EGFR的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，针对ALK的抑制剂，针对VEGF的靶向药，针对VEGFR2的靶向药物，和免疫治疗药物。

分子靶向药物以在肿瘤细胞膜上或细胞内特异性表达或高表达的分子为作用靶点。能更加特异地作用于肿瘤细胞，阻断其生长、转移或诱导其凋亡，降低了药物对正常细胞的伤害。具有高效、低副作用的优势。因此，得到越来越多肿瘤患者的认同。

肿瘤靶向药，陆续在国内上市，包括吉非替尼(2004)，埃克替尼，厄洛替尼，克唑替尼等。其中也包括纳入医保曲妥珠单抗、利妥昔单抗、硼替佐米、来那度胺等多个社会比较关注、参保人员需求迫切的肿瘤靶向药。国内对靶向药的需求，以及医生使用靶向药进行治疗的比例都在提升，这需要有针对靶向药进行伴随检测的方法或试剂盒。本发明主要针对患者进行靶点检测，可同时检测105个癌基因融合、拷贝数变异、点突变和插入缺失变异，辅助医生诊断达到精准用药，改善患者症状的目的。

中国专利申请号CN201610738252.3，公布号CN 106283199 A，公开了一种检测肿瘤相关50个热点突变基因的捕获文库和试剂盒，其针对肿瘤学研究相关的50个基因的207个热点突变区域的捕获方法，以及捕获使用的液相杂交文库的制备方法。具体为选取207个热点突变区域的序列信息，涉及PCR引物，利用PCR方法制备生物标记的液相杂交捕获文库，利用其与构建好的靶标基因组DNA文库杂交，对捕获到的片段进行高通量测序和生物信息学分析，从而获得样本的核酸序列位点变异情况。但是，该现有技术使用多重PCR的方法捕获靶向区域，检测位点有限，不能检测所有与靶向和化疗治疗相关的靶点基因变异。

中国专利申请号CN201710286956.6，公布号CN 107090503 A，公开了一种探针组合物、基因捕获芯片、试剂盒及应用，基于DNA二代测序法对靶向化疗用药相关基因设计专用捕获探针，利用少量样本一次性得到多个目标基因片段，通过高通量测序平台实现高深度测序，可以一次性平行检测化疗药物基因多态性及靶向用药相关基因中存在的多种变异形式，如点突变，插入/缺失，DNA拷贝数改变等，从而一次性检出所有与靶向化疗治疗相关的靶点基因变异。但是，该现有技术仅解决了检测点突变，插入/缺失，DNA拷贝数改变的问题，没有解决检测FUSION区域的问题。

中国专利申请号CN 201510769791.9，公布号CN 106701897 A，公开了一种同时检测基因点突变、插入缺失和CNV的方法及设备，该方法包括：根据目标区域的DNA序列，设计得到捕获探针，将所述捕获探针与核酸样本文库进行杂交，以便捕获所述目标区域的DNA序列；对所述目标区域的DNA序列进行PCR扩增，以便获得扩增产物；将所述扩增产物进行测序，对测序数据进行数据分析，以便获得基因点突变、插入缺失和CNV检测结果。但是，该现有技术不能检测融合基因变异。

中国专利申请号CN201610840488.8，公布号CN 106434911 A，公开了一种165基因靶区域富集测序方法。中国专利申请号CN 201510333113.8,公布号CN 105112499 A，公开了一种基于多探针富集168基因靶区域的方法。本发明与该两项现有技术检测的基因以及区域不同。本发明还包括检测了BRAF基因融合变异，该两项技术均未包括。

综上所述，现有技术中的基因检测方法多集中在检测点突变，插入/缺失，DNA拷贝数改变等突变类型，而少见将多癌基因融合问题与点突变，插入/缺失，DNA拷贝数改变等同时进行检测的报道，临床上检测范围的局限(几个位点的突变检测)以及Sanger测序技术多基因检测高昂的检测费用，使得其在现实临床应用中受到很大限制。因此建立一套高效，快捷，灵敏，经济且能够同时对多癌基因融合与点突变，插入/缺失，DNA拷贝数改变进行检测的手段，是当前基因检测亟待解决的问题。

发明内容

1、要解决的问题

针对现有技术在同时检测含有基因融合变异的多基因多位点多种变异(点突变和插入缺失变异、拷贝数变异、基因融合变异)的不足，本发明提供一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法及其应用，可同时检测点突变和插入缺失变异、拷贝数变异、基因融合变异，其捕获效率和均一性均优于现有技术。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

本发明提供一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法，包括以下步骤：

(1)通过数据库选择癌症相关基因的高频突变位点及其上下游延长100bp作为靶点区间；

(2)合成与靶点区间相应配对的捕获探针，碱基数在60～80nt之间、T_m值适中(50～65℃)、无回文序列等特殊结构、与序列同源性在50～80％；

(3)从待测样品中提取DNA，利用捕获探针对提取的DNA进行杂交，捕获目标区域的DNA序列；

(4)对捕获目标区域的DNA序列进行PCR扩增，获得扩增产物；

(5)对步骤(4)中扩增产物进行纯化，质检，获得测序文库；

(6)对步骤(5)中构建的测序文库进行高通量测序获取目的片段的序列；

(7)对获取的目的片段的序列信息与正常的基因序列进行比对分析，得到目的片段的突变信息。

优选地，所述的癌症相关基因包括癌症靶向用药基因，化疗耐药或敏感基因以及癌症驱动基因。

优选地，所述癌症靶向用药基因选自MTOR、JAK1、NRAS、RET、FGFR2、HRAS、WT1、CCND1、KRAS、ERBB3、CDK4、FLT3、BRCA2、AKT1、MAP2K1、IDH2、ERBB2、BRCA1、JAK3、ALK、MSH6、IDH1、ERBB4、MAPK1、PIK3CA、FGFR3、PDGFRA、KIT、ROS1、EGFR、MET、BRAF、EZH2、FGFR1、JAK2、CDKN2A、ARAF。

优选地，所述化疗耐药或药物敏感基因选自MTHFR、CDA、RAVER2、DPYD、CYP2C19、CYP2C9、CYP2C8、ABCC2、RRM1、SLCO1B1、LRP2、UGT1A7、UGT1A1、CYP2D6、UMPS、TPMT、ABCB1、KCNH2、MIR4673。

优选地，所述癌症驱动基因选自ARID1A、NOTCH2、ASTN1、PTEN、GSTP1、ATM、CBL、CHEK1、KDM5A、MARCH9、RB1、NTHL1、TSC2、PKD1、CDH1、TP53、NF1、SPOP、SMAD4、STK11、GNA11、KEAP1、XRCC1、KLC3、ERCC2、ERCC1、NFE2L2、SRC、GNAS、CHEK2、VHL、XPC、CTNNB1、RHOA、LETM1、FBXW7、PIK3R1、APC、NPM1、ESR1、HGF、SMO、KMT2C、MYC、GNAQ、PTCH1、ABL1、TSC1、NOTCH1。基因捕获区域如表1所示。

优选地，所述高频突变位点的变异基因类型为多癌基因融合、拷贝数变异、点突变和插入缺失变异。

优选地，所述的捕获探针为针对多癌基因融合、拷贝数变异、点突变和插入缺失变异合成。

优选地，步骤3)中的待测样品包括离体的新鲜肿瘤组织、新鲜活检组织、石蜡包埋组织。从待测样品中提取DNA时，适用但不限于组织DNA提取试剂盒、石蜡包埋组织DNA提取试剂盒。

优选地，步骤(3)中提取基因组DNA后对DNA进行质量检测，所述DNA浓度大于20ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0。

优选地，步骤5)中对测序文库进行质量检测，文库浓度大于5ng/μL，片段大小150～500bp。

优选地，基于捕获探针，检测突变的下限为1％。

本发明还提供一种采用上述检测多种变异类型基因的高通量测序方法在离体的新鲜肿瘤组织、新鲜活检组织、石蜡包埋组织中的应用。

对热点区域进行捕获，检测肿瘤病人离体组织中多数的变异，最终覆盖到的肿瘤热点基因区域，如表1所示。

表1选取的癌症相关基因捕获区域

备注：Chr：染色体；Start：区间起始位置；End：区间终止位置。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明可准确地同时检测105个基因(包括癌症驱动基因，靶向用药相关基因和化疗相关基因)的点突变和插入缺失变异、拷贝数变异、基因融合变异；现有方法中多为检测点突变，插入/缺失，DNA拷贝数改变的问题，而没有解决检测FUSION区域的检测问题，本发明的基因检测方法能够同时检测融合的区域，即同时检测出SNV/INDEL(突变/插入缺失)，CNV(拷贝数变异)，Fusion(融合)。

(2)本发明基于以上设计的肿瘤相关基因热点，进行靶向检测，包含多种癌症如胃癌，肺癌，肠癌，乳腺癌，卵巢癌等相关药物靶点和热点驱动区域的点突变和插入缺失变异、拷贝数变异、基因融合变异，通过一次检测即可得到点突变和插入缺失变异、拷贝数变异、基因融合变异的信息，为采取合适的治疗方案给出指导。

(3)本发明可得到高质量的高通量测序数据(Q30>90％)，Illumina的给定的Q30的参考数值为75％。

(4)本发明探针的覆盖度可(目标区域中被测序覆盖的比例)达到100％，捕获效率(目标区域序列数与测定的总序列的比值)大于78％，本发明探针捕获的均一性(目标区域的分布程度)大于98％。覆盖度、捕获效率、均一性等参数都与靶标的设计直接相关，目标区域GC含量低、AT含量高、存在重复序列、二级结构等，会使探针不易设计、结合力弱，影响探针的捕获效率、覆盖度、均一性等数据质量指标。

附图说明

图1为实施例1、2、3、4中样本的质量效果示意图；

图2为实施例1中样本的变异检测结果示意图；

图3为实施例2中样本的变异检测结果示意图；

图4为实施例3中样本的拷贝数变异检测结果示意图；

图5为实施例4中样本的融合变异检测结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细描述。

为说明本发明的目的、技术方法和优点，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明。具体实施中提及的科技术语具有与本领域人员通常理解的含义相同的含义，如有不一致以本发明为准。

1.通过数据库选择表1中癌症相关基因的高频突变位点及其上下游延长100bp作为靶点区间；

2.合成与靶点区间相应配对的捕获探针，碱基数在60～80nt之间、T_m值适中(50～65℃)、无回文序列等特殊结构、与序列同源性在50～80％；

3.样本DNA提取及文库制备

使用Qiagen公司的GeneRead DNAFFPE Kit试剂盒提取样本DNA，方法参照QiagenDNA提取试剂盒步骤。将得到的高质量基因组DNA样本片段化成180～220bp的DNA片段，随后使用KAPA End Repair Enzyme Mix进行末端补平将末端修复、通过KAPA A-Tailing Enzyme加“A”及通过KAPA T4DNA Ligase连接等过程，将DNA片段连上index接头(相关试剂来自KAPA Hyper Prep Kit Illumina platforms)，经PCR扩增纯化后得到样本DNA文库。

4.目标序列的杂交捕获、洗脱与富集纯化

i)样品准备：向1.5mL EP管中加入5μL COT DNA(Human Cot-1DNA，Lifetechnologies，1mg/mL)(用于阻断非特异性杂交，提高杂交效率)及1μg样本DNA文库，向混合物中加入2μmol的封闭引物(在杂交捕获过程中封闭文库接头序列，SeqCap EZ HE-OligoKit A，Roche)。将上述混合好的样本在真空浓缩仪中60℃蒸干，用于后续杂交。

ii)文库杂交与序列捕获：向上述样本中加入7.5μL2*杂交缓冲液(SeqCapHybridization and Wash Kit，Roche)和3μL杂交组分A(SeqCap Hybridization and WashKit，Roche)，至此，EP管中含有以下组分：

表2

将上述混合物涡旋震荡10秒，充分混匀后于最大转速(约13300rpm)下离心10秒。然后将上述混合物置于预先准备好的95℃加热模块上变性10分钟，变性完，室温下最大转速离心10秒。将上述混合物转移至含有4.5μL捕获芯片(即本发明设计的捕获探针文库)的0.2mL平盖PCR管中。涡旋震荡3秒，充分混匀后最大转速离心10秒。将杂交样本混合物置于47℃加热模块上16～24h(PCR仪热盖温度57℃)。

杂交反应后，将15μL样品转移至事先经过1*Bead Wash缓冲液洗涤重悬的100μL链霉亲和素标记磁珠中，混匀后于47℃孵育45分钟，每隔15分钟吹打混匀一次，让捕获的片段与磁珠结合，特异吸附目标片段。

iii)洗脱与富集纯化：样品的洗脱按照如下洗脱液依次进行：

a.孵育45分钟后，将100μL 47℃预热的1X Wash Buffer I加入上一步的反应管中，涡旋10秒以混匀，放入磁力架，待液体澄清，弃上清。

b.向反应管中加入200μL 47℃预热的1X Stringent Wash Buffer，吹打10次重悬磁珠，47℃孵育5分钟后，反应管放于磁力架上，液体澄清后弃上清，重复一次。

c.加入200μL的常温1X Wash Buffer I，并涡旋2分钟，将反应管放入磁力架，待液体澄清，弃上清。加入200μL的常温1X Wash Buffer II，并涡旋1分钟，放入磁力架，待液体澄清，弃上清。加入200μL的常温1X Wash Buffer III，并涡旋30秒，放入磁力架，待液体澄清，弃上清。

d.将反应管从磁力架上取出，向每个反应管内加入50μL的PCR级别用水。

洗脱后磁珠带着捕获的目标DNA片段，进入样本的LM-PCR富集。LM-PCR反应体系如下(一个捕获样本做两管PCR反应)：

表3

PCR反应条件为：98℃预变性45秒；98℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共14个循环；72℃延伸1分钟；4℃保温。

反应后，利用纯化磁珠AMPure beads纯化PCR扩增产物，得到捕获后的样本文库。

5.文库质检

使用2100Bio Analyzer(Agilent)/Labchip GX Touch(Caliper)测定文库片段大小，DNA片段大小应在150～500bp之间，使用Qubit测定文库浓度。

6.上机测序

本发明采用本领域技术人员熟知的二代测序平台进行高通量测序，将捕获的序列在Illumina测序平台采用边合成边测序的方法进行序列测定，测序平台：MiniSeq(Illumina)，测序试剂MiniSeq-High Output 300cycle。

7.数据处理及分析

i)分析得到变异数据，对结果进行过滤。过滤条件如下：

a.保留满足以下过滤条件的变异，碱基质量≥20，序列比对质量≥5，链偏好性<90％，变异位点总读数深度≥200，最低等位频率≥1.0％。

b.保留目标检测区域的变异。

c.保留非同义突变，或者位于基因编码区/选择新拼接位点的插入/缺失。

实施例1～4中分别采用离体的人类IIB期乳腺导管癌DNA、源发部位肿瘤组织样本DNA、左侧浸润性乳腺导管癌DNA、左胫骨肿瘤组织样本DNA样品，其样本的质量效果如附图1所示，其Q30值分别为90.76％，90.79％，91.74％，90.79％，说明大于90％的碱基质量高于Q30；覆盖度均为100％，说明数据完全覆盖目标区域；捕获效率分别是78.85、78.84、78.86、79.02，说明目标区域序列数与测定的总序列的比值大于78％；均一性分别是98.99、99.01、99.01、99.06，说明目标区域的数据分布均匀。

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

本实施例样本来源于IIB期乳腺导管癌患者，样本来源为离体的右侧乳房肿瘤组织样本提取的人基因组DNA。

按照前述3～7步中完成样本DNA提取、目标序列的杂交捕获、洗脱与富集纯化、文库质检、上机测序以及数据处理分析，所获DNA文库浓度为27.6ng/μL，结果如下：

8.结果

i)检测信息如下表：

表4

ii)如图2所示，该样本ERBB2基因发生L755_T759del变异，通过对样本的测序序列数据，与配对的正常人基因组DNA比较。确定突变的位点是ERBB2基因发生L755_T759del(755，759氨基酸发生缺失)变异，变异位于17号染色体19号外显子上，突变频率33.03％。

表5

iii)详细分析：

ERBB2人类表皮生长因子受体2(ERBB2)基因是原癌基因，是受体酪氨酸激酶(RTKs)家族成员之一，该家族包括EGFR/ERBB1、HER2/ERBB2/NEU、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4四个成员。ERBB2在肿瘤发生和胚胎发育中发挥着重要作用。ERBB2介导的胞内信号途径主要包括MAPK/ERK和PI3K/AKT途径，这些信号通路上的关键肿瘤分子标志物包括AKT、BRAF、KRAS、HRAS、NRAS、MEK1、PI3K和PTEN。ERBB2基因是原癌基因，在许多上皮来源的肿瘤中过度表达，如乳腺癌(18％～20％)、卵巢癌(25％～32％)、原发性肾细胞癌(30％～40％)等。

通过对样本的105个基因检测分析，发现ERBB2基因1个变异位点，为NM_004448.3(ERBB2):c.2263_2277del15(p.L755_T759del)。ERBB2(p.L755_T759del)突变与EGFR外显子19缺失突变同源。确定了基因突变的类型和具体突变位点有利于明确致癌原因。

实施例2

本实施例样本来源于离体的源发部位肿瘤组织样本提取的人基因组DNA。该肿瘤为原发性三阴性乳腺癌伴腋窝淋巴结转移，组织活检结果汇报G3pT1cpN1导管型。

按照前述3～7步中完成样本DNA提取、目标序列的杂交捕获、洗脱与富集纯化、文库质检、上机测序以及数据处理分析，所获DNA文库浓度为25.8ng/μL，结果如下：

8.结果

i)检测信息如下表：

表6

ii)如图3所示，该样本EGFR基因发生p.T790M变异，通过对样本的测序序列数据，与配对的正常人基因组DNA比较。确定突变的位点是EGFR基因发生p.T790M(790氨基酸发生改变)变异，变异位于7号染色体20号外显子上，突变频率51％。

表7

Iii)详细分析：

EGFR(epidermal growth factor receptor)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括EGFR/ERBB1、HER2/ERBB2/NEU、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4四个成员。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。

通过对样本的105基因检测分析，发现EGFR基因1个变异位点，为NM_005228.3(EGFR):c.2369C>T(p.T790M)。该突变为EGFR耐药突变。

实施例3

本实施例样本来源于离体的左侧浸润性乳腺导管癌，癌症病理分期为T2N0M0，淋巴血管浸润。

按照前述3～7步中完成样本DNA提取、目标序列的杂交捕获、洗脱与富集纯化、文库质检、上机测序以及数据处理分析，所获DNA文库浓度为26.2ng/μL，结果如下：

8.结果

i)检测信息如下表：

表8

ii)如图4所示，该样本的ERBB2基因发生拷贝数变异，通过样本的测序序列数据，与配对的正常人基因组DNA比较。发现样本的ERBB2基因发生拷贝数变异，>4个拷贝。

表9

iii).详细分析：

ERBB2是人类表皮生长因子受体2(ERBB2)基因是原癌基因，是受体酪氨酸激酶(RTKs)家族成员之一，该家族包括EGFR/ERBB1、HER2/ERBB2/NEU、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4四个成员。ERBB2在肿瘤发生和胚胎发育中发挥着重要作用。ERBB2介导的胞内信号途径主要包括MAPK/ERK和PI3K/AKT途径，这些信号通路上的关键肿瘤分子标志物包括AKT、BRAF、KRAS、HRAS、NRAS、MEK1、PI3K和PTEN。ERBB2基因是原癌基因，在许多上皮来源的肿瘤中过度表达，如乳腺癌(18％～20％)、卵巢癌(25％～32％)、原发性肾细胞癌(30％～40％)等。

通过对样本的105基因检测分析，发现ERBB2基因拷贝数扩增，且肿瘤组织中HER2表达为阳性。

实施例4

本实施例样本来源于离体的左胫骨肿瘤组织样本提取的人基因组DNA。

按照前述3～7步中完成样本DNA提取、目标序列的杂交捕获、洗脱与富集纯化、文库质检、上机测序以及数据处理分析，所获DNA文库浓度为35.2ng/μL，结果如下：

8.结果

i)检测信息如下表：

表10

ii)如图5所示，该样本有EML4/ALK融合，通过样本的测序序列数据，与配对的正常人基因组DNA比较。确定样本有EML4/ALK融合，EGFR缺失变异。

表11

iii)详细分析：

EML4(棘皮动物微管结合蛋白样4)基因与ALK(间变性淋巴瘤激酶)基因的融合是非小细胞肺癌(NSCLC)中多见的融合类型，EML4-ALK融合可导致ALK的酪氨酸激酶持续高表达，从而激活下游的信号通路，导致肿瘤的发生和转移。多项研究提示EML4-ALK基因融合在NSCLC中的频率一般为3～11％，多与腺癌、非吸烟和轻度吸烟者、年轻患者相关。

通过对样本的基因检测分析，发现NM_004304(ALK):EML4-ALK fusion。临床研究显示改突变为具有明确临床意义的致癌突变。

EGFR(epidermal growth factor receptor)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括EGFR/ERBB1、HER2/ERBB2/NEU、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4四个成员。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。许多肿瘤中有EGFR突变存在，在肺腺癌中EGFR的突变比率占50％以上，鳞癌中突变频率较低。EGFR酪氨酸激酶(TKI)区域的突变主要发生在18～21外显子，其中19号和21号外显子突变覆盖90％的突变。

通过对样本的基因检测分析，发现1个基因变异位点，为EGFR(NM_005228):c.2235_2249del15(p.E746_A750delELREA)。

临床研究显示EGFR E746_A750del缺失突变为具有明确临床意义的致癌突变，是EGFR-TKI类药物的敏感性突变位点。

通过以上结果显示，本发明提供的检测方法，结果灵敏度高，覆盖范围广。一次能同时检测105种肿瘤相关基因变异情况。所述实施例仅为本发明的几种实施方式，其描述较为具体，但并不能理解为对本发明的专利范围限制。因此，本发明专利的保护范围以所附权利要求为准。

Claims

1.一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)合成与靶点区间相应配对的捕获探针，碱基数在60～80nt之间、T_m值为50～65℃、无回文序列等特殊结构、与序列同源性在50～80％；

(4)对捕获目标区域的DNA序列进行PCR扩增，获得扩增产物；

(5)对步骤(4)中扩增产物进行纯化，质检，获得测序文库；

2.根据权利要求1所述的一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法，其特征在于，所述癌症相关基因包括癌症靶向用药基因，化疗耐药或敏感基因以及癌症驱动基因。

3.根据权利要求2所述的一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法，其特征在于，所述癌症靶向用药基因选自MTOR、JAK1、NRAS、RET、FGFR2、HRAS、WT1、CCND1、KRAS、ERBB3、CDK4、FLT3、BRCA2、AKT1、MAP2K1、IDH2、ERBB2、BRCA1、JAK3、ALK、MSH6、IDH1、ERBB4、MAPK1、PIK3CA、FGFR3、PDGFRA、KIT、ROS1、EGFR、MET、BRAF、EZH2、FGFR1、JAK2、CDKN2A、ARAF。

4.根据权利要求3所述的一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法，其特征在于，所述化疗耐药或药物敏感基因选自MTHFR、CDA、RAVER2、DPYD、CYP2C19、CYP2C9、CYP2C8、ABCC2、RRM1、SLCO1B1、LRP2、UGT1A7、UGT1A1、CYP2D6、UMPS、TPMT、ABCB1、KCNH2、MIR4673。

5.根据权利要求4所述的一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法，其特征在于，所述癌症驱动基因选自ARID1A、NOTCH2、ASTN1、PTEN、GSTP1、ATM、CBL、CHEK1、KDM5A、MARCH9、RB1、NTHL1、TSC2、PKD1、CDH1、TP53、NF1、SPOP、SMAD4、STK11、GNA11、KEAP1、XRCC1、KLC3、ERCC2、ERCC1、NFE2L2、SRC、GNAS、CHEK2、VHL、XPC、CTNNB1、RHOA、LETM1、FBXW7、PIK3R1、APC、NPM1、ESR1、HGF、SMO、KMT2C、MYC、GNAQ、PTCH1、ABL1、TSC1、NOTCH1。

6.根据权利要求5所述的一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法，其特征在于，所述高频突变位点的变异基因类型包括多癌基因融合、拷贝数变异、点突变和插入缺失变异。

7.根据权利要求6所述的一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法，其特征在于，所述的捕获探针为针对步骤(1)中筛选的靶点区间设计，碱基数在60～80nt之间，T_m值在50～65℃之间，无回文序列等特殊结构，与序列同源性在50～80％。

8.根据权利要求7所述的一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法，其特征在于，步骤(3)中提取基因组DNA后对DNA进行质量检测，所述DNA浓度大于20ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0。

9.根据权利要求8所述的一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法，其特征在于，步骤5)中对测序文库进行质量检测，文库浓度大于5ng/μL，片段大小150～500bp。