CN109880910B

CN109880910B - 一种肿瘤突变负荷的检测位点组合、检测方法、检测试剂盒及系统

Info

Publication number: CN109880910B
Application number: CN201910338312.6A
Authority: CN
Inventors: 邵阳; 张宪; 王富锋; 那成龙; 殷嘉妮; 郑佳
Original assignee: Nanjing Shihe Medical Devices Co ltd; Nanjing Shihe Gene Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Shihe Medical Devices Co ltd; Nanjing Shihe Gene Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-04-25
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2020-07-17
Anticipated expiration: 2039-04-25
Also published as: CN109880910A

Abstract

本发明涉及一种基于Panel测序检测肿瘤突变负荷(TMB)的位点组合、处理流程及计算方法，属于生物医学技术领域。本发明提供的肿瘤突变负荷的检测方法，对目标检测区域中的具体位点进行了优化：排除了中国人群中肿瘤发生发展相关高频突变位点，纳入了同义突变，使得基于Panel和全外显子测序的TMB结果高度一致，并在真实世界中有比较理想的临床预测效果。

Description

一种肿瘤突变负荷的检测位点组合、检测方法、检测试剂盒及系统

技术领域

本发明涉及一种基于捕获测序检测肿瘤突变负荷(TMB)的位点组合、处理流程及计算方法，属于生物医学技术领域。

背景技术

免疫治疗极大的改善了晚期肿瘤患者的生存。近两年来，多个免疫药物如Pembrolizumab等获批用于肿瘤患者的一线治疗。但是免疫治疗整体响应率偏低，寻找一些合适的biomarker筛选出免疫治疗的优势人群迫在眉睫。

肿瘤PD-L1的表达是第一个获批的免疫治疗biomarker，但是部分晚期患者可能缺少足量的肿瘤样本用于PD-L1的检测，不同的检测平台一致性较差等问题可能限制了PD-L1的应用。

TMB作为潜在的预测免疫治疗疗效的biomarker，日益受到临床医生的关注。肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden，TMB)被定义为一份肿瘤样本中，所评估体细胞基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换和插入/缺失突变的总数。体细胞的突变可转录/表达成RNA/蛋白水平，产生新的抗原、蛋白片段或多肽段等，这些新的蛋白被自身免疫系统识别为非自身抗原，激活T细胞，引起免疫反应。因此，肿瘤突变负荷越高，产生新抗原的概率越高，从而更能被免疫系统识别。当使用了免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor，ICI)来对抗免疫逃逸的肿瘤细胞，TMB水平越高的患者可能接受免疫治疗效果越好。

肿瘤突变负荷的预测主要依赖于NGS检测技术，其金标准为全外显子（WES）检测。然而，全外显子检测价格昂贵，检测深度低，对于低覆盖的位点可能漏检；同时全外显子检测目前主要应用于科研，对于临床患者的获益有限。研究者们在积极探索基于捕获测序(Panel)的方法检测TMB，有效降低测序成本，并且通过一次检测可以提示患者靶向治疗，免疫治疗，遗传风险等其它多方面的获益，但是基于panel的方法检测肿瘤突变负荷的准确性和可靠性不乏挑战。

发明内容

本发明的目的是：提供一种用于检测肿瘤突变负荷的位点组合，通过对该组合中的突变进行检测，可以达到与全外显子测序的TMB检测相等同的结果，并可以通过该位点组合达到对癌症治疗结果进行预测的目的。

本发明的第一个方面，提供了：

一种肿瘤突变负荷的检测位点组合，所述的位点组合中包含肿瘤相关基因的同义突变。

在一个实施方式中，所述的肿瘤相关基因包括如下所示的基因：

在一个实施方式中，所述的位点组合中不包含高频突变位点。

在一个实施方式中，所述的高频突变位点包括如下所示的位点：

本发明的第二个方面，提供了：

一种非治疗与诊断目的肿瘤突变负荷的检测方法，包括如下步骤：

S1，对肿瘤样本和对照样本进行DNA提取，富集上述位点组合，并进行高通量测序；

S2，对高通量测序的下机数据进行处理，并将数据比对至参考基因组上，分析肿瘤样本和对照样本得出体细胞突变；

S3，将权利要求1所述的位点组合上的体细胞突变中的所有突变的数量进行统计，计算出目标位点区域上的每兆碱基数中的突变数目。

在一个实施方式中，所述的所有突变是指单核苷酸变异（SNV）和插入缺失变异（Indel），其中包括同义突变。

本发明的第三个方面，提供了：

一种肿瘤突变负荷的检测装置，包括：

测序模块，用于对待测样本的DNA进行提取，并进行高通量测序，获得测序结果；

对比模块，用于对高通量测序的下机数据进行处理，并将数据比对至参考基因组上，获得突变信息；

分析模块，用于将所述的位点组合上的体细胞突变中的所有突变的数量进行统计，计算出目标位点区域上的每兆碱基数中的突变数目。

本发明的第四个方面，提供了：

一种用于检测肿瘤突变负荷的试剂盒，包括用于对权利要求1所述的位点组合进行检测的探针或引物。

本发明的第五个方面，提供了：

对权利要求1所述的位点组合进行检测的探针或引物在用于制备癌症治疗效果预测试剂中的应用。

在一个实施方式中，所述的癌症包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌症、甲状腺癌、肾癌、黑素瘤或者脑癌。

在一个实施方式中，所述的治疗效果是指无疾病生存期（PFS）。

有益效果

本发明提供了一种基于捕获测序检测肿瘤突变负荷的位点组合，相对于全外显子检测，本发明检测成本更低、与WES检测一致性较高，计算结果可以准确预测临床患者获益。

附图说明

图1是TCGA数据库中9037例WES样本测得体细胞突变数与本位点组合 panel覆盖范围内体细胞突变数的相关性。R1：皮尔逊相关性系数。R2：斯皮尔曼相关性系数。

图2是基于真实世界临床数据分析WES和Panel相关对比。

图3 是基于四分位法区分免疫治疗患者，比较TMB-High组和TMB-Low组的生存曲线。

具体实施方式

定义或术语

1、高通量测序：指的是第二代高通量测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。下一代测序(Next-generation sequencing, NGS)平台包括但不限于Illumina(Miseq、Hiseq2000、Hiseq2500、Hiseq3000、Hiseq4000、HiseqX Ten等)、ABI-Solid和Roche-454测序平台等。随着测序技术的不断发展，本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他方法的测序方法和装置进行本检测。根据本发明的具体示例，可以将根据本发明实施例的核酸标签用于Illumina、ABI-Solid和Roche-454测序平台等的至少一种进行测序。

2、Reads：是指来自核酸样品的一部分的序列信息。典型地，虽然并不一定是，reads代表样品中的相邻碱基对的短序列。reads可以通过样品部分的碱基对序列(以ATCG表示)以符号代表。它可以存储在存储设备中，且酌情处理，以确定它是否与参考序列匹配或者满足其它标准。reads可以直接地从测序装置中或者间接地从涉及样品的存储的序列信息中获得。在有些情况下，读数是足够长度(例如，至少约30bp)的DNA序列，其可以用于识别更大的序列或区域，例如，其可以与染色体或基因组区域或基因进行比对并且具体地分配给染色体或基因组区域或基因。

3、比对：将reads或标签与参考序列进行比较并且由此确定该参考序列是否含有该reads序列的过程。如果该参考序列含有该reads，则可以将该reads映射至参考序列，或者在某些实施方案中，映射至参考序列中的某个特定位置。在有些情况下，比对简单地告知reads是或不是特定参考序列的成员(即，该reads是存在还是不存在于参考序列中)。举例来说，将reads与人类染色体13的参考序列进行比对，将得知该reads是否存在于针对染色体13的参考序列中。提供这种信息的工具可以被判定集合成员身份测试器。在有些情况下，比对另外指示参考序列中reads或标签可以映射至其中的位置。举例来说，如果参考序列是全人类基因组序列，那么比对可以指示reads存在于染色体13上，并且可以进一步指示reads是在染色体13的具体股和/或位点上。

4、参考基因组/参考序列：指任何生物体或病毒的任何具体的已知基因组序列(无论是部分的或完整的)，它可以用于对来自受试者的识别的序列进行参比。例如，用于人类受试者以及许多其他生物体的参考基因组可见于美国国家生物技术信息中心（ncbi.nlm.nih.gov），对于人的样品来说，参照序列可以是人基因组hg18或hg19的序列。目前hg19的相关数据库相对较多且hg19测出来的碱基量比hg18要多，即样品比对率会相对较高，所以优先选择hg19。

5、种系突变和体细胞突变：通过对比肿瘤样本和对照样本可以得出每例样本的种系突变和体细胞突变。

种系突变：发生在生殖细胞中，生殖细胞突变可以遗传给后代，遗传的突变将存在于后代身体的每个细胞中。

体细胞突变：体细胞突变为获得性突变，由于环境因素的影响或者在DNA复制过程中发生突变，可表现在RNA、氨基酸和蛋白质水平，产生的新抗原、新表位或新蛋白片段，在肿瘤细胞中比较常见。

6、变异类型：根据碱基及染色体的变化可以将变异分为四类：单核苷酸变异（SNV）、插入缺失变异（Indel）、拷贝数变异（CNV）和基因融合（Fusion）。

单核苷酸变异（SNV）：单个碱基置换引起，导致编码氨基酸发生变化，如 EGFR基因L858R。

插入缺失突变（Indel）：多个碱基插入或缺失导致编码氨基酸的增加/减少，这些类型的突变可能是“框内的”，导致蛋白质中氨基酸的加入或减少，如EGFR基因第19号外显子缺失；或可导致“移码”，通常导致蛋白质的过早截短。

拷贝数变异（CNV）:染色体局部区域发生扩增或缺失，导致编码蛋白过表达或表达减少如MET基因扩增。

基因融合（Fusion）：染色体层面断裂重排，包括由多个染色体之间或单个染色体内的断点引起的易位或倒位，可能产生新的融合蛋白，如ALK基因融合。

肿瘤突变负荷的计算不管是全外显子检测或者基于Panel的捕获测序，一般不考虑拷贝数变异和基因融合的变异，本专利中TMB的计算同样予以排除。

7、同义突变和非同义突变：是从碱基变化是否引起蛋白改变的层面进行分析区分为同义突变和非同义突变。

同义突变：指碱基的变化并不造成所编码氨基酸的改变。

非同义突变：是碱基的突变造成所编码氨基酸的改变。

第6和第7个定义是从两个维度对突变进行归类：其中第6个定义是从碱基/染色体的层面，第7个定义是从碱基引起的蛋白层面变化进行分类。

8、肿瘤突变负荷，为便于描述，本文中涉及的肿瘤突变负荷（TMB）分为两种：第一种是针对全外显子检测的肿瘤突变负荷，也即WES TMB；第二种是针对目标区域进行捕获的肿瘤突变负荷，也即Panel TMB。

肿瘤突变负荷的计算公式为：突变总个数/测序覆盖的编码区碱基兆数。

测序覆盖的编码区碱基兆数定义为测序针对的测定编码区域大小，其计算为将各个被设计用来捕获相关基因的探针之间去除重叠部分后累计得到；捕获目标区域相关基因的探针为目标探针，捕获全外显子相关基因的探针为全外显子探针。

突变个数:指在测序区域内，一个SNV为1个突变，一个Indel为1个突变，不考虑插入缺失的长度情况，累计得到的数量为突变个数。

TMB不同分位：按照TMB值从高到低排列，根据不同的分位将患者分为不同的人群，以四分位为例：前1/4的为TMB-High人群，其余的3/4为TMB-Low人群。

无进展生存期（PFS）：患者从用药开始到疾病进展/死亡的时间间隔。PFS是临床常用的评估患者获益的指标，一般PFS越长，患者获益越大。

技术方案

本发明提供的肿瘤突变负荷的检测方法，对目标检测区域中的具体位点进行了优化：排除了中国人群中肿瘤发生发展相关高频突变位点，纳入了同义突变，使得基于Panel和全外显子测序的TMB结果高度一致，并在真实世界中有比较理想的临床预测效果。

本发明提供了基于Panel探针捕获的方法检测肿瘤突变负荷的位点组合，所述的组合中不包含中国人群肿瘤发生发展相关的高频突变位点，并且纳入了同义突变。

本发明发现，通过在位点组合中删除掉中国人群肿瘤发生发展相关的高频突变位点并纳入同义突变后，可以显著提高对采用该位点组合得到的TMB计算结果与WES计算结果之间的一致性。

高频基因位点：在肿瘤发生发展中高频发生。由于发生频率较高，无法代表整个基因组的变异情况，在计算肿瘤突变负荷时如果纳入可能引起较大偏差，因此予以排除，只保留随机发生的肿瘤突变。本发明专利中计算TMB过程中，基于中国人群的突变特征，总结了中国人群中高频的突变位点予以排除。

高频的突变位点包括2种：驱动基因的激活突变和抑癌基因的失活突变，均可能引起肿瘤发生发展，并且这些变异发生具有规律性，发生频率较高。驱动基因激活突变包括肺癌中常见的EGFR基因19外显子缺失，结直肠癌的KRAS基因G12D变异等；抑癌基因的失活突变包括TP53基因、APC基因等截短和移码突变等。TP53和APC是各大癌种中最常见的意义明确且发生频率较高的抑癌基因，TP53和APC的失活是肿瘤形成的重要原因，常见的变异类型包括点突变，非移码、移码和截短突变，其中明确为失活突变的有移码和截短突变，所以在本专利中考虑排除，而对于点突变可能对蛋白功能不造成影响，予以保留。高频突变位点如下表：

为了减小WES测序的工作量，结合以上的排除和纳入位点的标准，在一个实施方式中，本发明采用了以下的由425个基因构成的基因组合来对样本的TMB进行检测：

对于测序和检测方法，通过对肿瘤样本和对照样本进行DNA提取，富集本组合的相关位点，并进行高通量测序；对下机数据进行处理，通过BWA比对软件获得到相关的突变信息，分析肿瘤样本和对照样本得出种系突变和体细胞突变；将编码区域体细胞突变中的所有突变包括同义突变纳入统计，排除高频突变位点，计算出目标位点区域上的每兆碱基数中的突变数目记为肿瘤突变负荷(TMB)。

其中的测序方法，需要对肿瘤样本，对照样本进行NGS测序，通过高通量测序的方法获得相应位点的序列信息可以按照常规的实验方法、教科书、探针设计方法、测序仪使用手册中的描述进行，主要的流程包括：对每个肿瘤样本和对照样本进行DNA提取，获取基因组DNA；对DNA片段过大的样本，通过超声破碎，将样本机械力打断至200-350碱基对；对片段化的DNA分子执行末端修复、添加腺嘌呤、文库接头连接等操作；获得的DNA文库与长度为120碱基的单链生物素标记DNA探针分子杂交，再以链霉亲和素包裹的磁珠分离捕获的DNA文库分子；在illumina下一代测序仪上进行测序。测序反应获得的数据通过生物信息学分析。在获得了相应的测序信息后，可以采用常规方法做数据进行预处理，这里的处理主要是对测序所得的每个样本序列分别进行过滤，以去除掉不合格的序列和接头序列，其中，样本包括肿瘤样本(即，变异组织)和对照样本(即，正常组织)；具体地，对高通量测序后的样本序列进行过滤，去除不合格的序列及接头序列，其中，不合格序列可以为下列情况中的至少一种：测序质量低于某一阈值的碱基个数超过整条序列碱基个数的一定比例(例如，50%)和序列中测序结果不确定的碱基(例如，Illumina GA测序结果中的N)个数超过整条序列碱基个数的一定比例(例如，10%)。其中，高通量测序技术可以为Illumina GA或者HiSeq测序技术，也可以为现有的其他高通量测序技术，低质量阈值可以由具体测序技术和测序环境确定。在对读段进行了预处理之后，将过滤后的每个样本序列分别比对到参考基因组序列，对比对后的每个样本序列分别进行筛选以得到唯一比对的样本序列，确定每个唯一比对的样本序列相对于参考基因组序列的位置信息，并对位置信息进行排序；具体地：(1)首先可以通过任何一种短序列映射程序(例如，短寡核苷酸分析包(Short Oligo nucleotidAnalysis Package, SOAP))将过滤得到的每个样本序列(即，由多个测序片段数据构成的序列)分别比对到参考基因组序列(例如，人类基因组参考序列)得到每个样本序列在参考基因组上的位置情况；(2)然后，对比对结果进行一系列的筛选，例如，去除比对到多个位置的序列(因为这个序列已无法准确唯一的提供比对位置信息)、去除重复出现的序列(因为这些序列可能是由于前期实验引入的误差，如由测序错误引起，为使检测结果更加精准，故去除)，以得到唯一比对的序列结果。

为了充分提高本位点组合检测TMB的准确性和可靠性，分别通过技术验证和临床验证进行TMB计算位点组合的优化，主要通过两个阶段完成。

本发明提供的TMB位点组合，可以应用于各类癌症的治疗效果的预测，癌症的实例包括但不限于，乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌症、甲状腺癌、肾癌、癌、黑素瘤和脑癌。

1.技术验证WES和本位点组合（Panel）检测TMB一致性的最佳位点组合

利用生物信息学方法，收集The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库全外显子组测序（whole exome sequencing, 或WES）的公共数据（从TCGA数据库获得全外显子组测序结果共9037例），并对收集到的所有外显子范围内的数据计算TMB，分别对WES数据和panel覆盖范围内的突变数据进行比较。另外，本示例中肿瘤突变负荷TMB未进行标化处理，仅仅统计比对得到的符合要求的突变数目，将其直接用于评价与WEB测序结果的相关性，即均未除以覆盖碱基数，在实际使用时，也可以通过常用的方法对其进行标准化处理，除以覆盖区域的每兆碱基数，标化处理对于评价本发明的技术效果并不产生影响；另外，本专利并未划分最终TMB的阈值，因此对整体结果并无影响，在实际使用时，使用者可以采用合适的统计学方法进行阈值的确定。本发明中，其中WES检测全外显子区碱基数30Mb，Panel测序覆盖的编码区碱基为1.4Mb。

对于WES测序数据，其TMB通过下式计算：

TMB（WES）=全外显子上的突变总个数。

对于425个基因构成的基因组合panel的测序数据

TMB（panel）=425个基因覆盖范围内的突变总个数。

对于TMB（panel）的计算统计，采用的位点考虑了以下几种情况：

A：纳入了所有非同义突变；

B：在条件A的基础上去除上述的高频突变突变位点；

C：在A和B的基础上考虑/不考虑同义突变的影响；

因此，TMB（panel）的统计过程共以下4种情况，如下表所示，在4种情况下与TMB（WES）结果的相关性也同时列于表中。

1、纳入panel所有非同义突变，且纳入高频突变位点，纳入同义突变；

2、纳入panel所有非同义突变，且排除高频突变位点，纳入同义突变；

3、纳入panel所有非同义突变，且纳入高频突变位点，排除同义突变；

4、纳入panel所有非同义突变，且排除高频突变位点，排除同义突变；

从结果中可以看出，当保留同义突变而去除热点突变时，皮尔逊相关性系数和斯皮尔曼相关性系数均高于其他实验条件，R1=0.9875，R2=0.7522，最终采信（详见图1）。

2. 临床验证WES和本位点组合（Panel）检测TMB的一致性

为了进一步验证实际临床中基于第一阶段确定的实验条件进行TMB分析的准确性，本方案纳入了某免疫治疗临床试验样本，进一步分析panel和WES检测的一致性。

该临床试验共计纳入69例IV期复发/转移的非小细胞肺癌患者，收集患者的样本和临床治疗信息。其中肺腺癌患者47例，肺鳞癌患者15例，其它未区分患者7例，男女比例8:2。

对上述的临床试验中的样本分别进行全外显子（WES）检测和基于本位点组合的panel检测。按照上述的TMB（panel）的统计过程的4种情况进行TMB的计算，同样以WES检测的TMB为金标准。得到的相关系数结果如下：

其中，采用了纳入panel所有非同义突变，且排除高频突变突变位点，纳入同义突变的情况为最优结果，相关性检验图如图2所示。WES和Panel检测整体相关性：皮尔逊相关性系数为0.9275，略低于TCGA数据，而斯皮尔曼相关系数为0.8441，高于TCGA数据。

3. 临床验证WES以及Panel检测TMB的临床预测效果

以WES四分法判定TMB结果为金标准，分析panel所得TMB判定的准确性（accuracy）、灵敏度（sensitivity）、特异性（specificity）。将TMB高于阈值的定为TMB-High，TMB低于阈值的定为TMB-Low。

在四种不同的数据处理条件下对样本的划分结果如下：

情况1、纳入panel所有非同义突变，且纳入高频突变突变位点，纳入同义突变；

情况2、纳入panel所有非同义突变，且排除高频突变突变位点，纳入同义突变；

情况3、纳入panel所有非同义突变，且纳入高频突变突变位点，排除同义突变；

情况4、纳入panel所有非同义突变，且排除高频突变突变位点，排除同义突变；

最终得到的验证结果如下表：

采用了纳入panel所有非同义突变，且排除高频突变突变位点，纳入同义突变时计算的panel TMB与WES TMB的准确性/灵敏度/特异性一致性最好。

同样基于该临床研究，采用了四分位法将患者区分为TMB-High和TMB-Low，即将TMB值按照从高到低排列，前1/4的为TMB-High，其余的3/4为TMB-Low。基于测得TMB将病人分为两组，使用Kaplan-Meier Plot绘制两组病人的PFS的生存曲线，使用log-rank统计学检验测试生存曲线显著性。风险比（HR）和显著性判定中的p值分别如下表所示，p值＜0.05为差异显著：

采用了本发明的判定标准（纳入panel所有非同义突变，且排除高频突变突变位点，纳入同义突变）log-rank检验所得p值最为显著p value=0.03，意味着TMB-H组的患者的PFS显著优于TMB-L患者，患者获益显著提高，且HR最小，为0.48；即TMB-H患者较TMB-L患者而言降低了52%的进展风险，认定划分方式合格（详见图3）。

Claims

1.对基因组合中的基因突变进行检测的试剂盒在用于制备肿瘤突变负荷检测装置中的应用；其特征在于，所述的肿瘤突变负荷检测装置是用于肺癌免疫治疗中无疾病生存期的预测；

所述的基因组合由如下所示的基因组成：

ABCB1、ABCB4、ABCC2、ADH1A、ADH1B、ADH1C、AIP、AKT1、AKT2、AKT3、ALDH2、ALK、AMER1、APC、AR、ARAF、ARID1A、ARID1B、ARID2、ARID5B、ASCL4、ASXL1、ATF1、ATIC、ATM、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN2、AXL、B2M、BAD、BAI3、BAK1、BAP1、BARD1、BAX、BCL2、BCL2L11、BCR、BIRC3、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BTG2、BTK、BUB1B、c11orf30、CASP8、CBL、CBLB、CCND1、CCNE1、CD274、CD74、CDA、CDC73、CDH1、CDK10、CDK12、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CEP57、CHD4、CHEK1、CHEK2、CREBBP、CRKL、CSF1R、CTCF、CTLA4、CTNNB1、CUL3、CUX1、CXCR4、CYLD、CYP19A1、CYP2A13、CYP2A6、CYP2A7、CYP2B6*6、CYP2C19*2、CYP2C9*3、CYP2D6、CYP3A4*4、CYP3A5、DAXX、DDR2、DENND1A、DHFR、DICER1、DLL3、DNMT3A、DPYD、DUSP2、EGFR、EML4、EP300、EPAS1、EPCAM、EPHA2、EPHA3、EPHA5、EPHB2、ERBB2、ERBB2IP、ERBB3、ERBB4、ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ESR1、ETV1、ETV4、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCL、FANCM、FAT1、FBXW7、FGF19、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FOXA1、FOXP1、FRG1、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA6、GNA11、GNAQ、GNAS、GRIN2A、GRM3、GRM8、GSTM1、GSTM4、GSTM5、GSTP1、GSTT1、HDAC2、HDAC9、HGF、HLA-A、HNF1A、HNF1B、HRAS、HSD3B1、IDH1、IDH2、IFNG、IFNGR1、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL7R、INPP4B、IRF2、JAK1、JAK2、JAK3、JARID2、JUN、KDM5A、KDM6A、KDR、KEAP1、KIF1B、KIF5B、KIT、KITLG、KLLN、KMT2A、KMT2B、KMT2C、KMT2D、KRAS、LHCGR、LMO1、LRP1B、LYN、LZTR1、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAP3K4、MAP4K3、MAX、MCL1、MDM2、MDM4、MECOM、MED12、MEF2B、MEN1、MET、MGMT、MITF、MLH1、MLH3、MLLT1、MLLT3、MLLT4、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、MTHFR、MTOR、MUTYH、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYH9、NAT1、NBN、NCOR1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NKX2-1、NKX2-4、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NQO1、NRAS、NRG1、NSD1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PAK3、PALB2、PALLD、PARK2、PARP1、PARP2、PAX5、PBRM1、PDCD1、PDCD1LG2、PDE11A、PDGFRA、PDGFRB、PDK1、PGR、PHOX2B、PIK3C3、PIK3CA、PIK3R1、PIK3R2、PKHD1、PLAG1、PLK1、PMS1、PMS2、POLD1、POLD3、POLE、POLH、POT1、PPARD、PPP2R1A、PRDM1、PRF1、PRKACA、PRKACG、PRKAR1A、PRKCI、PRKDC、PRSS1、PRSS3、PTCH1、PTEN、PTK2、PTPN11、PTPN13、PTPRD、QKI、RAC1、RAC3、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L、RAF1、RARA、RARG、RASGEF1A、RB1、RECQL4、RELN、RET、RHOA、RICTOR、RNF43、ROS1、RPTOR、RRM1、RUNX1、RUNX1T1、SBDS、SDC4、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SEPT9、SETBP1、SETD2、SF3B1、SGK1、SLC34A2、SLC3A2、SLC7A8、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD7、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SOS1、SOX1、SOX14、SOX2、SOX21、SPOP、SPRY4、SRC、SRY、STAG2、STAT3、STK11、STMN1、STT3A、SUFU、TAP1、TAP2、TEK、TEKT4、TERC、TERT、TET2、TGFBR2、THADA、TMEM127、TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF11A、TNFRSF14、TNFRSF19、TNFSF11、TOP1、TOP2A、TP53、TP63、TPMT、TSC1、TSC2、TSHR、TTF1、TUBB3、TUBB4A、TUBB4B、TUBB6、TYMS、U2AF1、UGT1A1、VAMP2、VEGFA、VHL、WAS、WISP3、WRN、WT1、XPA、XPC、XRCC1、YAP1、ZNF2、ZNF217、ZNF703；

所述的肿瘤突变负荷检测装置包括：

对比模块，用于对高通量测序的下机数据进行处理，并将下机数据比对至参考基因组上，获得突变信息；所述的参考基因组是人基因组hg19版；

分析模块，用于将所述的基因组合中基因的体细胞突变中的所有突变的数量进行统计，计算出每兆碱基数中的突变数目；

所述的所有突变是指单核苷酸变异和插入缺失变异；

所述的单核苷酸变异是指单个碱基置换；所述的插入缺失变异是指多个碱基插入或缺失；

并且，所述的所有突变中含有同义突变，且不含有高频突变；所述的高频突变是指如下所示的突变：

。