CN112779338B - 用于食管癌预后评估的基因标志物 - Google Patents

用于食管癌预后评估的基因标志物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于食管癌预后评估的基因标志物，属于医学分子生物学技术领域。本发明通过大量样本的筛选和分析，找到了一种用于食管癌预后评估的基因标志物，包括以下基因：YAP1、MYC、BAP1、BRIP1、WRN以及RB1；并且构建了可以用于对食管癌患者的总生存期（OS）进行评估的联合标志物，能够有效地对高危/低危的食管癌患者进行预测。

Description

用于食管癌预后评估的基因标志物
技术领域
本发明涉及用于食管癌预后评估的基因标志物，属于医学分子生物学技术领域。
背景技术
食管癌(Esophageal cancer,EC)在我国食管癌的发病率和死亡率均高于全球平均水平，且男性发病和死亡的中标率(16.50/10万和12.66/10万)均高于女性(5.92/10万和4.17/10万)。中国食管癌患者95％以上是食管鳞癌(Esophageal squamous cellcarcinoma,ESCC)，而欧美国家多为食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma,EAC)。吸烟和饮酒是ESCC的两个高风险因素，其他风险因素还包括嚼槟榔和食用热的食物等，而肥胖是EAC的重要风险因素。食管癌的5年生存率取决于多种因素，包括肿瘤大小、分化程度、临床分期、其他脏器转移等等。在中国，食管癌患者的5年生存率约为40％。在美国，根据SEER数据库(cancer.org)，仅具有局部肿瘤的食管癌患者5年生存率是47％，而所有食管癌患者的5年生存率仅20％。根据美国国家综合癌症网络(NCCN)指南，外科手术是局部晚期可切除食管癌患者的主要治疗方法，另外需要进行术前放化疗或围手术期化疗以提高生存率。在食管癌患者中还探索了靶向治疗策略，包括HER2靶向治疗、抗血管治疗和免疫治疗。HER2抑制剂Trastuzumab(曲妥珠单抗)已被FDA批准用于HER2阳性晚期食管癌中。靶向VEGFR2单抗Ramucirumab(雷莫芦单抗)已被批准用于晚期或转移性胃癌及胃食管交界腺癌治疗，最初是单药治疗，随后是与紫杉醇的联合治疗。Pembrolizumab(帕博利珠单抗)于2017年被FDA批准用于微卫星不稳定性高和/或PD-L1表达高的食管癌患者。二代测序(NGS)能够同时对多个基因多种突变类型进行检测，是继Sanger测序后的革命性进步，已被广泛应用于临床肿瘤实践中。通过对患者肿瘤分子特征进行检测，来制定针对患者的个体化治疗方案。尽管已有多项研究发现食管癌的发生发展过程中可能存在大量分子异常改变，其中发生频率较高的基因包括TP53、NOTCH1、PIK3CA、RB1、CDKN2A等，但是关于食管癌基因变异与预后关系的研究相对较少。
发明内容
本发明的通过基因数据与临床数据的筛选，找到了可以用于评估食管癌患者的总生存期(OS)关联的基因标志物，利用标志物对患者的远期生存率进行评估时，具有较好的区分效果。
本发明筛选得到了3个新的可以用于评估食管癌患者的总生存期(OS)的标志物，分别为BAP1突变，BRIP1突变以及RB1基因变异。
本发明还通过将筛选得到的具有预后差异趋势(P<0.06)的6个基因构建了具有较高分类准确性的联合判别模型，可以对患者的OS进行有效的评估，其准确性远优于单个基因模型的判定准确性。
技术方案是：
本发明的每一个目的是提供了：一种用于食管癌预后评估的基因标志物，包括以下基因：YAP1、MYC、BAP1、BRIP1、WRN以及RB1。
在一个实施方式中，所述的YPA1基因的拷贝数扩增、MYC基因的拷贝数扩增、BAP1基因发生的突变、BRIP1基因发生的突变、WRN基因发生的突变、RB1基因发生的突变和缺失。
本发明的每二个目的是提供了：用于检测上述基因标志物的试剂盒。
本发明的第三个目的是提供了：用于检测上述基因标志物的试剂在用于制备食管癌患者的总生存期(OS)的评估试剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供了：用于检测BAP1、BRIP1或者RB1基因的试剂在用于制备食管癌患者的总生存期(OS)的评估试剂中的应用。
在一个实施方式中，所述的应用中还包括如下步骤：通过如下公式计算出样本的风险评分：评分S＝20*TBAP1+23*TBRIP1+7*TMYC+18*TRB1+15*TWRN+17*TYAP1，T分别是指BAP1、BRIP1、MYC、RB1、WRN、YAP1基因的突变情况，野生型为0，变异型为1。
本发明的第五个目的是提供了：一种用于食管癌预后评估的装置，包括：
测序模块，用于对样本进行测序，获得基因标志物的数据信息；
评分模块，用于对测序模块中得到的数据按照下式计算出评分：
评分S＝20*TBAP1+23*TBRIP1+7*TMYC+18*TRB1+15*TWRN+17*TYAP1，野生型为0，变异型为1；
判定模块，用于对样本按照评分模块中得到的评分进行分类，预测生存率。
本发明的第六个目的是提供了：
一种计算机可读取介质，其记载有可以运行以下方法的计算机程序：
步骤1，获得以下基因的突变信息：所述的YPA1基因的拷贝数扩增、MYC基因的拷贝数扩增、BAP1基因发生的突变、BRIP1基因发生的突变、WRN基因发生的突变、RB1基因发生的突变和缺失；
步骤2，通过如下公式计算出样本的风险评分：
评分S＝20*TBAP1+23*TBRIP1+7*TMYC+18*TRB1+15*TWRN+17*TYAP1，T分别是指BAP1、BRIP1、MYC、RB1、WRN、YAP1基因的突变情况，野生型为0，变异型为1；
步骤3，根据患者样本的评分对患者的食管癌治疗预后情况进行分类，大于阈值的样本被判定为具有更差预后的样本。
附图说明
图1是测序后分析得到的基因图谱
图2局部晚期食管癌患者不同风险评分下的1年内死亡风险
图3A和图3B分别是AEC队列和TCGA队列中模型高低危风险组总生存期Kaplan-Meier生存曲线
具体实施方式
本发明的研究中，对来自69名亚裔食管癌患者的肿瘤组织进行了靶向panel测序。使用单因素分析，6个基因变异被证明是食管癌患者总生存期的潜在预后生物标志物，为了提高预测的准确性，构建了多变量联合模型，并在143名食管癌患者的独立TCGA队列中进行了验证。
本发明中所提及的扩增是指基因拷贝数变异，具体是指染色体局部区域发生大小介于1kb至3Mb的DNA片段扩增，导致编码蛋白过表达。
本发明中所提及的缺失是指基因拷贝数变异，具体是指染色体局部区域发生大小介于1kb至3Mb的DNA片段缺失，导致编码蛋白表达减少。
本发明中所提及的突变是指单个碱基改变所引起的单核苷酸变异，或者20个以内的碱基插入、缺失和重复，导致编码氨基酸发生变化。
本发明中所提及的变异是指基因发生了突变或者拷贝数发生变化(即上述的扩增或缺失)。
临床研究中的样本情况
AEC队列检测了69名亚裔食管癌患者的肿瘤组织样本，该研究的患者年龄范围为41岁至83岁，平均年龄为64岁。81.60％的患者为男性，其余(17.39％)是女性。几乎所有患者均为鳞状细胞癌(SCC，98.55％)，仅1例患者为腺癌(ADC)。II期17例(24.64％)，III期40例(57.97％)和IV期12例(17.29％)。其中，吸烟者占65.22％，一半以上有饮酒史(52.17％)。88.40％的食管癌患者曾接受放化疗治疗。
TCGA队列由143名食管癌患者组成，包括46例(32.17％)亚裔病例，77例(53.84％)高加索病例和20例(13.99％)其他种族病例。中位年龄为61岁，范围是从36岁到90岁。与AEC队列相似的是，TCGA队列的大多数是男性(87.41％)。组织学亚型包括39.86％的ADC和60.13％的SCC。II期78例患者(54.55％)，III期56例患者(39.16％)和IV期9例患者(6.29％)。在TCGA队列中，不吸烟者占58.74％，从未饮酒的患者占55.94％。
具体的样本如表1所示：
表1 AEC和TCGA队列中患者的人口统计学特征
Figure BDA0002960483900000041
Figure BDA0002960483900000051
模型中患者总生存期(OS)计算是从食管癌病理确诊时间到死亡或最后一次随访日期。
临床相关影响因素的确定
部分临床病理特征可能是癌症治疗预后的潜在预测指标。我们在AEC队列中使用单因素Log-rank分析了这些可能的临床及基因组特征与患者总生存期(OS)的关联。如表2所示，AEC队列的临床特征，包括性别、年龄、吸烟状况和饮酒等可能不是OS的预测指标(P>0.05)。TNM分期方面，与II期相比，III-IV期患者的预后较差，但未达到统计学显著性(P＝0.120)。
表2：Log-rank筛选局部晚期食管癌预后相关临床因素
临床特征 HR(95％CI) P值
性别:男性vs.女性 0.84(0.39～1.84) 0.664
年龄:≥65岁vs.<65岁 0.76(0.40～1.42) 0.385
TNM分期:Ⅲ/IV期vs.Ⅱ期 1.80(0.85～3.84) 0.120
吸烟史：有vs.无 1.01(0.51～2.02) 0.968
饮酒史：有vs.无 1.08(0.58～2.02) 0.804
单因素分析与食管癌预后相关基因突变
AEC队列患者治疗前肿瘤组织样本使用世和基因的422基因panel进行二代测序基因检测,该基因panel全面覆盖重要癌症相关信号通路基因，具体基因列表见表3：
表3：422panel基因列表
Figure BDA0002960483900000052
/>
Figure BDA0002960483900000061
DNA提取和测序文库制备
使用QIAamp DNA FFPE组织提取试剂盒(Qiagen)，通过从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本中提取基因组DNA。所有样本均通过病理医生证实其肿瘤含量至少为10％。分别使用Qubit3.0荧光定量仪和NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific)评估提取的DNA的浓度和质量。然后，使用Covaris M220超声系统将基因组DNA超声破碎成350bp片段，并用Agencourt AMPure XP beads(Beckman Coulter)进行纯化。使用KAPA Hyper PrepKit(KAPA Biosystems)制备测序文库。将带有不同分子标签的文库混合。使用上述的422个基因panel和IDT xGen Lockdown Reagents对混合文库进行靶向富集。富集后的文库采用Illumina p5(5'AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA 3')和p7(5'CAA GCA GAA GAC GGC ATACGA GAT 3')引物在KAPA Hifi Hot Start Ready Mix(KAPA Biosystems)中进行扩增，然后通过qPCR方法用KAPA Library Quantification kit(KAPA Biosystems)定量测序文库。最终文库采用Illumina Hiseq 4000平台进行测序，平均测序深度至少为250×。
测序结果分析
测序数据经由过验证的世和基因生信自动化流程进行分析，主要步骤如下所述。采用bck2fastq进行数据拆分，然后用Trimmomatic进行FASTQ文件质量过滤(QC)。删除低质量碱基(based phredscore低于15)或N碱基。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA-mem，v0.7.12；https://github.com/lh3/bwa/tree/master/bwakit)将所测序列比对到人类参考基因组hg19上，应用Picard去除PCR所导致的重复序列。使用Genome Analysis Toolkit(GATK 3.4.0)在插入缺失周围进行局部组装校正比对并重新校准碱基质量分数。VarScan2软件用于检测单核苷酸变异(SNV)和插入/缺失突变，参数如下：最小测序深度＝20，最小碱基质量＝25，最小变异等位基因频率(VAF)＝0.03，最小变异支持读数＝3，正负两条链均测到变异，并且链偏倚不大于10％。在接下来的过滤步骤中，只有当VAF高于1％且至少有3个突变读数的COSMIC热点(recurrence>＝20)突变，或者至少5个变异支持读数的其他突变才会被读出。由ANNOVAR针对以下数据库注释：dbSNP(v138)，1000Genome，ExAC，COSMIC(v70)，ClinVAR和SIFT。如果突变在1000Genomes Project或65000exomes project(ExAC)中的人群频率>1％则被移除。然后，突变列表将通过内部收集的同一测序平台上的重复测序错误列表进行过滤，该列表来源于53个最小平均测序深度为700x的正常样本的测序结果总结。如果某变异(如≥3个突变读数且>1％VAF)在>20％的正常样品中被检测到，则认为其可能是人为错误并被移除。在重复区域内发生的突变也将被除去。在接下来的过滤步骤中，仅当VAF高于2％且至少有3个突变读数的COSMIC突变，或者VAF高于3％且至少有5个突变读数的非COSMIC突变才会被读出。
对于CNV分析，我们将微滴数字聚合酶链反应(ddPCR)结果作为“金标准”，采用38个样本对我们的CNV程序进行综合试验验证。我们通过对同一批次中100个正常样品进行主成分分析，降低拷贝数数据中的系统噪音。对于拷贝数丢失，阈值为0.65，对于拷贝数增加，阈值为2.0。
数据分析
患者总生存期(OS)计算是从食管癌病理确诊时间到死亡或最后一次随访日期。采用Kaplan-Meier方法估计不同基因组的OS，并使用log-rank检验分析组间差异。多因素Cox比例风险模型评估基因变异的预后价值。
对患者的肿瘤体细胞突变和拷贝数变异进行分析。通过二代测序基因测序，首先描绘了食管癌的突变图谱的分布情况，并进行了初步筛选，将体细胞变异频率大于5％以上的80个体细胞变异作为候选对象。
研究中绘制了亚洲人群的食管癌患者的基因图谱，并与TCGA队列进行了对比。AEC队列和TCGA队列的基因组图如图1所示。在AEC队列中，近95％的患者有TP53基因突变，超过一半的患者携带NOTCH1突变。在36.2％的病例中发现了FGF19和CCND1基因的共扩增现象。AEC队列中其他高频率的突变基因还包括MCL1(39.1％)，MYC(31.9％)，PIK3CA(21.7％)和EP300(18.8％)。在TCGA队列中，TP53(85.3％)和PIK3CA(19.6％)是最常见的两个突变基因。与AEC队列相比，发现FGF19和CCND1的共扩增比例略低(33.6％)。在两个队列中均鉴定出多个DNA损伤修复基因的改变，包括ATM(10.1％vs 13.3％)，ATR(11.6％vs 4.9％)，SMARCA4(7.2％vs 6.3％)。
然后，在AEC训练组中，通过Log-rank筛选出与局部晚期食管癌预后相关的体细胞变异，建立预测模型过程中纳入保留统计学有差异趋势的位点(P<0.06)，体细胞突变的Log-rank筛选结果分布见表4。
表4：Log-rank筛选局部晚期食管癌预后相关体细胞变异(n＝80)
Figure BDA0002960483900000081
/>
Figure BDA0002960483900000091
/>
Figure BDA0002960483900000101
根据上表的筛选结果可以看出，TP53具有较高的突变频率，但是在OS的评估中却并没有表现出足够的显著性(P＝0.510)，同时，还研究了POLE基因的突变和DDR基因的变化与OS的关联，但是并没有表现出显著相关性。
对于上述的80个初步筛选得到的基因，进一步进行筛选的标准是：P值小于0.06且AEC队列中突变频率高于5％，得到如表5中所示的基因，这七个基因改变的频率从5.8％到31.88％不等。本发明中首次发现了BAP1、BRIP1和RB1的基因变异与食管癌的预后显著相关(P<0.05)，KDR和WRN基因变异的患者也有较差预后趋势(P<0.06)。
表5：局部晚期食管癌预后相关体细胞变异
基因(突变类型) 患者例数(n) HR(95％CI) P值
BAP1(突变) 4 4.12(1.23～13.87) 0.013
BRIP1(突变) 4 3.74(1.29～10.84) 0.009
KDR(突变) 4 3.02(0.91～9.98) 0.057
MYC(扩增) 22 1.88(0.99～3.54) 0.049
RB1(突变和缺失) 7 3.03(1.25～7.35) 0.010
WRN(突变) 4 3.07(0.93～10.11) 0.053
YAP1(扩增) 5 3.61(1.38～9.46) 0.005
为了控制其它多个混杂因素的影响，找出具有独立预测作用的影响因素。将单因素分析筛选得到的七个P值小于0.06且AEC队列中突变频率高于5％(突变患者≥4例)的因素，进一步多因素分析验证，发现BAP1、BRIP1、RB1、WRN、YAP1这五个基因变异型与野生型对比，有显著增加死亡风险的趋势，并且这五个基因变异可能是局部晚期食管癌预后的独立预测因子(P<0.05)，结果见表6。
表6：多因素分析验证局部晚期食管癌预后相关体细胞变异
Figure BDA0002960483900000111
为了进一步地提高判定准确性，本专利中还通过Cox比例风险回归，进行了联合标志物的模型构建。将上述七个与食管癌预后相关的因素，进行了变量因素删减的对比模型测试。采用赤池准则(Akaike information criterion，AIC)来估计模型的复杂度和拟合数据的优良性。通过一致性指数(index of concordance，C-index)来比较不同模型的区分死亡/存活结局的预测能力。不同模型特征数量及性能评估结果见表7。通过这两方面对模型性能进行评价，在AIC最小、C-index最大的标准下，最终确定联合模型如下：
风险评分＝20*BAP1+23*BRIP1+7*MYC+18*RB1+15*WRN+17*YAP1
上述6个基因变量均为二分类变量，如果基因发生了变化则取值为0，否则为1。风险评分范围在1～100，评分越高，患者死亡风险越高，不同风险评分下的1年内死亡风险见图2。
表7：不同模型特征数量及性能评估结果
Figure BDA0002960483900000121
为了对患者死亡风险进行高/低危分层，本发明通过X-tile软件确定阈值，发现当阈值为18分时，χ2最大，且高危组患者比低危组总生存期显著短(P<0.0001)，高危组人群占21.7％(15/69)。中晚期食管癌患者预后普遍较差，有文献报道其1年死亡率约为21.2％，与我们预测概率极为接近，提示该阈值条件下的风险划分是可靠的。其他不同阈值下的人群占比、χ2和P值见表8。
表8不同阈值下的人群占比、χ2和P值
Figure BDA0002960483900000122
Figure BDA0002960483900000131
基于18分阈值，将AEC患者分为两组，Kaplan-Meier生存曲线显示，风险评分>18分组的AEC患者OS较风险评分≤18分组更差(中位OS 10.40 vs 41.86mons，P<0.0001)(图3A)。我们使用TCGA队列进一步验证了该模型，仍使用18分的阈值，此模型能够区分某些OS较差的患者(中位OS 14.31 vs 28.09mons，P＝0.0008)(图3B)。
可以看出，通过上述方法构建出的联合多变量判定模型能够更有效地对患者OS情况进行评估，优于单变量模型。

Claims (2)

1.检测基因标志物变异的试剂在用于制备食管癌患者的总生存期的评估试剂中的应用，其特征在于，基因标志物是由YAP1、MYC、BAP1、BRIP1、WRN以及RB1基因组成；
YAP1基因的变异是指拷贝数扩增；
MYC基因的变异是指拷贝数扩增；
BAP1基因的变异是指发生了突变；
BRIP1基因的变异是指发生了突变；
WRN基因的变异是指发生了突变；
RB1基因的变异是指发生了突变和缺失。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用中还包括如下步骤：通过如下公式计算出样本的风险评分：评分S=20*TBAP1+23*TBRIP1+7*TMYC+18*TRB1+15*TWRN+17*TYAP1，T分别是指BAP1、BRIP1、MYC、RB1、WRN、YAP1基因的突变情况，野生型为0，变异型为1；根据患者样本的风险评分对患者的食管癌治疗预后情况进行分类，大于阈值的样本被判定为具有更差预后的样本。
CN202110235630.7A 2021-03-03 2021-03-03 用于食管癌预后评估的基因标志物 Active CN112779338B (zh)

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