CN109652544A - 锌指蛋白750基因在制备食管鳞癌诊断试剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，提供了一种锌指蛋白750基因在制备食管鳞癌诊断试剂中的用途，所述的用途解决了现有技术中食管鳞癌患者诊断和预后信息的分子靶标非常少，评判标准不一的技术问题。ZNF750基因编码区突变和基因拷贝数缺失作为诊断食管鳞癌患者的分子标志物。提供了锌指蛋白750基因在制备预后评价食管鳞癌患者预后试剂中的用途，ZNF750编码区突变和基因拷贝数缺失作为食管鳞癌患者预后预测的分子标志物。ZNF750突变以及拷贝数缺失食管鳞癌患者判断为临床预后差，ZNF750无突变以及无拷贝数缺失食管鳞癌患者为临床预后好。

Description

锌指蛋白750基因在制备食管鳞癌诊断试剂中的用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及锌指蛋白750基因在制备食管鳞癌诊断试剂中的用途。

背景技术

食管癌是人类常见的恶性肿瘤，全球约50%的食管癌发生在中国，组织学类型以食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）为主。我国食管鳞癌每年新发病例约478,000例，死亡病例约75,000例，发病率和死亡率分别位居所有恶性肿瘤的第三位和第四位，发病人群主要集中在河南、山西、河北交界的太行山区和闽粤一带。由于缺乏早期临床诊断的特异性指标以及有效治疗的治疗方法，食管鳞癌的整体治疗情况并没有得到明显改善，临床预后极差，总5年生存率只有15%-25％，Ⅲ期患者3年生存率仅10%左右，Ⅳ期患者3年生存率在5%左右。对于早中期的食管癌患者来说，局部复发和长期预后差是目前遇到的常见问题，但外科手术依然是首选治疗手段。此外，顺铂、5-氟尿嘧啶与其他药物联合使用也未能改善食管癌的治疗效果。与那些已经成功运用分子靶向药物治疗的实体瘤相比，食管鳞癌的靶向治疗仍处于探索阶段，治疗靶点非常有限，且无从借鉴。面对如此严峻形势，加强对食管癌尤其是食管鳞癌的癌变机理、转移机制、早期诊断和预后预测标记物以及治疗靶点的研究有着重要的意义。

ZNF750是锌指蛋白家族C2H2样锌指蛋白亚群的一员，其编码基因定位于染色体17q25.3，编码蛋白质长度为723个氨基酸，其中5-58位氨基酸为 C2H2 样结构域，可与特异性的DNA结合，702-723位氨基酸为其核定位信号，这两个结构域是其发挥转录调控功能所必需的。目前关于ZNF750功能的报道主要集中在调控上皮分化、维持上皮稳态方面，ZNF750可以通过其C端的核定位信号序列（Nuclear localization sequence，NLS）入核，在p63蛋白介导下与下游靶基因启动子结合，促进鳞状上皮的终末分化，ZNF750的突变可导致银屑病样皮炎的发生。伴随组学测序时代的来临，ZNF750在鳞癌中的功能得到广泛关注，多项研究也提到在头颈鳞癌和口腔鳞癌中ZNF750发挥抑癌基因的功能。但在食管鳞癌中尚无报道。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，提供了一种锌指蛋白750基因在制备食管鳞癌诊断试剂中的用途，所述的用途解决了现有技术中食管鳞癌患者诊断和预后信息的分子靶标非常少，评判标准不一的技术问题。

本发明提供了锌指蛋白750基因在制备诊断食管鳞癌患者试剂中的用途，ZNF750编码区突变和基因拷贝数缺失作为诊断食管鳞癌患者的分子标志物。

本发明还提供了锌指蛋白750基因在制备预后评价食管鳞癌患者试剂中的用途，ZNF750编码区突变和基因拷贝数缺失作为食管鳞癌患者预后预测的分子标志物。

本发明通过全基因组测序技术，比较食管鳞癌患者鳞癌组织与癌旁非癌组织的基因突变差异，对筛选得到的显著突变基因，进一步采用Sanger测序法进行验证，通过对临床信息进行统计学分析，经大样本量的临床病例检测，发现ZNF750编码区突变以及拷贝数缺失与食管鳞癌的多种临床病理因素及转移预后相关，与患者无转移生存期呈负相关，因此，ZNF750突变以及拷贝数缺失与否可作为食管鳞癌患者预后预测的分子标志物；ZNF750突变以及拷贝数缺失食管鳞癌患者判断为临床预后差，ZNF750无突变以及拷贝数缺失食管鳞癌患者为临床预后好。

附图说明

图1为ZNF750基因编码区结构示意图及突变位点。图中：左长条黑框为ZNF750基因C2H2功能结构域，右短黑框为ZNF750基因核定位序列。五星为无义突变，即突变后导致出现终止密码子。黑色圆形为错义突变，即突变后导致编码氨基酸改变。菱形为剪切位点突变。倒三角为插入或缺失导致的移码突变，导致提前出现终止密码子。

图2为食管鳞癌中ZNF750所在17q25.3染色体区域存在显著的拷贝数缺失图；左A为不同染色体缺失显著性图，延长线标注为ZNF750所在染色体位置，右BC为ZNF750拷贝数显著性热图，1代表拷贝数扩增，-1代表拷贝数缺失；

图3为Kaplan-Meier Plotter及Log Rank检验分析ZNF750基因突变对食管鳞癌患者预后的影响结果图；

图4为Kaplan-Meier Plotter及Log Rank检验分析ZNF750基因拷贝数缺失对食管鳞癌患者预后的影响结果图；

图5为Kaplan-Meier Plotter及Log Rank检验分析ZNF750基因突变、拷贝数缺失二者联合对食管鳞癌患者预后的影响结果图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。

一、材料与方法

病例资料和标本收集612例食管鳞癌组织取自1995年5月至2004年5月山西肿瘤医院乳腺科收治的食管鳞癌患者手术切除标本，标本取材均经患者知情同意。所有患者均无术前化疗。所有病例均经3名病理医师独立诊断，病理类型均为食管鳞癌(WHO分类)。随访时间36～100个月，180例患者随访时间均超过3年，其中132例患者随访时间多于5年，中位随访时间62个月；4例复发，39例发生远处转移。所有标本均经病理组织学证实。组织标本取材时所用器械均经无RNase处理，标本经液氮速冻后保存于-80℃冰箱。

二、全基因组测序

1.基因组DNA的提取、样本质量及浓度的检测

利用QIAamp DNA Mini Kit提取食管癌组织及癌旁正常组织的基因组DNA(genomeDNA，gDNA)，用NanoDropND-1000测定每个样品浓度，并进行初步质控，所有被测样品OD260/OD280=1.8-2.0，OD260/OD230>2；釆用琼脂糖凝胶电泳分析所制备gDNA完整性。gDNA在10Kb以上，主带明显，完整性较好，可以进行后续实验。

2.文库构建

质检合格的基因组DNA用超声打断成约500bp的片段，含3’及5’粘性末端的DNA片段由T4 DNA聚合酶和Klenow酶转换为平末端；在磷酸化的3’平末端添加一个A碱基后，在两端再与接头(adapter)绑定；琼脂糖凝胶电泳后，凝胶回收试剂盒回收纯化正确连接的产物，除去残余未连接或发生自连的接头；两端带上接头的DNA片段，以接头引物进行PCR，对PCR产物琼脂糖凝胶电泳并进行纯化后，文库片段的大小及摩尔浓度分别由 Agilent 2100Bioanalyzer 及 ABI Real-Time PCR System进行检测，满足测序平台要求的进行后续实验。

3.制备Cluster

在 C-bot簇生成系统中完成，Cluster的产生是将样本杂交到Flowcell上进行扩增的结果，步骤：

(1)将构建好的DNA文库杂交到Flowcell上。

(2)延伸杂交模板，进行桥式扩增。

(3)阻断Flowcell。

(4)杂交测序引物。

4.测序

以Illumina HiSeq2000平台91PE测序策略进行双向测序，即只检测片段两端的91bp碱基序列信息，采用边合成边测序的原理。在测序的Flowcell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA 聚合酶以及接头引物进行扩增。荧光标记的dNTP，其3’碱基末端被保护基团封闭，每次反应仅掺入一个碱基。经过扫描，读取该次反应的颜色后，该保护基团去除，继续下一轮，直至每条模板序列都完全被聚合成双链。统计每轮反应收集到的荧光信号，从而得知每个模板DNA片段的序列。

5.生物信息学分析

(1)数据过滤与比对

对Illumina HiSeq2000测序产生的原始序列信息进行过滤，去除接头序列及低质量的读长(reads)，以排除测序引物和含有低质量碱基的序列对后续分析的影响。序列对(readpairs)中的3’端和5’端测序读长需同时满足以下标准：

1)无测序引物的污染；

2)未识别的碱基(N base)的比例不少于 10%；

3)碱基/质量≥5的比例不少于50%。数据过滤后最终产生“clean data”，应用BWAv.0.7.12 (Burrows-Wheeler Aligner)，将高质量的测序读长与人类基因组hgl9/GRCh37进行比对，获得原始的BAM文件；对局部比对上的数据进行质控，合格后运用SAMtools去除由于PCR产生的大量的冗余读长。

(2)体细胞突变谱的获取

以MuTect2软件检测体细胞的单核苷酸变异(SNVs)及插入和删失（indel）。获取某一位点特定性变异，要求肿瘤组织及正常组织该位点的测序深度至少达到10×，变异频率至少达到10%，且P<0.0001。用CNVkit (v0.8.3)软件进行拷贝数变异(CNV)分析。拷贝数片段与单个基因比对得出基因水平的拷贝数增加或减少。拷贝数≤1.5为缺失，拷贝数≥2.5为扩增。为了推断重复出现的CNV区域，以1Kb窗口的拷贝数为标记应用GISTIC，根据发生频率及扩增/缺失幅度计算全基因组范围及基因编码区域的G-scores值，当G-scores>0.1，P<0.05时判定为显著拷贝数变异区域。

6.sanger测序后进行统计学分析

所有的统计用SPSS19.0软件进行，卡方检验用于分析ZNF750突变临床病理因素的关系。无进展生存期定义为诊断为食管鳞癌之日到诊断食管鳞癌发生转移之日间的时间间隔。总生存期定义为诊断之日起到最后死亡或最后随访之日的时间间隔。删失病例定义为随访时失访或最后随访时仍然存活的病例。生存曲线通过Kaplan-Meier发绘制，通过log-rank检验和cox比例风险回归模型分析。

三、结果：

1、NGS技术发现ZNF750基因编码区突变热点及拷贝数缺失

通过全基因组测序我们发现ZNF750是食管鳞癌中的显著突变基因之一。在612例食管鳞癌中，共有48例(7.84%)发生点突变（30例）和插入删失（19例）。在编码区突变病例中，85.72% 为失活突变，包括无义突变 (44.9%), 插入删失 (38.78%)和剪切变异(2.04%),错义突变 (14.29%)。突变位点见图1，突变位点详细信息见附表1。

附表1

拷贝数分析显示食管鳞癌中ZNF750所在17q25.3染色体区域存在显著的拷贝数缺失，进一步深入分析显示，ZNF750基因拷贝数显著缺失（图2）。508例肿瘤中有71例(13.98%)发生ZNF750基因的拷贝数删失。

2、ZNF750基因组改变的临床意义

2.1 ZNF750基因突变与食管鳞癌患者临床参数、临床预后的关系

利用卡方检验分析ZNF750基因突变与食管鳞癌患者临床参数、临床预后的关系。结果显示，ZNF750基因突变与肿瘤位置（P=3.14E-16）、病理学分期（P=0.000078）、浸润深度分期（T，P=0.003)、淋巴结转移分期(N，P=0.001)、淋巴结转移与否(P=0.000394)、临床预后(P=0.026)显著相关。ZNF750基因突变患者具有更晚的分期、更深的浸润深度、更容易发生淋巴结转移、临床预后更差(表1)。表明ZNF750基因突变可预测食管鳞癌患者的临床预后,ZNF750基因突变的患者预后差，ZNF750基因无突变的患者预后好。

2.2 ZNF750基因拷贝数缺失与食管鳞癌患者临床参数、临床预后的关系

利用卡方和秩ZNF750基因拷贝数缺失与食管鳞癌患者临床参数、临床预后的关系。结果显示，ZNF750基因拷贝数缺失与组织学分级（P=0.03）、淋巴结转移与否(P=0.046)、临床预后(P=0.048)显著相关，浸润深度分期（T，P=0.112)、淋巴结转移分期(N，P=0.099)。ZNF750基因拷贝数缺失患者具有细胞分化更差、更深的浸润深度、更容易发生淋巴结转移、临床预后更差(表2)。表明ZNF750基因拷贝数缺失可预测食管鳞癌患者的临床预后，ZNF750基因拷贝数缺失的患者预后差，ZNF750基因无拷贝数缺失的患者预后好。

表1 ZNF750基因突变与食管鳞癌患者临床参数的关系

表2 ZNF750基因拷贝数缺失与食管鳞癌患者临床参数的关系

2.3 ZNF750基因突变、拷贝数缺失对食管鳞癌患者预后的影响

通过Kaplan-Meier Plotter及Log Rank检验分析ZNF750基因突变对食管鳞癌患者预后的影响。结果显示相对于ZNF750野生型的患者，ZNF750突变型的患者预后更差（图3，log-rank P=0.026）。COX回归检验表明ZNF750突变患者其危险比为1.54,95%CI：1.044-2.261，P=0.029。

通过Kaplan-Meier Plotter及Log Rank检验分析ZNF750基因拷贝数缺失对食管鳞癌患者预后的影响。结果显示相对于ZNF750野生型的患者，ZNF750拷贝数缺失患者预后更差（图4，log-rank P=0.048）。COX回归检验表明ZNF750拷贝数缺失患者其危险比为1.428, 95%CI：0.0998-2.042，P=0.051。

通过Kaplan-Meier Plotter及Log Rank检验分析ZNF750基因突变、拷贝数缺失二者联合对食管鳞癌患者预后的影响。结果显示相对于ZNF750野生型的患者，ZNF750突变型和缺失型的患者预后更差（图5，log-rank P=0.016）。COX回归检验表明ZNF750突变或拷贝数缺失患者其危险比为1.441（95%CI：1.065-1.95。P=0.018）。相对于ZNF750野生型的患者，ZNF750突变型和缺失型的患者预后更差。

Claims (5)

1.锌指蛋白750基因在制备食管鳞癌诊断试剂中的用途，其特征在于：所述锌指蛋白750基因即ZNF750在制备诊断食管鳞癌患者试剂中的用途。

2.根据权利要求1所述的锌指蛋白750基因在制备食管鳞癌诊断试剂中的用途，其特征在于：所述锌指蛋白750基因即ZNF750在制备预后评价食管鳞癌患者试剂中的用途。

3.根据权利要求1所述的锌指蛋白750基因在制备食管鳞癌诊断试剂中的用途，其特征在于：ZNF750基因编码区突变和基因拷贝数缺失作为诊断食管鳞癌患者的分子标志物。

4.根据权利要求2所述的锌指蛋白750基因在制备食管鳞癌诊断试剂中的用途，其特征在于：ZNF750基因编码区突变和基因拷贝数缺失作为食管鳞癌患者预后预测的分子标志物。

5.根据权利要求2所述的锌指蛋白750基因在制备食管鳞癌诊断试剂中的用途，其特征在于：ZNF750基因编码区突变和/或基因拷贝数缺失作为食管鳞癌患者预后差的分子标志物。