CN108721317A - 检测食管鳞癌外周血标记物microRNA-602及在药物和试剂盒中的应用 - Google Patents

检测食管鳞癌外周血标记物microRNA-602及在药物和试剂盒中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108721317A
CN108721317A CN201810464347.XA CN201810464347A CN108721317A CN 108721317 A CN108721317 A CN 108721317A CN 201810464347 A CN201810464347 A CN 201810464347A CN 108721317 A CN108721317 A CN 108721317A
Authority
CN
China
Prior art keywords
microrna
squamous cell
cell carcinoma
esophageal squamous
application
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201810464347.XA
Other languages
English (en)
Inventor
孙国贵
胡万宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TANGSHAN CITY PEOPLE'S HOSPITAL
Original Assignee
TANGSHAN CITY PEOPLE'S HOSPITAL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TANGSHAN CITY PEOPLE'S HOSPITAL filed Critical TANGSHAN CITY PEOPLE'S HOSPITAL
Priority to CN201810464347.XA priority Critical patent/CN108721317A/zh
Publication of CN108721317A publication Critical patent/CN108721317A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体公开了一种检测食管鳞癌转移分子标记物microRNA‑602及在药物和诊断试剂盒中的应用。本发明公开了microRNA‑602在制备具有抑制肿瘤药物中的应用和microRNA‑602在制备具有抑制食管鳞癌转移药物中的应用及分子标记物microRNA‑602在制备预测食管癌发生转移、预后及靶向治疗的诊断试剂盒中的应用。本发明利用分子生物学技术，能够有效地进行分子水平检测来判断食管鳞癌患者发生转移、预后及靶向治疗的标志，进而为个体化治疗这些疾病提供便利。同时对后续临床研究的开展具有重要的指导意义。

Description

检测食管鳞癌外周血标记物microRNA-602及在药物和试剂盒 中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种检测食管鳞癌外周血标记物microRNA-602及在药物和试剂盒中的应用。
背景技术
食管癌是危害我国民众健康最为严重的恶性肿瘤之一，依据2013年世界卫生组织最新统计结果：食管癌发病率在我国恶性肿瘤中居第5位，死亡率居第4位。中国每年死于食管癌的人数为19,7472例，超过全世界食管癌总死亡人数的一半。同时，由于东西方人种不同以及食管癌发病病因等方面的差异，我国食管癌的特点与欧美等低发地区(食管胸下段、腺癌多发)明显不同，以胸中段、鳞癌为多，其中食管鳞癌(Esophageal squamous cellcarcinoma,ESCC)的比例高达90％以上。但我国食管癌发生、发展的分子机制尚不清楚，故尚不能针对病因治疗。因此，积极探索食管癌发生、发展的分子机制，对食管鳞癌的预防与治疗将发挥着重要的作用。
利用分子生物学技术，能够有效地进行分子水平检测来判断恶性肿瘤患者发生转移、预后及靶向治疗的标志。进而为个体化治疗这些疾病提供便利。
MicroRNA是长约19-22个核苷酸的小片段单链非编码RNA。它通过有缺陷的碱基配对绑定其靶基因的3’非翻译区的互补序列来控制基因表达，从而使靶基因在转录或者翻译水平表达下调。近来microRNA成为从生长发育到癌症等很多病理生理过程的重要和革命性的保守调节因素。在不同的恶性肿瘤中，同一microRNA的作用可能不同。一个microRNA可以有很多属于不同通路的靶基因，而一个基因可以被几个microRNA调控。科学家发展技术来识别与肿瘤分期和患者预后相关的特异的基因表达标记，以改善预后和治疗。人们使用全面转录研究来识别以基因表达为基础的预后标识，但是，目前为止无一能应用于临床。与经典的mRNA表达谱相比，microRNA肿瘤表达谱似乎能够更准确地确定肿瘤亚型的分类。越来越多的证据支持实体肿瘤有特异的microRNA标记。
与此同时，人们发现越来越多的microRNA的靶基因在食管鳞癌发生中起重要作用，例如miR-17、miR-20a、miR-92b等。目前，科学家对microRNA的靶基因的识别仍然有限。在分子框架中，成熟microRNA带电后成为microRNA诱导的沉默复合体(miRISC)。该复合体含有Argonaute家族(一类庞大的蛋白质家族)，与通常位于靶基因3’端非翻译区的互补位点反应。目前的模型认为microRNA和其靶基因的反应起源于位于microRNA的5’端的一段被称为“种子序列”的6至8个核苷酸短片段。MicroRNA诱导的沉默复合体能够将靶基因再配置成特别间隔，在其中处理翻译阻滞和mRNA衰变。许多研究证实了microRNA诱导的mRNA失稳。联合计算预测，mRNA表达谱的测量代表了识别功能microRNA-靶关系的有效方法。在食管鳞癌中，许多不同的microRNA调节异常，可能有致癌或抑癌作用，并预测预后。识别能够预测食管鳞癌患者预后的microRNA是一项重要发现，这表明microRNA可能在肿瘤进展中起重要作用。具有相似临床病理特点或者相同分期的食管鳞癌患者的转移发生和预后可能明显不同。分子标记物可以帮助医生鉴别高危患者，以便给予患者个体化治疗，从而改善生存。
本发明人运用microRNA基因及qRT-PCR技术对我国食管鳞癌进行了研究发现，microRNA-602在食管鳞癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织，microRNA-602在食管鳞癌患者外周血中的表达水平明显低于正常健康人外周血中的表达水平；这个microRNA的表达水平与临床分期、淋巴结转移呈明显负相关。研究表明microRNA-602可以调控食管鳞癌细胞株的生长和细胞侵袭转移能力。microRNA-602过表达可以抑制食管鳞癌细胞增殖和细胞侵袭转移能力。反之，microRNA-602下调则导致了这种能力的增加。这也为microRNA-602在食管鳞癌侵袭转移和治疗中的作用提供了证据。因此，microRNA-602具有非常明确的抑癌作用，临床上可以开发针对microRNA-602的抑癌制剂作为临床治疗。
肿瘤分子标记物(Tumor Marker)是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。
发明内容
为了解决目前不能有效的进行分子水平检测来判断食管癌发生转移危险性的技术难题，本发明提供了预测食管鳞癌转移分子标记物microRNA-602及在药物和试剂盒中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
本发明第一方面提供了含有如下所述物质在制备具有抑制肿瘤药物中的应用：
a)microRNA-602；
b)含有microRNA-602的非编码基因的重组质粒。
其中，microRNA-602序列为：3’-GACACGGGCGACAGCUGCGGCCC-5’。
结合第一方面，在一种可能的实施方式中，所述肿瘤为食管癌。
本发明第二方面提供了含有如下所述物质在制备具有抑制食管癌转移药物中的应用：
a)microRNA-602；
b)含有microRNA-602的非编码基因的重组质粒。
结合第二方面，在一种可能的实施方式中，所述食管癌为食管鳞癌。
本发明第三方面提供了用于检测食管癌外周血发生转移、预后及靶向
治疗的分子标记物，所述分子标记物为microRNA-602。
结合第三方面，在一种可能的实施方式中，所述食管癌为食管鳞癌。
本发明第四方面提供了分子标记物microRNA-602在制备预测食管癌发生转移、预后及靶向治疗的诊断试剂盒中的应用。
结合第四方面，在一种可能的实施方式中，所述食管癌为食管鳞癌。
分子标记物为microRNA-602，简称miR-602。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果如下：
1)本发明提供一种分子标记物miR-602，利用分子生物学技术，能够有效地进行分子水平检测来判断食管鳞癌转移情况及靶向治疗，进而为个体化治疗这些疾病提供便利。
2)本发明提供一种分子标记物microRNA-427在制备预测食管鳞癌发生转移的诊断试剂盒中的应用，该试剂盒不仅精确度很高，而且对后续临床研究的开展具有重要的指导意义。
附图说明
图1为本发明miR-602在食管鳞癌组织中和癌旁正常食管组织中表达水平对比图。
图2为本发明miR-602在有无淋巴结转移食管鳞癌组织中的表达水平对比图。
图3为本发明miR-602在III+IV期与I+II期食管鳞癌组织中的表达水平对比图。
图4为本发明miR-602在有无食管鳞癌患者外周血中的表达水平对比图。
图5为本发明miR-602在有无淋巴结转移的食管鳞癌患者外周血中表达对比图。
图6为本发明miR-602在III+IV期与I+II期食管鳞癌患者外周血中的表达水平对比图。
图7为本发明miR-602低表达组患者生存期显著低于高表达组的生存率对比图。
图8为本发明miR-602高表达可以抑制食管鳞癌细胞株细胞增殖图。
图9为本发明miR-602高表达可以抑制食管鳞癌细胞株细胞平板克隆形成能力图。
图10为本发明miR-602高表达可以抑制食管鳞癌细胞株细胞侵袭转移图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步阐述，但实施例不对本发明构成任何限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中未注明的具体的条件的实验方法，通常为本领域常规方法。
本实施例涉及的检测方法包括microRNA探针设计、提取、原位杂交、qRT-PCR验证、细胞增殖、克隆集落形成、侵袭转移实验实验。在今后临床应用中，仅运用microRNA提取及qRT-PCR两种技术即可。这两种方法对于本领域的技术人员为常规操作.因此，该模型在临床中容易被推广。
本实施例中寻找食管鳞癌发生转移、预后及靶向治疗的标记物的方法如下：
一、患者和标本
收集2009年1月1日-2013年12月30日在我院手术的食管鳞癌患者的组织标本及距离肿瘤组织＞5cm的癌旁正常食管组织石蜡标本，共108例，最后随访时间2017.12。收集我院2011年1月1日-2013年12月30日在我院手术的食管鳞癌患者外周血122例及57例正常健康人外周血，-80℃保存。根据2009年国际抗癌联盟(UICC)制定的TNM分期标准进行临床分期，所有患者术前均未接受过任何放治疗，术后所有患者均接受术后辅助化疗。
二、RNA提取、质量检测、芯片杂交及数据处理
(一)、柠檬油精脱蜡处理石蜡包埋组织
石蜡包埋组织样品的预处理：石蜡包埋组织如果已经切片，可选需厚度不大于50μm的切片十片左右，尽量除去周围石蜡，置于1.5mL离心管中。
石蜡包埋组织如果是一整块，可用锋利刀片将组织轻轻刮下来并置于1.5mL离心管，尽量避免刮下石蜡。刮下的组织量控制在100mg以内。
柠檬油精脱蜡处理：
离心管中加入1ml柠檬油精(Limonen)，55℃震荡混匀5min。13,200rpm室温离心2min，弃上清。此步骤总共进行3次。
加入1ml无水乙醇至离心管中，55℃震荡混匀2min，13,200rpm室温离心2min，弃上清。重复此步骤一次。
弃上清，室温短暂离心，用移液器将剩余的无水乙醇吸出。
将离心管置于真空干燥仪中，抽干至组织呈干燥的粉末状。
(二)、食管组织标本的RNA、microRNA的提取
1.组织、外周血RNA的提取
全部过程严格按照Trizol试剂盒说明书进行，在无RNA酶环境下操作，所用试管吸头及溶液均常规用1％DEPC水处理(Tris除外)，室温过夜。
其中DEPC(Diethy pyrocarbonate)，中文名为焦碳酸二乙酯。
(1)分别取冻存的食管癌组织、癌旁正常组织各50～lOOmg，置入预先加入0.5mlTrizol裂解液的1.5ml Eppendorf中，用匀浆器不断研磨成浆液状，并添加Trizol裂解液至1ml。
(2)15～30℃下孵育5分钟使核蛋白复合物完全溶解，每1ml Trizol反应液加氯仿0.2ml，强烈震荡15秒，15～30℃孵育2～3分钟。
(3)4℃12,000g离心15分钟，移上清至另一Eppendorf管中，体积约为加入Trizol反应液体积的60％。
(4)沉淀RNA：每1mlTrizol加0.5ml异丙醇，15～30℃下孵育lO分钟。
(5)2～8℃≤12，000g离心10分钟。
(6)弃上清，70％乙醇(用DEPC处理的三蒸水配制)≥lml漂洗2次。
(7)2～8℃≤7，500g离心5分钟。
(8)真空抽干RNA，溶解于50μlDEPC水中。-70℃保存备用。
(9)RNA定量及电泳鉴定
A.取lμl RNA溶液加100μl水，混匀后用紫外可见分光光度计测定A260、A280及A260/A280比值，并读出RNA浓度。应为1.8～2.0。
B.1.2％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量：
①电泳槽用0.3％的H202浸泡30分钟，用DEPC水冲洗晾干。
②制胶(20ml)，含琼脂糖0.24g、无RNAase水17.4ml、10×MOPS 2ml、37％甲醛0.6ml、EB lml，将琼脂糖加水微波炉加热融化后，加10×MOPS，待凝胶冷却至60℃再加甲醛和EB。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。
其中无RNAase水为DEPC处理水是采用DEPC抑制或去除水中可能存在的RNAase，然后再把这个水高温灭菌是为了让其中的DEPC分解，从而去除对人的危害。
其中MOPS为3-(N-玛琳代)丙磺酸10.3g加50mM NaAc 400ml,用2M NaOH调pH至7.0,再加入0.5M EDTA 10ml,加DEPC H2O至500ml。无菌抽滤，室温避光保存。
其中EB为溴化乙锭的英文缩写。
③将凝胶预电泳5min，电压降为5V/cm。
④取适量的RNA，加入电泳缓冲液(10×)2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺l0μl混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准品。
⑤电泳结束后在紫外灯下拍照。
电泳后应见28S及18S两条条带，且28S：18S比值大于2，说明RNA未降解。
2.细胞小RNA的提取
细胞系小分子RNA(≤200nt)的提取用mirVanaTMmiRNA提取试剂盒按照说明书提取。方法简述如下：
细胞(<107)收集后用600μl裂解/结合缓冲液裂解(取适量组织(<250mg)，于液氮中研磨成粉末，转移至600μl裂解/结合缓冲液中裂解)，再加入60μlmiRNA匀浆液，在冰上放置lOmin。加入600μl酸酚/氯仿，剧烈混匀30-60s后于室温以10000rpm离心5min(完全分层)。小心吸取上清转移至新的无RNase 1.5ml离心管中。
加入l/3体积的无水乙醇，完全混匀后加入到装在收集管中的离心柱中(每次最多700μl)，室温以10000rpm离心lmin，收集流出液。
在收集的流出液中再加入其2/3体积的无水乙醇，完全混匀后再加入到装在收集管中的另一新的离心柱中，室温以l0000rpm离心lmin，弃掉流出液。
离心柱中加入700μlmiRNA洗液1，离心5-10s漂洗。
再按上述方法用500μl洗液2/3漂洗两次。再离心lmin以完全去掉乙醇。
加100μl室温的洗脱液，l0000rpm离心lmin，回收RNA。
RNA稀释25倍后，紫外分光光度计测其OD260及OD280的值，并计算OD260/D280，比值大于1.8时，表明RNA纯度较好。同时根据OD260计算RNA的浓度。
三、mimic的瞬时转染
①mimic或inhibitor配制：在5nmol的双链siRNA中加入250μl 1×通用缓冲液，得到浓度为20μM的mimic或inhibitor母液，置-20度保存。
②取生长状态良好的细胞，于转染前一天将细胞接种于60mm培养皿中(不加抗生素)，转染时细胞密度达到30％左右。
③准备以下复合体：A液：将适当浓度的mimic或inhibitor稀释于500μl无血清培养基中，轻轻混匀；B液：取10μl Lipofectamine 2000(用前轻柔混匀)稀释于500μl无血清培养基中，混匀。室温孵育5min。
④将稀释的脂质体与稀释的mimic或inhibitor混合，轻轻混匀，室温孵育20分钟(复合体于室温6小时内会保持稳定)。
⑤将混合后的复合物1000μl加入细胞培养皿内，加无血清培养基至5ml，轻轻混匀。6小时后弃去原培养基，换含10％血清的培养基。
⑥48小时后收集细胞进行Western blot，RT-PCR，MTS等相应实验。
四、MTS法检测细胞增殖曲线
当细胞生长至对数生长期，进行细胞转染或进行相应处理，收集细胞，稀释成合适浓度的细胞悬液，将细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔5000个细胞/100μl，在培养箱中继续培养至适当时间。每个实验组做6个平行孔，以只加培养基的孔作空白对照。设四个时间点：0h(细胞铺板后贴壁后既测)，24h，48h，72h，96h。采用MTS比色法测定细胞活性，每孔加入15μl MTS试剂(500μg/ml)，继续培养2h后用酶标分光光度计于波长570nm处测定光吸收值(OD)，以空白孔调零，OD值越高细胞数量越多。
五、克隆集落形成实验
①按照实验要求进行细胞转染或者处理细胞。
②准备大皿，每孔加入10ml培基，以及800个细胞。
③细胞在标准条件下培养10天-14天，观察克隆形成情况.
④当细胞形成肉眼可见的克隆时终止培养，弃去培养基，用PBS小心清洗细胞2次，加入4％甲醛固定，1ml/孔，固定15min，弃去固定液，以流水缓慢冲洗干净，加1ml结晶紫染液染色3min。以流水缓慢洗去染色液，通风橱中干燥，照相。
六、趋化小室实验(Transwell)
①细胞计数，小室中加入5×105个细胞，上室中加500ul无血清培养基，下室内加800ul含10％血清培养基。
②迁移12-18h后，弃去滤膜上、下室的培养液，用预热的PBS清洗，轻轻吹打PBS达到清洗滤膜下表面的作用，重复1次。
③在下室移入4％多聚甲醛600μl，使滤膜下表面浸在其中固定细胞，15min。
④弃去固定液，倒置transwell小室，使滤膜下表面朝上，自然风干。
⑤风干后直接在倒置的transwell小室的滤膜下表面滴上数滴吉姆萨染液，10min。
⑥蒸馏水清洗，用棉球擦去小室面未迁移的细胞，在倒置显微镜下观察计数。
七、质粒小量提取
①将1-5ml(高拷贝数的质粒)或10ml(低拷贝数的质粒)的细菌培养物用台式离心机10,000g离心5分钟。弃去上清并将试管倒置于纸巾上吸去剩余的培养液。
②加入250μl细胞悬浮液并旋涡震荡或吹打以充分悬浮细胞。充分悬浮细胞非常关键。如果不在离心管中，将悬浮的细胞转移至1.5ml消毒离心管中。加入250μl细胞裂解液并颠倒离心管4次以充分混合(不要旋涡震荡)。孵育至细胞悬浮液澄清，大约需要1-5分钟。注意：加入碱性蛋白酶溶液(第3步)之前观察裂解液部分澄清非常重要；但是孵育时间不要超过5分钟。
③加入10μl碱性蛋白酶溶液并颠倒离心管4次以充分混合。于室温孵育5分钟。
碱性蛋白酶能够灭活核酸酶及其它在细菌裂解过程中释放出的能够影响分离质粒质量的蛋白。加入350μlPlus SV中和溶液并迅速颠倒离心管4次以充分混合(不要旋涡震荡)。于室温将细胞裂解液以最大速度(约14,000g)离心10分钟。将澄清裂解液(大约850μl)转移至准备好的离心柱中。不要搅动或将任何白色沉淀与上清液一同转移。
④于室温用离心机以最大速度离心上清液1分钟。从收集管中取出离心管并弃去收集管中的液体。将离心柱重新插入收集管中。加入750μl先前用95％酒精稀释过的柱清洗液。于室温用离心机以最大速度离心1分钟。从收集管中取出离心管并弃去收集管中的液体。将离心柱重新插入收集管中。
⑤用250μl柱清洗液重复清洗步骤。于室温用离心机以最大速度离心2分钟。
将离心柱转移至一个新的1.5ml消毒离心管中，操作时需小心，不要将任何一点柱清洗液与离心柱一同转移。如果离心柱上粘有柱清洗液，则重新以最大速度离心1分钟。将离心柱转移至一个新的1.5ml消毒离心管中。将100μl无核酸酶的水加入离心柱以洗脱质粒DNA。于室温用离心机以最大速度离心1分钟。
⑥洗脱质粒DNA后，将离心柱从1.5ml消毒离心管中取出并弃去离心柱。不加缓冲液的DNA水溶液在-20℃及以下是稳定的。TE缓冲液中的DNA在4度是稳定的。如果需要将DNA存放于TE缓冲液中，将11μl 10×TE缓冲液加入100μl洗脱的DNA中。将离心管盖好并将纯化后的质粒DNA存放于-20℃或以下。
八、质粒提取鉴定
质粒浓度的测定用Amersham Bioscience Gene Quant浓度测定仪进行。DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光光度法测定DNA浓度，OD值为1.0相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用去离子水稀释DNA样品100倍并以水为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：
DNA(mg/ml)＝50×OD260读数×稀释倍数/1000
DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。
九、统计学分析
本实验所有数据均为3次以上重复实验得出。数据处理软件为Prism 5和WordExcel。数据经SPSS16.0统计分析，P<0.05认为有统计学意义。
本实施例还提供了含有如下所述物质在制备具有抑制肿瘤药物中的应用：
a)microRNA-602；
b)含有microRNA-602的非编码基因的重组质粒。
其中，microRNA-602序列为：3’-GACACGGGCGACAGCUGCGGCCC-5’。
优选的，该肿瘤为食管癌。
本实施例还提供了含有如下所述物质在制备具有抑制食管癌转移药物中的应用：
a)microRNA-602；
b)含有microRNA-602的非编码基因的重组质粒。
优选的，该食管癌为食管鳞癌。
本实施例采用上述方法寻找食管鳞癌发生转移及靶向治疗的标记物microRNA-602具有如下实验效果：microRNA-602用于发生转移、预后及靶向治疗的标志。
(1)表达情况作为食管鳞癌转移判断的标志。
1)miR-602在食管鳞癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织，miR-602表达水平与患者年龄、性别、肿瘤分化程度及肿瘤大小亦无明显相关性，但与临床分期、淋巴结转移亦呈明显负相关。
2)miR-602在食管鳞癌患者外周血中的表达水平明显低于正常健康人外周血中的表达水平，miR-602表达水平与患者年龄、性别、肿瘤分化程度及肿瘤大小亦无明显相关性，但与临床分期、淋巴结转移亦呈明显负相关。生存分析显示miR-602低表达组患者生存期显著低于高表达组。
Cox风险比例模型分析显示miR-602表达可作为食管鳞癌患者预后不良的标志。通过该预后模型，可以将食管鳞癌转移分为低危险性、高危险性两种类型，不同类型采用不同治疗方案，低危险性病变可以采用局部手段如手术、局部放疗等，而对于高危险性病变，治疗则相对激进，从而对食管鳞癌治疗模式的改变具有划时代意义。
(2)miR-602对食管鳞癌细胞的增殖及迁移、侵袭能力的影响。
研究表明miR-602可以调控食管鳞癌细胞株的生长和细胞侵袭转移能力。miR-602过表达可以抑制食管鳞癌细胞增殖和细胞侵袭转移能力。反之，miR-602下调则导致了这种能力的增加。这也为miR-602在食管鳞癌侵袭转移和治疗中的作用提供了证据。
具体临床效果参见图1至图10，如下：
参见图1，miR-602在食管鳞癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常食管组织。
参见图2，miR-602表达水平与淋巴结转移呈明显负相关，miR-602在淋巴结转移的食管鳞癌组织中的表达水平低于在无淋巴结转移食管鳞癌组织中的表达水平。
参见图3，miR-602表达水平与与临床分期呈明显负相关,miR-602在III+IV期食管鳞癌组织中的表达水平低于在I+II期食管鳞癌组织中的表达水平。
参见图4，miR-602在食管鳞癌患者外周血中的表达水平明显低于正常健康者外周血中的表达水平。
参见图5，miR-602在食管鳞癌患者外周血中的表达水平与淋巴结转移呈明显负相关。miR-602表达水平与与淋巴结转移呈明显负相关,miR-602在淋巴结转移者食管鳞癌患者外周血明显低于无淋巴结转移者食管鳞癌患者外周血中的表达水平。
参见图6，miR-602在食管鳞癌外周血中的表达水平与临床分期呈明显负相关。miR-602表达水平与与临床分期呈明显负相关,miR-602在III+IV期食管鳞癌患者外周血明显低于在I+II期食管鳞癌患者外周血中的表达水平。
参见图7，生存分析显示miR-602低表达组患者生存期显著低于高表达组。
参见图8，miR-602高表达可以抑制食管鳞癌细胞株细胞增殖。
参见图9，miR-602高表达可以抑制食管鳞癌细胞株细胞平板克隆形成能力。
参见图10，miR-602高表达可以抑制食管鳞癌细胞株细胞侵袭转移。
本实施例提供了用于检测食管癌外周血发生转移、预后及靶向治疗的分子标记物，该分子标记物为microRNA-602。
优选的，该食管癌为食管鳞癌。
本实施例中分子标记物microRNA-602在制备预测食管癌发生转移、预后及靶向治疗的诊断试剂盒中的应用。
优选的，该食管癌为食管鳞癌。
本实施中的诊断试剂盒按照常规方法制备。
本实施例中预后为检测、疗效评估或转移复发监控。
本实施例中分子标记物microRNA-602的试剂盒监控食管鳞癌转移复发。
选取10例病理学检查确诊为食管鳞癌的患者，对其进行跟踪随访。患者样本来源于唐山市人民医院的食管鳞癌患者，所有收集的患者经过有效的治疗，临床资料及随访资源完整。首先采集10例食管鳞癌治疗后六周首次采集患者的血液，检测血液中相应基因的表达量，以后每三个月检查一次，跟踪九个月，共检测四次。
利用试剂盒检测10例患者食管鳞癌患者血液中相应基因的相对表达量。根据食管鳞癌患者治疗后6周，3个月，6个月，9个月时血液样本中相应基因的相对表达量与治疗前相比变化的水平来判断食管鳞癌患者是否发生转移复发。判断标准定为，治疗后基因的相对表达量与治疗前相比下降大于或者等于35％时，判断为转移复发；治疗后基因的相对表达量与治疗前相比下降小于35％时，判断为无进展生存。
试剂盒的检测判断结果如表1所示。
表1：试剂盒的检测判断结果
序号 6周 3个月 6个月 9个月 临床结果
1 升高28％ 升高25％ 升高20％ 升高22％ 无进展生存
2 升高20％ 升高15％ 下降18％ 下降46％ 转移复发
3 升高26％ 升高22％ 升高23％ 升高20％ 无进展生存
4 升高17％ 升高15％ 升高8％ 下降42％ 转移复发
5 升高25％ 升高23％ 升高20％ 升高19％ 无进展生存
6 升高23％ 升高19％ 升高5％ 下降39％ 转移复发
7 升高25％ 升高12％ 升高6％ 下降48％ 转移复发
8 升高20％ 升高18％ 升高19％ 升高12％ 无进展生存
9 升高25％ 升高12％ 下降22％ 下降60％ 转移复发
10 升高25％ 升高8％ 升高5％ 下降45％ 转移复发
从表1知，临床诊断结果显示10例食管鳞癌患者中有6例治疗后出现转移复发，4例无进展生存。使用本发明的试剂盒监控食管鳞癌，可早于临床症状和体征发现，为医生提前进行干预提供参考。
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域技术人员的公知常识。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，尽管参照优选实施例对本发明专利作了详细说明，对于本领域的普通技术人员来说，可以对本发明的技术方案进行若干改进和润饰，但不脱离本发明技术方案的实质和范围，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.含有如下所述物质在制备具有抑制肿瘤药物中的应用：
a)microRNA-602；
b)含有microRNA-602的非编码基因的重组质粒。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为食管癌。
3.含有如下所述物质在制备具有抑制食管癌转移药物中的应用：
a)microRNA-602；
b)含有microRNA-602的非编码基因的重组质粒。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食管癌为食管鳞癌。
5.用于检测食管癌外周血发生转移、预后及靶向治疗的分子标记物，其特征在于，所述分子标记物为microRNA-602。
6.如权利要求5所述的分子标记物，其特征在于，所述食管癌为食管鳞癌。
7.如权利要求5或6所述的分子标记物在制备预测食管癌发生转移、预后及靶向治疗的诊断试剂盒中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述食管癌为食管鳞癌。
CN201810464347.XA 2018-05-15 2018-05-15 检测食管鳞癌外周血标记物microRNA-602及在药物和试剂盒中的应用 Withdrawn CN108721317A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810464347.XA CN108721317A (zh) 2018-05-15 2018-05-15 检测食管鳞癌外周血标记物microRNA-602及在药物和试剂盒中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810464347.XA CN108721317A (zh) 2018-05-15 2018-05-15 检测食管鳞癌外周血标记物microRNA-602及在药物和试剂盒中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108721317A true CN108721317A (zh) 2018-11-02

Family

ID=63937425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810464347.XA Withdrawn CN108721317A (zh) 2018-05-15 2018-05-15 检测食管鳞癌外周血标记物microRNA-602及在药物和试剂盒中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108721317A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109652544A (zh) * 2019-01-11 2019-04-19 山西医科大学 锌指蛋白750基因在制备食管鳞癌诊断试剂中的用途
CN111733234A (zh) * 2019-03-25 2020-10-02 深圳大学 一种食管癌分子标志物及其应用
CN116121377A (zh) * 2022-11-01 2023-05-16 山西医科大学 一种食管鳞癌外泌体富含的miRNA作为诊断食管鳞癌的标志物中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009036332A1 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
CN103243161A (zh) * 2013-05-07 2013-08-14 中国医学科学院肿瘤医院 一种辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间长短的产品
CN105734159A (zh) * 2016-04-29 2016-07-06 北京泱深生物信息技术有限公司 食管鳞癌的分子标记物
US20160362689A1 (en) * 2012-08-29 2016-12-15 City Of Hope Differentially expressed microrna molecules for the treatment and diagnosis of cancer
CN106459961A (zh) * 2014-05-30 2017-02-22 东丽株式会社 胰腺癌的检测试剂盒或装置以及检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009036332A1 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
US20160362689A1 (en) * 2012-08-29 2016-12-15 City Of Hope Differentially expressed microrna molecules for the treatment and diagnosis of cancer
CN103243161A (zh) * 2013-05-07 2013-08-14 中国医学科学院肿瘤医院 一种辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间长短的产品
CN106459961A (zh) * 2014-05-30 2017-02-22 东丽株式会社 胰腺癌的检测试剂盒或装置以及检测方法
CN105734159A (zh) * 2016-04-29 2016-07-06 北京泱深生物信息技术有限公司 食管鳞癌的分子标记物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEINA HUI等: "Serum miRNA expression in patients with esophageal squamous cell carcinoma", 《ONCOLOGY LETTERS》 *
刘长征等: "肝内及肝外胆管癌表达下调microRNAs表达谱的鉴定", 《基础医学与临床》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109652544A (zh) * 2019-01-11 2019-04-19 山西医科大学 锌指蛋白750基因在制备食管鳞癌诊断试剂中的用途
CN111733234A (zh) * 2019-03-25 2020-10-02 深圳大学 一种食管癌分子标志物及其应用
CN116121377A (zh) * 2022-11-01 2023-05-16 山西医科大学 一种食管鳞癌外泌体富含的miRNA作为诊断食管鳞癌的标志物中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107805663B (zh) Lnc03729基因作为生物标志物在肺腺癌预诊断试剂中的应用
CN108721317A (zh) 检测食管鳞癌外周血标记物microRNA-602及在药物和试剂盒中的应用
WO2021022888A1 (zh) 靶向长链非编码rna ddx11-as1的aso、试剂盒及在肝癌治疗中的应用
CN107916292A (zh) 预测肺癌脑转移分子标记物miR‑423‑5p及在药物和诊断试剂盒中的应用
CN114921551B (zh) 人Circ-FIRRE在食管鳞癌中的应用及试剂盒
CN111254146B (zh) Linc01331基因抑制剂在制备治疗肺癌药物中的用途
CN108721316A (zh) 标记物miR-652-5p对食管鳞癌转移、预后及治预在药物和试剂盒中的应用
CN107625780A (zh) 非小细胞肺癌诊断标记物microRNA‑1253及在药物和诊断试剂盒中的应用
CN112359118A (zh) 长链非编码rna ac073352.1作为乳腺癌诊断标志物和治疗靶点的应用
CN105483246B (zh) 基因的差异表达在口腔癌诊断中的应用
CN107365848B (zh) 一种用于肝癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物及试剂盒
CN108125976A (zh) 预测肺癌脑转移分子标记物miR-4270及在药物和诊断试剂盒中的应用
CN113755594B (zh) 一种预测小细胞肺癌辅助化疗获益和识别化疗耐药治疗靶点的系统和应用
CN107881237A (zh) 肺癌诊断标记物microRNA‑4317及在药物和诊断试剂盒中的应用
CN107083428B (zh) Pak5在癌症诊断预后治疗及药物筛选中的应用
CN111424082A (zh) lncRNA-SNHG6基因在制备治疗骨肉瘤的药物中的用途
CN107937523A (zh) 肺癌诊断标记物microRNA‑3607‑3p及在药物和诊断试剂盒中的应用
CN107432876A (zh) 非小细胞肺癌诊断标记物microRNA‑769‑5p及在药物和诊断试剂盒中的应用
CN108913762A (zh) 用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒及cst1基因作为生物标志物的应用
CN110577952B (zh) 干扰长非编码RNA的siRNA在制备治疗乳腺癌药物中的应用
CN108728543B (zh) 检测肺癌脑转移的miRNA组合及含有该组合的试剂盒
CN108611421A (zh) 检测食管鳞癌标记物microRNA-10b-3p及在试剂盒中的应用
CN113637762B (zh) 黑色素瘤相关的miRNA在诊断和治疗黑色素瘤中的应用
CN111378744B (zh) miR-148a-3p作为热性惊厥诊治标志物的应用
CN108949954A (zh) 用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒及alox15基因作为生物标志物的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20181102

WW01 Invention patent application withdrawn after publication