CN107625780A - 非小细胞肺癌诊断标记物microRNA‑1253及在药物和诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一组用于非小细胞肺癌发生转移、预后或靶向治疗的分子标记物microRNA‑1253。本发明进一步公开了所述分子标记物在制备非小细胞肺癌发生转移、预后或靶向治疗诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明还公开了microRNA‑1253在制备具有抑制肿瘤药物中的应用和microRNA‑1253的基因表达情况在制备具有抑制肿瘤预后或靶向治疗药物中的应用。本发明利用分子生物学技术，能够有效地进行分子水平检测来判断非小细胞肺癌患者发生转移、预后及靶向治疗的标志，进而为个体化治疗这些疾病提供便利。同时对后续临床研究的开展具有重要的指导意义。

Description

非小细胞肺癌诊断标记物microRNA-1253及在药物和诊断试 剂盒中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体地说，涉及一组标志基因microRNA-1253作为非小细胞肺癌诊断标记物及在药物和诊断试剂盒中的应用。

背景技术

肺癌一直是最危险的恶性肿瘤之一,其高发病率和高病死率是导致当今国内乃至世界范围内癌症致死的主要原因。据病理类型将肺癌主要分为两大类：一类是小细胞肺癌，约占肺癌比例的15％；另一类是非小细胞肺癌约占85％。虽然针对肺癌的研究方面有一定进展,包括肺癌患者的早期诊断、术前辅助化疗、放疗甚至靶向治疗的应用,但肺癌发病隐匿，肺癌患者就诊时大多数已属于中晚期，错过了最佳治疗时机，加上缺乏敏感、特异、有效的诊断和治疗方法，肺癌患者总的5年生存率仍低至15％，即便就诊时为早期，但因复发率很高，治疗效果也不佳。据统计，每年全球因肺癌致死的患者超过100万,并且以每年120万的新发肺癌病例递增，对人类健康和生命造成严重威胁。在我国的大部分地区，肺癌的发病率和死亡率呈持续上升趋势,男女肺癌发病率和死亡率居各类癌症榜首，若不采取相应的措施加以控制，到2025年我国预计将成为全球第一肺癌大国。因此探索有效地诊断、治疗以及预防肺癌的方法尤为重要。

利用分子生物学技术，能够有效地进行分子水平检测来判断恶性肿瘤患者发生转移、预后及靶向治疗的标志。进而为个体化治疗这些疾病提供便利。

MicroRNA是长约19-22个核苷酸的小片段单链非编码RNA。它通过有缺陷的碱基配对绑定其靶基因的3’非翻译区的互补序列来控制基因表达，从而使靶基因在转录或者翻译水平表达下调。近来microRNA成为从生长发育到癌症等很多病理生理过程的重要和革命性的保守调节因素。在不同的恶性肿瘤中，同一microRNA的作用可能不同。一个microRNA可以有很多属于不同通路的靶基因，而一个基因可以被几个microRNA调控。科学家发展技术来识别与肿瘤分期和患者预后相关的特异的基因表达标记，以改善预后和治疗。人们使用全面转录研究来识别以基因表达为基础的预后标识，但是，目前为止无一能应用于临床。与经典的mRNA表达谱相比，microRNA肿瘤表达谱似乎能够更准确地确定肿瘤亚型的分类。越来越多的证据支持实体肿瘤有特异的microRNA标记。与此同时，人们发现越来越多的microRNA的靶基因在肺癌发生中起重要作用，例如let-7、miR-34家族和miR-17-92簇。目前，科学家对microRNA的靶基因的识别仍然有限。在分子框架中，成熟microRNA带电后成为microRNA诱导的沉默复合体(miRISC)。该复合体含有Argonaute家族(一类庞大的蛋白质家族)，与通常位于靶基因3’端非翻译区的互补位点反应。目前的模型认为microRNA和其靶基因的反应起源于位于microRNA的5’端的一段被称为“种子序列”的6至8个核苷酸短片段。MicroRNA诱导的沉默复合体能够将靶基因再配置成特别间隔，在其中处理翻译阻滞和mRNA衰变。许多研究证实了microRNA诱导的mRNA失稳。联合计算预测，mRNA表达谱的测量代表了识别功能microRNA-靶关系的有效方法。在非小细胞肺癌中，许多不同的microRNA调节异常，可能有致癌或抑癌作用，并预测预后。识别能够预测肺癌患者预后的microRNA是一项重要发现，这表明microRNA可能在肿瘤进展中起重要作用。现行的临床病理分期在预测患者脑转移上有其局限性。具有相似临床病理特点或者相同分期的肺癌患者的转移发生和预后可能明显不同。分子标记物可以帮助医生鉴别高危患者，以便给予患者个体化治疗，从而改善生存。

肿瘤分子标志物(TumorMarker)是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。

发明内容

为了解决目前非小细胞肺癌患者的早期发现难，早期干预难的技术难题，本发明提供了一组标志基因microRNA-1253作为非小细胞肺癌诊断标记物及在药物和诊断试剂盒中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

含有如下所述物质在制备具有抑制肿瘤药物中的应用：

a)microRNA-1253；

b)含有microRNA-1253的非编码基因的重组载体；

c)含有microRNA-1253的非编码基因的重组病毒载体。

所述microRNA-1253序列为：3'ACGUCCGACUAGAAGAAGAGA 5’。

作为优选，所述抑制肿瘤为抑制非小细胞肺癌发生转移、扩散。

本发明还提供了所述物质的基因表达情况在制备具有抑制肿瘤预后或靶向治疗药物中的应用：

a)microRNA-1253；

b)含有microRNA-1253的非编码基因的重组载体；

c)含有microRNA-1253的非编码基因的重组病毒载体。

作为优选，所述肿瘤为非小细胞肺癌。

本发明再一个目的用于非小细胞肺癌发生转移、预后或靶向治疗的分子标记物，所述的分子标记物为microRNA-1253。

进一步的，所述分子标记物在制备非小细胞肺癌发生转移、预后或靶向治疗诊断试剂或试剂盒中的应用。

进一步的，所述预后为检测、疗效评估或转移复发监控。

分子标记物为microRNA-1253，简称miR-1253。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果如下：

1)利用分子生物学技术，能够有效地进行分子水平检测来判断非小细胞肺癌患者发生转移、预后及靶向治疗的标志，进而为个体化治疗这些疾病提供便利。

2)本发明公开了一种与非小细胞肺癌患者相关的基因microRNA-1253，并进一步证实上述基因能作为非小细胞肺癌患者发生转移、预后及靶向治疗的分子标记物，不仅精确度大大提高，同时对后续临床研究的开展具有重要的指导意义。

附图说明

图1为本发明microRNA-1253在非小细胞组织中的表达水平明显低于癌旁正常肺组织图。

图2为本发明microRNA-1253表达水平与临床分期呈明显负相关图,microRNA-1253在III+IV期非小细胞肺癌组织中的表达水平低于在I+II期非小细胞肺癌组织中的表达水平。

图3为本发明microRNA-1253表达水平与淋巴结转移呈明显负相关图,microRNA-1253在淋巴结转移非小细胞肺癌组织中的表达水平低于在无淋巴结转移非小细胞肺癌组织中的表达水平。

图4为本发明生存分析显示microRNA-1253低表达组患者(n＝70)生存期显著低于高表达组图。

图5为本发明生存分析显示microRNA-1253低表达组患者(n＝87)生存期显著低于高表达组图。

图6为本发明microRNA-1253高表达能抑制非小细胞肺癌细胞株细胞增殖图。

图7为本发明microRNA-1253高表达能抑制非小细胞肺癌细胞株细胞平板克隆形成能力图。

图8为本发明microRNA-1253高表达能抑制非小细胞肺癌细胞株细胞侵袭转移图。

图9为本发明microRNA-1253下调表达后，明显促进了裸鼠移植瘤的生长图。

图10为本发明microRNA-1253下调表达后，明显促进了肺转移瘤的发生图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步阐述，但实施例不对本发明构成任何限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例中未注明的具体的条件的实验方法，通常为本领域常规方法。

本实施中寻找非小细胞肺癌发生转移、预后及靶向治疗的标志物的方法如下：

一、患者和标本：

回顾了2004.7－2009.6，完全切除术后病理证实非小细胞肺癌93例石蜡标本并且术前未接受放化疗或其他针对肿瘤的治疗的患者，最后随访时间为2014年8月。

收集2013年1月1日-2015年12月30日手术的非小细胞肺癌患者的组织标本及距离肿瘤组织＞5cm的癌旁肺组织石蜡标本，共70例，最后随访时间为2017年7月。

根据2010年国际抗癌联盟(UICC)制定的TNM分期标准进行临床分期，所有患者术前均未接受过任何治疗，术后所有患者均接受术后辅助化疗。

二、原位杂交：

常规脱蜡至水，磷酸盐缓冲溶液(PBS，主要成分为K₂HPO₄、KH₂PO)洗3min×2；0.1M甘氨酸孵育5min×2；0.3％TritonX-100(PBS)处理15min，PBS洗3min×3；蛋白酶K(浓度为20ug/ml)37℃(先预热)20min，PBS洗3min×3；4％多聚甲醛固定5min，PBS洗3min×3；0.25％乙酸酐(0.1M三乙醇胺，pH8.0)处理10min，PBS洗3min×3；在-20℃，分别用70％，85％和100％的酒精处理5min，进行脱水，最后风干；滴加探针(4个探针分别按1：250稀释，按要求加至各切片，50ul/张)，加盖玻片，置于温盒，48℃杂交过夜，为16-18h；杂交后洗涤，SSC缓冲溶液(主要成分为氯化钠、枸橼酸钠、盐酸)脱盖片，37℃SSC缓冲溶液5min×3，SSC15min×2次；切片置于buffer缓冲液(主要成分为氯化钠、氯化钾、氯化镁、碳酸氢根)中浸5min；每个组织片在buffer缓冲液中0℃孵育15min；用buffer缓冲液按1：1000稀释地高辛DNA标记抗体，滴加50ul抗体稀释液，37℃孵育1h；用buffer缓冲液洗10minX2；用buffer缓冲液衡切片5min；配制显色液，用buffer缓冲液按1：50稀释四唑硝基蓝原液，临用前配制，避光。切片滴加显色液后，避光显色2-3h后观察显色情况，如显色较浅，可显色过夜。用buffer缓冲液洗涤终止显色，洗涤几次；滴加核固红复染，37℃，染色5-10min，水洗几次；快速脱水透明，中性树胶封片，显微镜观察。

三、RNA提取、质量检测、芯片杂交及数据处理

(一)、柠檬油精脱蜡处理石蜡包埋组织

石蜡包埋组织样品的预处理：石蜡包埋组织如果已经切片，可选需厚度不大于50μm的切片十片左右，尽量除去周围石蜡，置于1.5mL离心管中。

石蜡包埋组织如果是一整块，可用锋利刀片将组织轻轻刮下来并置于1.5mL离心管，尽量避免刮下石蜡。刮下的组织量控制在100mg以内。

柠檬油精脱蜡处理：

离心管中加入1ml柠檬油精(Limonen)，55℃震荡混匀5min。13,200rpm室温离心2min，弃上清。此步骤总共进行3次。

加入1ml无水乙醇至离心管中，55℃震荡混匀2min，13,200rpm室温离心2min，弃上清。重复此步骤一次。

弃上清，室温短暂离心，用移液器将剩余的无水乙醇吸出。

将离心管置于真空干燥仪中，抽干至组织呈干燥的粉末状。

(二)、肺组织标本的RNA、microRNA的提取

1.组织RNA的提取

全部过程严格按照Trizol试剂盒说明书进行，在无RNA酶环境下操作，所用试管吸头及溶液均常规用1％焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理(Tris除外)，室温过夜。

(1)分别取冻存的肺癌组织、癌旁正常组织各50～l00mg，置入预先加入0.5mlTrizol裂解液的1.5ml Eppendorf小管中，用匀浆器不断研磨成浆液状，并添加Trizol裂解液至1ml。

(2)15～30℃下孵育5分钟使核蛋白复合物完全溶解，每1ml Trizol反应液加氯仿0.2ml，强烈震荡15秒，15～30℃孵育2～3分钟。

(3)4℃12,000g离心15分钟，移上清至另一Eppendorf小管中，体积约为加入Trizol反应液体积的60％。

(4)沉淀RNA：每1mlTrizol加0.5ml异丙醇，15～30℃下孵育lO分钟。

(5)2～8℃≤12，000g离心10分钟。

(6)弃上清，70％乙醇(用DEPC处理的三蒸水配制)≥lml漂洗2次。

(7)2～8℃≤7，500g离心5分钟。

(8)真空抽干RNA，溶解于50μlDEPC水中。-70℃保存备用。

(9)RNA定量及电泳鉴定

A.取lμl RNA溶液加100μl水，混匀后用紫外可见分光光度计测定A260、A280及A260/A280比值，并读出RNA浓度。应为1.8～2.0。

B.1.2％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量：

①电泳槽用0.3％的H₂0₂浸泡30分钟，用DEPC水冲洗晾干。

②制胶(20ml)，含琼脂糖0.24g、无RNAase水17.4ml、10×MOPS 2ml、37％甲醛0.6ml、EB lml，将琼脂糖加水微波炉加热融化后，加10×MOPS，待凝胶冷却至60℃再加甲醛和EB。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。

③将凝胶预电泳5min，电压降为5V/cm。

④取适量的RNA，加入电泳缓冲液(10×)2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺l0μl混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准品。

⑤电泳结束后在紫外灯下拍照。

电泳后应见28S及18S两条条带，且28S：18S比值大于2，说明RNA未降解。

2.细胞小RNA的提取

细胞系小分子RNA(≤200nt)的提取用mirVanaTMmiRNA提取试剂盒按照说明书提取。方法简述如下：

细胞(<107)收集后用600μl裂解/结合缓冲液裂解(取适量组织(<250mg)，于液氮中研磨成粉末，转移至600μl裂解/结合缓冲液中裂解)，再加入60μlmiRNA匀浆液，在冰上放置lOmin。加入600μl酸酚/氯仿，剧烈混匀30-60s后于室温以10000rpm离心5min(完全分层)。小心吸取上清转移至新的无RNase1.5ml离心管中。

加入l/3体积的无水乙醇，完全混匀后加入到装在收集管中的离心柱中(每次最多700μl)，室温以10000rpm离心lmin，收集流出液。

在收集的流出液中再加入其2/3体积的无水乙醇，完全混匀后再加入到装在收集管中的另一新的离心柱中，室温以l0000rpm离心lmin，弃掉流出液。

离心柱中加入700μlmiRNA洗液1，离心5-10s漂洗。

再按上述方法用500μl洗液2/3漂洗两次。再离心lmin以完全去掉乙醇。

加100μl室温的洗脱液，l0000rpm离心lmin，回收RNA。

RNA稀释25倍后，紫外分光光度计测其OD260及OD280的值，并计算OD260/D280，比值大于1.8时，表明RNA纯度较好。同时根据OD260计算RNA的浓度。

四、mimic或inhibitor的瞬时转染

①mimic或inhibitor配制：在5nmol的双链siRNA中加入250μl 1×通用缓冲液，得到浓度为20μM的mimic或inhibitor母液，置-20摄氏度保存。

②取生长状态良好的细胞，于转染前一天将细胞接种于60mm培养皿中(不加抗生素)，转染时细胞密度达到30％左右。

③准备以下复合体：A液：将适当浓度的mimic或inhibitor稀释于500μl无血清培养基中，轻轻混匀；B液：取10μl Lipofectamine 2000(用前轻柔混匀)稀释于500μl无血清培养基中，混匀。室温孵育5min。

④将稀释的脂质体与稀释的mimic或inhibitor混合，轻轻混匀，室温孵育20分钟(复合体于室温6小时内会保持稳定)。

⑤将混合后的复合物1000μl加入细胞培养皿内，加无血清培养基至5ml，轻轻混匀。6小时后弃去原培养基，换含10％血清的培养基。

⑥48小时后收集细胞进行Westernblot，RT-PCR，MTS等相应实验。

五、MTS法检测细胞增殖曲线

当细胞生长至对数生长期，进行细胞转染或进行相应处理，收集细胞，稀释成合适浓度的细胞悬液，将细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔5000个细胞/100μl，在培养箱中继续培养至适当时间。每个实验组做6个平行孔，以只加培养基的孔作空白对照。设四个时间点：0h(细胞铺板后贴壁后既测)，24h，48h，72h，96h。采用MTS比色法测定细胞活性，每孔加入15μl MTS试剂(500μg/ml)，继续培养2h后用酶标分光光度计于波长570nm处测定光吸收值(OD)，以空白孔调零，OD值越高细胞数量越多。

六、克隆集落形成实验

①按照实验要求进行细胞转染或者处理细胞。

②准备大皿，每孔加入10ml培基，以及800个细胞。

③细胞在标准条件下培养10天-14天，观察克隆形成情况.

④当细胞形成肉眼可见的克隆时终止培养，弃去培养基，用PBS小心清洗细胞2次，加入4％甲醛固定，1ml/孔，固定15min，弃去固定液，以流水缓慢冲洗干净，加1ml结晶紫染液染色3min。以流水缓慢洗去染色液，通风橱中干燥，照相。

七、趋化小室实验(Transwell)

①细胞计数，小室中加入5×10⁵个细胞，上室中加500ul无血清培养基，下室内加800ul含10％血清培养基。

②迁移12-18小时后，弃去滤膜上、下室的培养液，用预热的PBS清洗，轻轻吹打PBS达到清洗滤膜下表面的作用，重复1次；

③在下室移入4％多聚甲醛600μl，使滤膜下表面浸在其中固定细胞，15min；

④弃去固定液，倒置transwell小室，使滤膜下表面朝上，自然风干；

⑤风干后直接在倒置的transwell小室的滤膜下表面滴上数滴吉姆萨染液，10min；

⑥蒸馏水清洗，用棉球擦去小室面未迁移的细胞，在倒置显微镜下观察计数。

八、质粒小量提取

①将1-5ml(高拷贝数的质粒)或10ml(低拷贝数的质粒)的细菌培养物用台式离心机10,000g离心5分钟。弃去上清并将试管倒置于纸巾上吸去剩余的培养液。

②加入250μl细胞悬浮液并旋涡震荡或吹打以充分悬浮细胞。充分悬浮细胞非常关键。如果不在离心管中，将悬浮的细胞转移至1.5ml消毒离心管中。加入250μl细胞裂解液并颠倒离心管4次以充分混合(不要旋涡震荡)。孵育至细胞悬浮液澄清，大约需要1-5分钟。注意：加入碱性蛋白酶溶液(第4步)之前观察裂解液部分澄清非常重要；但是孵育时间不要超过5分钟。

③加入10μl碱性蛋白酶溶液并颠倒离心管4次以充分混合。于室温孵育5分钟。

碱性蛋白酶能够灭活核酸酶及其它在细菌裂解过程中释放出的能够影响分离质粒质量的蛋白。加入350μlPlus SV中和溶液并迅速颠倒离心管4次以充分混合(不要旋涡震荡)。于室温将细胞裂解液(约14,000g)离心10分钟。将澄清裂解液(850μl)转移至准备好的离心柱中。不要搅动或将任何白色沉淀与上清液一同转移。

④于室温用离心机离心上清液1分钟。从收集管中取出离心管并弃去收集管中的液体。将离心柱重新插入收集管中。加入750μl先前用95％酒精稀释过的柱清洗液。于室温用离心机以最大速度离心1分钟。从收集管中取出离心管并弃去收集管中的液体。将离心柱重新插入收集管中。

⑤用250μl柱清洗液重复清洗步骤。于室温用离心机以最大速度离心2分钟。

将离心柱转移至一个新的1.5ml消毒离心管中，操作时需小心，不要将任何一点柱清洗液与离心柱一同转移。如果离心柱上粘有柱清洗液，则重新以最大速度离心1分钟。将离心柱转移至一个新的1.5ml消毒离心管中。将100μl无核酸酶的水加入离心柱以洗脱质粒DNA。于室温用离心机离心1分钟。

⑥洗脱质粒DNA后，将离心柱从1.5ml消毒离心管中取出并弃去离心柱。.不加缓冲液的DNA水溶液在-20℃及以下是稳定的。三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(TE缓冲液，主要分为0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷、0.1mol/LEDTA)中的DNA在4度是稳定的。如果需要将DNA存放于TE缓冲液中，将11μl 10×TE缓冲液加入100μl洗脱的DNA中。将离心管盖好并将纯化后的质粒DNA存放于-20℃或以下。

九、质粒提取鉴定

质粒浓度的测定用Amersham Bioscience Gene Quant浓度测定仪进行。DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光光度法测定DNA浓度，OD值为1.0相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用去离子水稀释DNA样品100倍并以水为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：

DNA(mg/ml)＝50×OD260读数×稀释倍数/1000；

DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。

十、双荧光素酶报告基因构建

利用PCR方法，以293T细胞基因组DNA为模板PCR扩增MMP19基因的3'UTR序列，将其克隆到pmiR-RB-REPORT^TM双荧光素酶报告载体中，所用载体的报告荧光为hRluc，校正荧光为hluc(做内参校正)。

①基因序列分析

对基因序列及载体序列分析，可以利用Xhol，Not1两个限制性内切酶将目的基因片段克隆到载体中，载体图谱如下：

②PCR

反应体系设计为30μl总体系，具体是5×DNA聚合酶缓冲液6μl，2.5mM脱氧核糖核苷三磷酸2μl，上下游引物(10uM)各1μl，PrimeSTAR HS DNA聚合酶(2.5U/μl)0.3μl，DNA模板1μl(约100ng)，用灭菌水补足30μl体系。反应条件为(降落PCR)：98℃2min预变性，循环内98℃10s变性，从68℃每个循环降1℃退火，72℃延伸45s；10个循环；在62℃退火，进行15个循环；PCR反应循环后72℃继续延伸3min，然后4℃保存。

③酶切

用XhoI，NotI对上述PCR产物和载体进行双酶切，酶切反应体系如下:10XH缓冲液3μl，DNA约2μg，内切酶(10U/μl)各1μl，灭菌去离子水补足到30μl。反应条件37℃，3hr。

④连接

目的片段DNA 15μl(约150ng)，载体1μl(约50ng)，10X T4连接缓冲液2ul，T4连接酶1ul，灭菌去离子水补足到20μl，22℃连接3hr。

⑤转化

取连接产物加到100μlDH5α感受态细胞中,混匀，冰浴30分钟；将上述转化液置于42℃水浴90秒，取出后立即置于冰浴中放置2-3分钟；向其中加入900μl 37℃预热的LB(不含抗生素)培养基，150rpm、37℃振荡培养45分钟；2500rpm离心5min，将上清液吸走，留100μl混匀菌液，加到含Amp抗生素LB固体琼脂培养基上(抗生素浓度100μg/ml)，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。

⑥菌落PCR鉴定

挑取上述平板上的单菌落，溶到3ul水中，取0.5ul做模板，进行PCR。反应体系设计为10μl总体系，具体是10X PCR扩增缓冲液(主要为100mM Tris-HCl缓冲液、15mM Mg2+、500mM KCl)1μl，25mM MgCl₂ 1μl,2.5mM脱氧核糖核苷三磷酸0.8μl，载体上下游引物(10uM)各0.5μl，Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)0.1μl，DNA模板0.5μl(约100ng)，用灭菌水补足10μl体系。反应条件为95℃3min预变性，循环内95℃30s变性，57℃退火，72℃延伸90s；25个循环；PCR反应循环后72℃继续延伸5min，然后4℃保存。

⑦将阳性的克隆送测序公司测序进一步鉴定。

⑧突变载体构建

A、突变PCR

反应体系设计为30μl总体系，具体是5×PrimeSTAR Buffer 6μl，2.5mM dNTPmix2μl，上下游引物(10uM)各1μl，PrimeSTAR HS DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl，野生型质粒模板1μl(约20ng)，用灭菌水补足30μl体系。反应条件为(降落PCR)：98℃2min预变性，循环内98℃10s变性，从66℃每个循环降1℃退火，72℃延伸45s；10个循环；再62℃退火，进行20个循环；PCR反应循环后72℃继续延伸5min，然后4℃保存。

B、DnpI内切酶消化残留的野生型质粒模板

直接向上述PCR反应产物中加入1.5μl DnpI内切酶，37℃酶切1hr。

C、转化

a、取连接产物10μl加到100μlDH5α感受态细胞中,混匀，冰浴30分钟。

b、将上述转化液置于42℃水浴90秒，取出后立即置于冰浴中放置2-3分钟。

c、向其中加入900μl 37℃预热的LB(不含抗生素)培养基，150rpm、37℃振荡培养45分钟。

d、2500rpm离心5min，将上清液吸走，留100μl混匀菌液，加到含Amp抗生素LB固体琼脂培养基上(抗生素浓度100μg/ml)，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。

D、落扩大培养提取质粒

挑取上述平板上的单菌落，接种到含Amp抗生素(抗生素浓度100μg/ml)的4ml LB液体培养基中，于220rpm摇床培养12h；然后提取质粒。

⑨取处于对数生长期的细胞接种于12孔板，将作为内参的海肾和MMP19、P21野生型或者突变型质粒以1:500的比例在无血清的RPMI1640培养基进行混合，再在混合液中加入miR-X mimic或者对照miRNA。转染48h后，根据Promaga双荧光素酶报告基因试剂盒说明书进行荧光素酶的活性检测。

十一、裸鼠移植瘤及肺转移瘤形成及治疗实验

SPF级BABIC裸鼠(5-6周龄，雌雄各半，10只/组/细胞系)，分别将1×10⁶非小细胞肺癌细胞株接种于裸鼠右侧背部皮下及尾静脉，以形成裸鼠移植瘤及转移瘤模型，7天后，裸鼠右侧背部皮下及尾静脉注射microRNA-1253的上调剂antagomir,5天一次，共7次。42天后统一采用拉颈法处死小鼠，解剖剥离裸鼠移植瘤及肺转移瘤组织，福尔马林固定处理。具体肺转移瘤形成及治疗实验参见图9和图10，图9中显示，microRNA-1253下调表达后，明显促进了裸鼠移植瘤的生长。图10中显示，microRNA-1253下调表达后，明显促进了肺转移瘤的发生。

十二、统计学分析

本实验所有数据均为3次以上重复实验得出。数据处理软件为Prism5和WordExcel。数据经SPSS16.0统计分析，P<0.05认为有统计学意义。

本实施例还提供了采用上述方法寻找非小细胞肺癌发生转移、预后及靶向治疗的标志物在制备具有抑制肿瘤药物中的应用：

a)microRNA-1253；

b)含有microRNA-1253的非编码基因的重组载体；

c)含有microRNA-1253的非编码基因的重组病毒载体。

其中，microRNA-1253序列为：3'ACGUCCGACUAGAAGAAGAGA 5’。

本实施例采用上述方法寻找非小细胞肺癌发生转移、预后及靶向治疗的标

志物microRNA-1253具有如下实验效果：

参见图1，microRNA-1253在非小细胞组织中的表达水平明显低于癌旁正常肺组织。

参见图2，microRNA-1253表达水平与临床分期呈明显负相关图,microRNA-1253在III+IV期非小细胞肺癌组织中的表达水平低于在I+II期非小细胞肺癌组织中的表达水平。

参见图3，microRNA-1253表达水平与淋巴结转移呈明显负相关图,microRNA-1253在淋巴结转移非小细胞肺癌组织中的表达水平低于在无淋巴45结转移非小细胞肺癌组织中的表达水平。

参见图4，生存分析显示microRNA-1253低表达组患者(n＝70)生存期显著低于高表达组。

参见图5，生存分析显示microRNA-1253低表达组患者(n＝87)生存期显著低于高表达组。

参见图6，microRNA-1253高表达能抑制非小细胞肺癌细胞株细胞增殖。

参见图7，microRNA-1253高表达能抑制非小细胞肺癌细胞株细胞平板克隆形成能力。

参见图8，microRNA-1253高表达能抑制非小细胞肺癌细胞株细胞侵袭转移。

其中图2、图3和图8表明microRNA-1253标记物具有抑制非小细胞肺癌发生转移、扩散的效果图。

其中图4和图5表明microRNA-1253标记物具有抑制非小细胞肺癌预后的效果图。

本实施例还提供了microRNA-1253的基因表达情况在制备具有抑制肿瘤预

后或靶向治疗药物中的应用：

a)microRNA-1253；

b)含有microRNA-1253的非编码基因的重组载体；

c)含有microRNA-1253的非编码基因的重组病毒载体。

本实施例中的肿瘤为非小细胞肺癌。

本实施例提供了用于非小细胞肺癌发生转移、预后或靶向治疗的分子标记物，该分子标记物为microRNA-1253。

本实施例中分子标记物microRNA-1253在制备非小细胞肺癌发生转移、预后或靶向治疗诊断试剂或试剂盒中的应用。

本实施中的诊断试剂或试剂盒按照常规方法制备。

本实施例中预后为检测、疗效评估或转移复发监控。

本实施例中分子标记物microRNA-1253的试剂盒监控非小细胞肺癌转移复发。

选取10例病理学检查确诊为非小细胞肺癌的患者，对其进行跟踪随访。患者样本来源于唐山市人民医院的非小细胞肺癌患者，所有收集的患者经过有效的治疗，临床资料及随访资源完整。首先采集10例非小细胞肺癌治疗后六周首次采集患者的血液，检测血液中相应基因的表达量，以后每三个月检查一次，跟踪九个月，共检测四次。

利用试剂盒检测10例患者非小细胞肺癌患者血液中相应基因的相对表达量。根据非小细胞肺癌患者治疗后6周，3个月，6个月，9个月时血液样本中相应基因的相对表达量与治疗前相比变化的水平来判断非小细胞肺癌患者是否发生转移复发。判断标准定为，治疗后基因的相对表达量与治疗前相比下降大于或者等于35％时，判断为转移复发；治疗后基因的相对表达量与治疗前相比下降大于或者等于35％时，判断为转移复发；治疗后基因的相对表达量与治疗前相比下降小于35％时，判断为无进展生存。

试剂盒的检测判断结果如表1所示。

表1：试剂盒的检测判断结果

序号	6周	3个月	6个月	9个月	临床结果
						1	升高26％	升高24％	升高22％	升高20％	无进展生存
2	升高22％	升高14％	下降15％	下降50％	转移复发
						3	升高24％	升高20％	升高21％	升高22％	无进展生存
4	升高19％	升高17％	升高10％	下降45％	转移复发
						5	升高27％	升高24％	升高22％	升高21％	无进展生存
6	升高25％	升高20％	升高6％	下降40％	转移复发
						7	升高25％	升高14％	升高5％	下降48％	转移复发
8	升高22％	升高20％	升高17％	升高15％	无进展生存
						9	升高29％	升高12％	下降22％	下降65％	转移复发
10	升高25％	升高8％	升高5％	下降48％	转移复发

从表1知，临床诊断结果显示10例非小细胞肺癌患者中有6例治疗后出现转移复发，4例无进展生存。使用本发明的试剂盒监控非小细胞肺癌，可早于临床症状和体征发现，为医生提前进行干预提供参考。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，尽管参照优选实施例对本发明专利作了详细说明，对于本领域的普通技术人员来说，可以对本发明的技术方案进行若干改进和润饰，但不脱离本发明技术方案的实质和范围，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.含有如下所述物质在制备具有抑制肿瘤药物中的应用：

a)microRNA-1253；

b)含有microRNA-1253的非编码基因的重组载体；

c)含有microRNA-1253的非编码基因的重组病毒载体。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制肿瘤为抑制非小细胞肺癌发生转移、扩散。

3.含有如下所述物质的基因表达情况在制备具有抑制肿瘤预后或靶向治疗药物中的应用：

a)microRNA-1253；

b)含有microRNA-1253的非编码基因的重组载体；

c)含有microRNA-1253的非编码基因的重组病毒载体。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为非小细胞肺癌。

5.用于非小细胞肺癌发生转移、预后或靶向治疗的分子标记物，其特征在于，所述的分子标记物为microRNA-1253。

6.如权利要求5所述的分子标记物在制备非小细胞肺癌发生转移、预后或靶向治疗诊断试剂或试剂盒中的应用。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述预后为检测、疗效评估或转移复发监控。