CN114774534A - Mmp19作为肾脏早期损伤相关的生物标志物在早期诊断肾损伤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供MMP19作为肾脏早期损伤相关的生物标志物在早期诊断肾损伤中的应用。本发明首次发现MMP19可作为肾脏早期损伤相关的生物标志物，并提出检测样本中生物标志物MMP19的试剂在制备早期诊断肾损伤的产品中的应用，从而能够早期、准确、快速、无创性地判断受试者是否存在肾损伤或患肾脏疾病的风险，及时对肾脏疾病进行早期干预。

Description

MMP19作为肾脏早期损伤相关的生物标志物在早期诊断肾损 伤中的应用

技术领域

本发明属于生物诊断技术领域，具体涉及MMP19作为肾脏早期损伤相关的生物标志物在早期诊断肾损伤中的应用。

背景技术

我国目前约有5百万的尿毒症病人，而且每年新增约40万人。如果按照每位患者每年约10万元的保守计算，目前的5百万病人需要每年投入费用约5000亿，其中的大部分费用，包括透析机器、耗材和药品，是从国外进口。

早期识别并干预减缓高危人群发展成慢性肾脏病、尿毒症是解决这一重大健康和经济问题的关键。肾脏早期损伤包括由各种炎症、代谢异常和免疫损伤等多种致病途径导致的肾小球滤过膜和肾小管的功能性和结构性损伤。糖尿病、高血压、有肾脏病家族史等慢性肾脏疾病高危人群，肾脏病变缓慢且易发生毫无察觉地进行性恶化。

肾脏早期损伤指标的检测对于肾脏病的早期诊断，早期干预起着重要的作用。而经典的生物标记物例如肌酐和/或尿素氮是监测肾脏功能的指标，却不能作为检测肾脏早期损伤的指标。特别是在急性期的时候，肾脏损伤与这些经典指标的变化是无相关性的。

因此，急需寻找灵活、方便、无创伤性且灵敏度高和特异性好的肾脏早期损伤检测方法，从而实现早期诊断肾损伤。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测样本中生物标志物的试剂在制备早期诊断肾损伤的产品中的应用，以便早期、准确、快速、无创性地判断受试者是否存在肾损伤或患肾脏疾病的风险。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种检测样本中生物标志物的试剂在制备早期诊断肾损伤的产品中的应用，所述的生物标志物为MMP19。

优选地，所述的检测样本中生物标志物的试剂包括检测样本中生物标志物的mRNA表达水平和/或活性的试剂和/或检测样本中生物标志物的蛋白表达水平和/或活性的试剂。

进一步优选地，所述的试剂选自特异性扩增所述的生物标志物的引物、特异性识别所述的生物标志物的探针、特异性结合所述的生物标志物编码的蛋白的结合物或能够检测所述的生物标志物的活性的试剂中的一种或多种。

再进一步优选地，所述的结合物包括特异性结合所述的生物标志物编码的蛋白的抗体、抗体功能片段或抗体偶联物中的一种或多种。

优选地，将所述的检测样本中生物标志物的试剂测得的检测样本中的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性与正常对照相比，所述的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性升高，则该受试者被判断为肾损伤或具有患肾脏疾病的倾向或肾脏疾病复发或肾脏疾病预后不良。

优选地，所述的肾损伤包括急性肾损伤和/或慢性肾损伤。

优选地，所述的检测样本为血液和/或尿液。

进一步优选地，所述的检测样本为血清样本。

本发明还提供一种用于早期诊断肾损伤的产品，所述的产品包括检测生物标志物MMP19的试剂。

优选地，所述的检测生物标志物MMP19的试剂选自特异性扩增所述的生物标志物MMP19的引物、特异性识别所述的生物标志物MMP19的探针、特异性结合所述的生物标志物MMP19编码的蛋白的结合物、或能够检测所述的生物标志物MMP19活性的试剂中的一种或多种。

进一步优选地，所述的结合物包括特异性结合所述的生物标志物MMP19编码的蛋白(基质金属肽酶19)的抗体、抗体功能片段或抗体偶联物中的一种或多种。

优选地，所述的产品包括试纸、试剂条、试剂盒、芯片、高通量测序平台。

进一步地，所述的试剂盒包括qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、电化学发光检测试剂盒。

本发明还提供一种肾损伤早期诊断系统，所述的诊断系统包括检测部件和结果判断部件，所述的检测部件用于检测所述的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性，所述的结果判断部件用于根据所述的测得到的所述的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性的结果，判断受试者是否存在肾损伤或存在肾脏疾病的风险。

优选地，所述检测构件包括试剂盒和与所述的试剂盒配套的检测装置，

所述的试剂盒选自qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、电化学发光检测试剂盒；所述的检测装置选自qPCR仪、ELISA检测装置、免疫印迹检测装置、流式细胞分析装置、免疫组化检测装置、免疫层析检测装置、电化学发光检测装置、活性检测试剂盒装置；

所述的结果判断部件包括输入模块、分析模块和输出模块，

所述的输入模块用于输入所述的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性；所述的分析模块用于根据所述的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性分析出受试者是否存在肾损伤或存在肾脏疾病的风险；所述的输出模块用于输出所述的分析模块的分析结果。

本发明还提供一种早期诊断肾损伤的方法。

具体地，所述的方法包括以下步骤：

1)获取受试者的检测样本；

2)检测受试者的检测样本中的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性；

3)将测得的所述的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性与受试者的患病或患病风险相关联；

4)若与正常对照相比，所述的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性升高，则该受试者被判断为肾损伤或具有肾脏疾病的倾向或肾脏疾病复发或肾脏疾病预后不良。

本发明中使用的试剂盒可以是现有MMP19检测试剂盒。

本发明中所述的特异性扩增所述的生物标志物MMP19的引物和/或特异性识别所述的生物标志物MMP19的探针可以根据MMP19序列信息设计并化学合成制备，所述的特异性结合所述的生物标志物MMP19编码的蛋白的结合物可以使用任意结构、大小、来源等的抗体或其片段，其能够与基质金属肽酶19结合即可。

本发明与现有技术相比具有如下优势：

本发明首次发现MMP19可作为肾脏早期损伤相关的生物标志物，并提出检测样本中生物标志物MMP19的试剂在制备早期诊断肾损伤的产品中的应用，从而能够早期、准确、快速、无创性地判断受试者是否存在肾损伤或患肾脏疾病的风险，对肾脏疾病进行早期干预。

附图说明

图1为实施例1中急性肾损伤(AKI)造模后不同时间点，小鼠血肌酐水平结果图；

图2为实施例1中急性肾损伤(AKI)造模后不同时间点，小鼠血尿素氮水平结果图；

图3为实施例1中急性肾损伤(AKI)造模后不同时间点，小鼠血清中MMP19 mRNA水平结果图；

图4为实施例1中急性肾损伤(AKI)造模后不同时间点，采用Western Blot检测小鼠血清中MMP19蛋白表达水平、急性肾损伤标志蛋白NGAL蛋白水平及GAPDH蛋白表达水平结果图；

图5为实施例1中急性肾损伤(AKI)造模后不同时间点，肾脏组织切片图和免疫组化结果图，其中上排图为肾脏病理(HE)染色结果图，下排图为肾脏组织免疫组化结果图；

图6为实施例2中急性肾损伤临床样本检测结果图，其中A图为健康对照组和急性肾损伤样本血清MMP19蛋白表达水平结果图；B图为按不同发病原因分类的急性肾损伤样本血清MMP19蛋白表达水平结果图；C图为按是否同时有菌血症的发生分类的急性肾损伤样本血清MMP19蛋白表达水平结果图。

图7为实施例2中急性肾损伤临床样本血清中MMP19蛋白水平与临床指标的相关性分析结果图，其中A图为血清中MMP19蛋白的含量与患者的血肌酐的相关性分析结果图，B图为血清中MMP19蛋白的含量与患者的C反应蛋白的相关性分析结果图；

图8为不同源性急性肾损伤患者尿液样本中MMP19蛋白表达水平结果图；其中A图为健康对照组和急性肾损伤样本尿液MMP19蛋白表达水平结果图；B图为将尿液中MMP19蛋白含量与患者的尿肌酐进行校正后水平结果图；C图为尿液中MMP19蛋白含量与血肌酐的相关性分析结果图；

图9为MMP19和[TIMP2]*[IGFBP7]诊断AKI的ROC分析曲线，其中A图为血清MMP19蛋白诊断AKI的ROC分析曲线，B图为尿液MMP19蛋白诊断AKI的ROC分析曲线，C图为FDA批准的AKI生物学标志物尿液[TIMP2]*[IGFBP7]诊断AKI的ROC分析曲线；

图10为实施例3中慢性肾损伤(CKD)造模后不同时间点，小鼠血清MMP19蛋白表达水平、α-SMA蛋白表达水平及GAPDH蛋白表达水平分析结果图；其中A图为血清MMP19蛋白表达水平基因、α-SMA蛋白表达水平及GAPDH蛋白表达水平结果图，B图为将尿液中MMP19蛋白含量与内参蛋白GAPDH进行校正后健康对照组的MMP19水平比较结果图，C图为将尿液中MMP19蛋白含量与尿肌酐进行校正后健康对照组的MMP19水平比较结果图；

图11为实施例4中慢性肾损伤临床样本MMP19蛋白检测结果图，其中A图为健康对照组和慢性肾损伤样本血清MMP19蛋白水平结果图，B图为血清MMP19蛋白诊断CKD的ROC分析曲线；

图12为实施例4中慢性肾损伤血清样本中MMP19蛋白含量与临床指标的相关性分析结果图，其中A图为血清中MMP19蛋白含量与血肌酐的相关性分析结果图，B图为血清中MMP19蛋白含量与肾小球滤过率的相关性分析结果图；

图13为实施例4中不同分期的慢性肾脏病临床血清样本MMP19蛋白含量分析结果图；

图14为实施例4中慢性肾脏病患者尿液中MMP19蛋白检测结果图，其中A图为健康对照组和慢性肾损伤样本尿液MMP19蛋白水平结果图，B图为尿液MMP19蛋白诊断CKD的ROC分析曲线；

图15为实施例4中不同分期的慢性肾脏病临床尿液样本MMP19蛋白含量分析结果图；

图16为肾功能衰竭早期诊断试剂盒研发的技术线路图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

由于肌酐和/或尿素氮不能作为检测肾脏早期损伤的指标且在急性期的时候，肾脏损伤与肌酐和/或尿素氮指标的变化是无相关性的。因此发明人进行了大量的研究和实验验证，筛选到适用于早期肾损伤的生物标志物MMP19。

本发明中，所述的“生物标志物”是指化合物，优选为基因，与来自具有第二表型(例如没有肾损伤)的受试者或一组受试者的生物样品相比，它在来自具有第一表型(例如存在肾损伤)的受试者或一组受试者的生物样品中差异地存在(即增加或减少)。所述的存在是指蛋白/基因表达浓度或蛋白/基因含量。

本发明中，生物标志物可以在任何水平上差异地存在，但是一般以如下的水平存在，所述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多，优选地，所述生物标志物以具有统计显著性(P﹤0.05)。

本发明中，所述的“检测样本”包括但不限于，血清、血浆、全血、血液衍生的细胞、尿液、汗液、肾脏组织及其组合。作为优选的实施方式，所述样本选自血清、尿液或肾脏组织。

本发明中，所述的“受试者”，是指任何动物，还指人类和非人类的动物。非人类的动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。在优选的实施方式中，所述受试者为人。

本发明提供了一种用于早期诊断肾损伤的产品，所述的产品中包含检测样本中本发明所述的生物标志物的试剂，并且可包含使用所述试剂盒判断受试者是否患有肾损伤或患有肾脏疾病的风险的说明书。

本发明中，可以以不同方式实现将生物标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合蛋白质测定浓度，并与根本的诊断问题关联起来。

优选地，用于将标志物与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法、Correlation分析。

受试者工作特征曲线下面积(＝AUC)是诊断规程的性能或精确性的一项指标。诊断方法的精确性由它的受试者工作特征(ROC)描述。ROC图是源自在观察的整个数据范围上连续改变决策阈的所有灵敏度/特异性对的线图。

实验室测试的临床性能取决于它的诊断精确性，或将受试者正确分类入临床有关亚组的能力。诊断精确性测量测试正确辨别所调查的受试者的两种不同状况的能力。

本发明中具体实施例中，所使用的原料均可通过市售获得。

本发明中具体实施例中，MMP19 NCBI登录号为NM 002429.6；NM 001272101.2，

人源MMP19检测采用英国Biorbyt ELISA试剂盒；Cat No.orb551482；

小鼠MMP19LEISA试剂盒采用英国Biorbyt，Cat No：orb777030；

MMP19抗体购买自novus Cat No：NBP2-17311；

GAPDH NCBI登录号为NM 001289726.1；NM 008084.3；

GAPDH检测采用proteintech GAPDH Monoclonal antibody，Cat No.60004-1-Ig；

α-SMA抗体来自Cell Signaling Technology，Cat No：19245S；

TIMP2 NCBI登录号为NM 003255.5；TIMP2检测采用武汉华美生物ELISA试剂盒，Cat No.CSB-E04733h；

NGAL NCBI NM 001360406.1/NM 021551.4，检测抗体采用ABCAM CAT NO:ab216462；

IGFBP7 NCBI登录号为NM 001553.3；NM 001253835.2，IGFBP7检测采用武汉华美生物ELISA试剂盒，Cat No.CSB-E17249h；

血肌酐、尿肌酐检测均采用南京建成生物工程研究所肌酐检测试剂盒完成，采用肌氨酸氧化酶法，货号：C011-2-1；

血尿素氮检测方法采用南京建成生物工程研究所检测试剂盒完成，采用脲酶法，货号：C013-2-1；

C反应蛋白检测方法免疫层析法；

肾小球滤过率(eGFR)测试方法为：

(1)经中国人改良的简化MDRD公式：

eGFR(ml/(min*1.73m²))＝186×(Scr)^-1.154×(年龄)^-0.203×(0.742女性)

注：eGFR为肾小球滤过率ml/(min*1.73m²)；Scr为血清肌酐(mg/dl)；年龄以岁为单位；体重以kg为单位。

实施例1：

急性肾损伤(AKI)小鼠实验

小鼠肾脏缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)模型

选取选择同一批次8周左右健康雄性野生型C57BL/6小鼠，随机分为5组，每组4只，对照组，缺血再灌注。高压灭菌所有手术器械，提前给小鼠腹部脱毛。

配制麻药：取三溴乙醇25g与15.5mL叔戊醇混合，配成1600mg/mL三溴乙醇浓储液，完全溶解后避光保存，使用前配制成20mg/mL工作液(生理盐水稀释)。

麻醉：将20mg/mL三溴乙醇工作液按350mg/kg的剂量(17.5μl/g小鼠体重)进行腹腔注射麻醉小鼠，用镊子轻夹小鼠脚趾，判断其是否进入深度麻醉状态。

手术：在小鼠进入深度麻醉后将其仰卧位固定于37度恒温无菌手术台上，腹部皮肤消毒，开腹。用棉签辅助找到双侧肾脏，分离肾蒂周围脂肪组织，游离肾蒂后用血管夹夹闭40分钟。取下血管夹，肉眼观察肾脏颜色由紫黑色恢复成原本的颜色，确认肾脏再灌注成功后缝合切口，用碘伏消毒，术后腹腔注射500ul生理盐水补液。小鼠苏醒后放回鼠笼，自由饮食饮水饲养，假手术组在第一天缺血再灌注手术中除了不夹闭血管外，其余操作与手术组相同。分别于造模后3小时(IRI-3h)、6小时(IRI-6h)、12小时(IRI-12h)、24小时(IRI-24h)利用小鼠代谢笼留取小鼠尿液标本，低温离心(4℃，3000rpm，10min)。待尿液收集完毕后处死小鼠，将小鼠麻醉成功后在杀鼠板上固定小鼠，打开腹腔，用1ml注射器经小鼠下腔静脉取血，根据下腔静脉血管充盈情况调整取血速度，小心拔下注射器针头，沿EP管管壁将血注入管中，室温静止1小时后3000r离心10分钟，吸取上清分装。打开小鼠胸腔，暴露心脏，剪破右心耳，将连接20ml注射器的静脉输液针从小鼠左心室扎入，无菌PBS灌流至肾脏变白，剥离肾包膜，取下肾脏，用刀片沿肾脏短轴切下中部约3mm厚的肾脏组织，放入EP管(装有4％多聚甲醛)中固定24小时以上，于4℃冰箱保存。再切取约3mm厚的肾脏组织置入装有冰冻组织包埋剂(optimal cutting temperature compound，OCT)的EP管中，放入液氮，其余肾脏组织分装后放入液氮，用于后续提取RNA和组织蛋白，留取的小鼠尿液、血清、肾脏组织蛋白、RNA样本均于-80℃冰箱保存。

AKI造模后不同时间点，小鼠血肌酐的情况见图1，小鼠血尿素氮的情况见图2，模型组与对照组相比，小鼠的血肌酐及尿素氮于缺血再灌注12小时升高。

AKI造模后不同时间点，小鼠血清中MMP19 mRNA水平情况见图3，AKI造模型后不同时间点肾脏组织MMP19的基因表达上调，随着时间的延长，上调水平增加，MMP19 mRNA在手术后3小时就已经上升，早于小鼠的血肌酐及尿素氮的升高时间。

AKI造模后不同时间点，采用Western Blot检测小鼠血清中MMP19基因、NGAL基因及GAPDH基因的蛋白表达水平情况(图4)，MMP19基因蛋白表达水平在造模后3小时已经开始上调，明显早于NGAL基因蛋白水平。

小鼠肾脏组织进行肾脏病理(HE)染色，结果见图5中上排图，免疫组化检测MMP19的蛋白表达分布变化，结果见图5中下排图，HE染色显示造模后6小时开始出现肾脏组织病理学损伤，而MMP19的免疫组化结果显示模型后3小时MMP19的表达显著上调，早于肾脏病理的损伤。

实施例2：

急性肾损伤临床样本检测实验

收集急性肾损伤患者的血清及尿液样本。留取晨尿/随机尿，对尿液样本进行低温离心(4℃，3000rpm，10min)。留取尿液上清分装，1mL/管，-80℃冰箱冻存。另外收集肾脏穿刺活检患者当天的血清样本，标本采集采用生化血清促凝剂真空采血管1管。采血后立即颠倒混匀8次，静置15-20分钟低温离心(4℃，3000rpm，10min)。收取上清分装20μL/管，-80℃冰箱冻存。1个月进行一次样本检测。

收集临床诊断为急性肾损伤的样本，入选标准为：1.在48小时之内，其血肌酐的指标平均指标大于26.4μmol/L。2.在一周之内血肌酐的水平上升到基线水平(自身基础值)的1.5倍以上。3.连续3-4天的尿量均小于0.5ml/小时。如果检查结果符合其中的任何一项，均入组。收取入组患者的血液及尿液样本。

健康对照组样本收集，收取体检中心体检患者样本，入组要求为与肾脏穿刺活检患者及急性肾损伤患者年龄、性别匹配，肾功能检测结果正常的样本，于检验科收集检验后的标本，标本收集、处理及保存的步骤同上。

本实施例中，我们收集了健康体检患者作为健康对照组16例血清样本，急性肾损伤样本56例血清样本。

健康对照组和急性肾损伤样本血清MMP19蛋白水平见图6A，AKI疾病组与健康对照组相比，急性肾损伤患者血清中的MMP19蛋白显著上调，对照组血清MMP19蛋白水平为248.9±18.91ng/ml，AKI患者血清MMP19蛋白的水平为966.4±83.14ng/ml。

将AKI疾病组按着不同发病原因进行分类，按不同发病原因分类的急性肾损伤样本血清MMP19蛋白水平见图6B，肾前性AKI患者(Prerenal-AKI)19例，血清MMP19蛋白水平为695±81.49ng/ml；肾性AKI患者(Intrarenal-AKI)34例，血清MMP19蛋白水平为1130±120.8ng/ml；肾后性AKI患者(Post-Renal-AKI)共4例，血清MMP19蛋白水平为1023±183.4ng/ml。其中一例病例既属于肾前性AKI患者又属于肾性AKI患者。

将AKI疾病组患者是否同时有菌血症的发生，分为菌血症AKI(Sepsis AKI)和非菌血症AKI(Non-sepsis AKI)，血清MMP19水平见图6C，Non-sepsis AKI共36例，血清中MMP19蛋白的含量为913.6±95.34ng/ml，中20例，血清中MMP19蛋白的含量为1091±186.2ng/ml。

利用prism 8.0correlation将血清中MMP19蛋白的含量与患者的血肌酐及尿素氮、CRP等进行相关性分析，结果见图7，血清中MMP1 9蛋白的含量与患者的血肌酐成正相关关系(图7A)，血清中MMP19蛋白的含量与患者的C反应蛋白(CRP)成正相关关系(图7B)。血清中MMP19的含量与血尿素氮也呈现成相关关系，但无统计学差异。

此外，收集不同源性AKI患者尿液样本43例，年龄性别相匹配的对照25例，对其尿液中的MMP19蛋白的含量进行检测，结果见图8。

图8A显示AKI疾病组与健康对照组相比，AKI患者尿液中MMP19的分泌显著增加，具体为对照组尿液MMP-19蛋白的含量为0.3896±0.04234ng/ml；AKI患者MMP19蛋白的含量为12.44±1.708ng/ml。图8B显示将尿液中MMP19蛋白含量与患者的尿肌酐进行校正后健康对照组的MMP19蛋白水平为4.648±0.6982，而AKI患者尿液中MMP19蛋白的含量为346.8±80.91。利用prism 8.0correlation将尿液中MMP19蛋白的含量与患者临床指标进行相关性分析(图8C)，尿液中MMP19蛋白的含量与血肌酐成正相关关系。

采用ROC分析曲线下面积AUC评估MMP19作为诊断标志物的敏感性和特异性并与FDA批准的AKI生物学标志物尿液[TIMP2]*[IGFBP7]进行比较，结果见图9，结果显示血清MMP19蛋白诊断AKI的ROC曲线下面积为0.9743(图9A)，尿液MMP19蛋白诊断AKI的ROC曲线下面积为0.9837(图9B)，而FDA批准的AKI生物学标志物尿液[TIMP2]×[IGFBP7](TIMP2蛋白含量与IGFBP7蛋白含量乘积)诊断AKI的ROC曲线下面积为0.8651(图9C，采用上述收集的43例AKI患者尿液样本和10例年龄性别相匹配的对照样本)。尿液中MMP19蛋白显示出更高诊断性AKI的疗效。因此，MMP19适宜作为早期诊断急性肾损伤的有效生物标志物。

实施例3：

慢性肾损伤(CKD)小鼠实验

单侧输尿管结扎(Unilateral ureteral obstruction，UUO)模型

选择同一批次8周左右健康雄性野生型C57BL/6小鼠，随机分为4组，对照组，造模的第3天(UUO-3d)、造模的第7天(UUO-7d)。造模的第14天(UUO-14d)，对照组4只，模型组每组6只。高压灭菌所有手术器械，提前给小鼠腹部脱毛。

配制麻药：取三溴乙醇25g与15.5mL叔戊醇混合，配成1600mg/mL三溴乙醇浓储液，完全溶解后避光保存，使用前配制成20mg/mL工作液(生理盐水稀释)。

麻醉：将20mg/mL三溴乙醇工作液按350mg/kg的剂量(17.5μl/g小鼠体重)进行腹腔注射麻醉小鼠，用镊子轻夹小鼠脚趾，判断其是否进入深度麻醉状态。

手术：将麻醉后的小鼠仰卧位固定于无菌手术台上，腹部皮肤用75％酒精进行消毒，于小鼠左下腹腹股沟中点上方1cm处，剪开约1cm纵行切口，打开腹腔，用无菌棉签辅助先找到左侧肾脏再确定紧贴着肾脏下极左输尿管的位置，分离周围脂肪组织后，在左输尿管上1/3处用线结扎，为了确保模型构建成功，在结扎点下方约1cm处再结扎一次。结扎完毕后将肠管复位，缝合腹腔，用碘伏消毒切口，小鼠苏醒后放回鼠笼。假手术组小鼠除了不结扎输尿管以外，其余操作与手术组小鼠相同。分别于造模的第3天、7天、14天利用小鼠代谢笼留取小鼠尿液标本，低温离心(4℃，3000rpm，10min)。待尿液收集完毕后处死小鼠，将小鼠麻醉成功后在杀鼠板上固定小鼠，打开腹腔，用1ml注射器经小鼠下腔静脉取血，根据下腔静脉血管充盈情况调整取血速度，小心拔下注射器针头，沿EP管管壁将血注入管中，室温静止1小时后3000r离心10分钟，吸取上清分装。打开小鼠胸腔，暴露心脏，剪破右心耳，将连接20ml注射器的静脉输液针从小鼠左心室扎入，无菌PBS灌流至肾脏变白，剥离肾包膜，取下肾脏，用刀片沿肾脏短轴切下中部约3mm厚的肾脏组织，放入EP管(装有4％多聚甲醛)中固定24小时以上，于4℃冰箱保存。再切取约3mm厚的肾脏组织置入装有冰冻组织包埋剂[OCT包埋剂英文全称:optimal cutting temperature compound]包埋剂的EP管中，放入液氮，其余肾脏组织分装后放入液氮,用于后续提取RNA和组织蛋白，留取的小鼠尿液、血清、肾脏组织蛋白、RNA样本均于-80℃冰箱保存。

采用Western Blot检测血清MMP19基因、肾脏纤维化相关标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因及GAPDH基因蛋白水平情况，图10A显示模型组与对照组(Sham)相比，小鼠肾脏组织中MMP19的基因及蛋白水平显著上调，并且随着输尿管梗阻时间的延长而增加，MMP19基因蛋白表达水平在造模后3天已经开始上调，明显早于α-SMA基因蛋白水平。

利用小鼠ELISA方法检测小鼠尿液中MMP19蛋白的含量，图10B显示将尿液中MMP19蛋白的含量与β-action进行校正后健康对照组的MMP19蛋白水平比较结果，图10C显示将尿液中MMP19蛋白的含量与尿肌酐进行校正后健康对照组的MMP19蛋白水平比较结果。结果发现MMP19蛋白在UUO模型中分泌增加，并且随着梗阻时间的延长显著增加。由于单侧输尿管结扎实验，小鼠的肾功能正常，小鼠的血肌酐、血尿素正常，而小鼠尿液中MMP19蛋白在UUO小鼠模型第3天就已经开始升高，到14天显著升高，并且具有统计学意义，说明MMP19可作为早期诊断慢性肾脏病纤维化的有效生物标志物。

实施例4：

慢性肾损伤临床样本检测实验

收集肾脏内科肾脏穿刺活检患者活检当天的血清及尿液样本。留取肾脏穿刺活检患者当天的晨尿，对尿液样本进行低温离心(4℃，3000rpm，10min)。留取尿液上清分装，1ml/管，-80℃冰箱冻存。另外收集肾脏穿刺活检患者当天的血清样本，标本采集采用生化血清促凝剂真空采血管1管。采血后立即颠倒混匀8次，静置15-20分钟低温离心(4℃，3000rpm，10min)。收取上清分装20μl/管，-80℃冰箱冻存。1个月进行一次样本检测。

本实施例中，收集健康体检患者16例血清样本作为对照组，肾脏穿刺活检患者样本40例。

健康对照组和慢性肾损伤样本血清MMP19蛋白水平见图11A，CKD疾病组与健康对照组相比，正常健康对照组血清中MMP19蛋白水平为248.9±18.91ng/ml；所有肾穿刺活检样本血清中MMP19蛋白的含量为420.2±32.64ng/ml，并且血清MMP19蛋白诊断CKD的曲线下面积为0.7766(图11B)。

利用prism 8.0correlation将所有样本中血清样本中MMP19蛋白的含量与对应血肌酐进行相关性分析，图12A显示血清中MMP19蛋白的含量与血肌酐呈正相关关系，R＝0.4572，P＝0.0004；图12B显示血清中MMP19蛋白的含量与肾小球滤过率eGFR呈负相关关系，R＝-0.4037，P＝0.002。

慢性肾脏病根据肾小球滤过率可以分为五期。CKD I期：肾小球滤过率大于等于90ml/min，但已有肾脏结构改变或肾损害病史；CKD II期：肾小球滤过率60～89ml/min；CKDIII期:肾小球滤过率为30～59ml/min；CKD IV期：肾小球滤过率15～29ml/min；CKD V期：肾小球滤过率小于15ml/min。如图13所示，本实施例40例肾脏穿刺活检患者样本包括20例CKDI-II期血清样本，血清中MMP19蛋白的含量为376.5±29.96ng/ml；CKD III-V期血清样本共计20例，血清MMP19蛋白的含量为468.5±55.96ng/ml。

本实施例还收集慢性肾损伤临床尿液样本，包括正常对照25例，肾脏穿刺活检患者一共85例。将健康对照组与慢性肾脏病病例进行分析，结果见发现CKD患者中尿中MMP19的含量显著增加，正常健康对照组尿液中MMP19蛋白的含量为0.3896±0.04234ng/ml；慢性肾脏病患者尿液中MMP19蛋白的含量为2.126±0.4031ng/ml(图14A)，并且其诊断CKD的曲线下面积为0.8014(图14B)。

将85例慢性肾损伤临床尿液样本根据肾小球滤过率进行分期，如图15所示，CKDI-II期尿液样本62例，尿液MMP19蛋白的含量为1.069±0.2041ng/ml；CKD III-IV期尿液样本共计20例，尿液MMP19蛋白的含量为3.680±0.9678ng/ml；CKD V期尿液样本总计3例，尿液MMP19蛋白的含量为13.6±4.741ng/ml。

综上，MMP19可作为急性肾损伤和慢性肾损伤的早期诊断生物标志物。使用现有MMP19检测试剂盒或自行开发MMP19检测试剂盒作为肾功能衰竭早期诊断试剂盒，如图16所示肾功能衰竭早期诊断试剂盒研发的技术线路包括以下程序(以MMP19 ELISA检测试剂盒为例)：

一、生物学标志物MMP19抗体、标准品制备，标准品实验数据检测

二、MMP19 ELISA检测试剂盒注册申报

三、对生产的ELISA检测试剂盒，与对照试剂平行检测，看二者差异，对其进行稳定性、特异性、敏感性评估，形成评估报告。

四、MMP19 ELISA检测试剂盒投产，向全国各大三甲医院检验科或肾脏内科供应，获得固定销售渠道，快速进入并扩大市场。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (12)

1.检测样本中生物标志物的试剂在制备早期诊断肾损伤的产品中的应用，其特征在于，所述的生物标志物为MMP19。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测样本中生物标志物的试剂包括检测样本中生物标志物的mRNA表达水平和/或活性的试剂和/或检测样本中生物标志物的蛋白表达水平和/或活性的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的试剂选自特异性扩增所述的生物标志物的引物、特异性识别所述的生物标志物的探针、特异性结合所述的生物标志物编码的蛋白的结合物或能够检测所述的生物标志物的活性的试剂中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的结合物包括特异性结合所述的生物标志物编码的蛋白的抗体、抗体功能片段或抗体偶联物中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述的检测样本中生物标志物的试剂测得的检测样本中的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性与正常对照相比，所述的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性升高，则该受试者被判断为肾损伤或具有患肾脏疾病的倾向或肾脏疾病复发或肾脏疾病预后不良。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肾损伤包括急性肾损伤和/或慢性肾损伤。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测样本为血液和/或尿液。

8.一种用于早期诊断肾损伤的产品，其特征在于，所述的产品包括检测生物标志物MMP19的试剂。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述的检测生物标志物MMP19的试剂选自特异性扩增所述的生物标志物MMP19的引物、特异性识别所述的生物标志物MMP19的探针或、特异性结合所述的生物标志物MMP19编码的蛋白的结合物或能够检测MMP19活性的试剂中的一种或多种。

10.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述的产品包括试纸、试剂条、试剂盒、芯片、高通量测序平台。

11.一种肾损伤早期诊断系统，其特征在于，所述的诊断系统包括检测部件和结果判断部件，所述的检测部件用于检测所述的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性，所述的结果判断部件用于根据所述的测得到的所述的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性的结果，判断受试者是否存在肾损伤或存在肾脏疾病的风险。

12.根据权利要求11所述的肾损伤早期诊断系统，其特征在于，所述检测构件包括试剂盒和与所述的试剂盒配套的检测装置，

所述的试剂盒选自qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、电化学发光检测试剂盒；所述的检测装置选自qPCR仪、ELISA检测装置、免疫印迹检测装置、流式细胞分析装置、免疫组化检测装置、免疫层析检测装置、电化学发光检测装置、活性检测试剂盒装置；

所述的结果判断部件包括输入模块、分析模块和输出模块，

所述的输入模块用于输入所述的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性；所述的分析模块用于根据所述的生物标志物MMP19的表达水平和/或活性分析出受试者是否存在肾损伤或存在肾脏疾病的风险；所述的输出模块用于输出所述的分析模块的分析结果。

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