CN104144943B - 评估肾结构改变和结果 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了涉及评价肾结构改变(如肾纤维化、肾小球基底增厚、系膜基质膨胀、足细胞肿胀和足突消失)以及涉及评价结果的方法和材料。例如，提供了使用尿液CNP(如尿液与血浆CNP比率)水平以确定哺乳动物是否正在发生肾结构改变(如肾纤维化、肾小球基底增厚、系膜基质膨胀、足细胞肿胀和足突消失)的方法和材料，以及使用尿液CNP水平以鉴定发生不良结果可能性升高的患者的方法和材料。

Description

评估肾结构改变和结果
相关申请的交叉参考
本申请要求2011年12月23日提交的美国临时申请系列号61/580,139的优先权。在先申请的公开内容被认为是本申请公开的部分(且通过引用纳入本文)。
有关联邦资助的研究的声明
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的HL036634和HL076611下由政府资助完成。政府对本发明拥有某些权利。
背景
1.技术领域
本发明涉及评价肾结构改变(如肾纤维化)的方法和材料以及评价后果的方法和材料。例如，本发明涉及使用尿液C型利尿钠肽(CNP)的水平(如尿液与血浆CNP的比率)或血浆CNP的水平以确定哺乳动物是否正发生肾结构改变(如肾纤维化、肾小球基底增厚、足细胞肿胀和足突消失)的方法和材料。本发明还涉及使用尿液或血浆CNP(可包括六种分子CNP形式)水平鉴定心力衰竭患者的方法和材料，所述患者发生不良结果的几率增加且可能罹患已知与肾脏相关的疾病，所述疾病包括但不限于心力衰竭、高血压、糖尿病、代谢综合征和慢性肾疾病。
2.背景信息
C型利尿钠肽(CNP)是利尿钠肽家族中的一部分，在肾脏及内皮中生成并可在血浆和尿液中检测到。首先合成前体103个氨基酸(AA)的蛋白质proCNP(AA1-103)，然后被细胞内内切蛋白酶弗林蛋白酶切割成CNP-53(AA51-103)和NT-proCNP(AA1-50)。由一未知酶催化的进一步下游加工对将CNP-53切割成主要的生物活性形式CNP-22(AA82-103)及其氨基端NT-CNP-53(51-81)。
通过激活利尿钠肽受体B(NPR-B，也被称作鸟苷酸环化酶受体B(GC-B))并生成第二信使3’,5’-环鸟苷一磷酸(cGMP)，CNP拥有强大的抗纤维化和抗增殖特性。CNP含有有限的排钠利尿和利尿活性。
概述
本发明提供了涉及评价肾结构改变(如肾纤维化、肾小球基底增厚、足细胞肿胀和足突消失)的方法和材料。例如，本发明提供了使用尿液CNP(如尿液与血浆CNP的比率)和/或血浆CNP的水平以确定哺乳动物是否正在或将要发生肾结构改变(如肾纤维化、肾小球基底增厚、系膜基质膨胀、足细胞肿胀和足突消失)的方法和材料。通过评价尿液或血浆CNP水平(如尿液与血浆CNP的比率)确定人类患者是否正在或将要发生肾结构改变能够有助于在症状和疾病出现前鉴定临床前肾结构改变的人，从而启动设计用于防止慢性肾疾病发展的策略。
本发明还提供了评价心力衰竭结果的方法和材料。例如，本发明提供了使用尿液或血浆CNP和/或其六个可能的分子形式(图8)鉴定发生不良结果几率增加的人的方法和材料。至少部分基于尿液CNP水平上升和/或血浆CNP水平降低对发生不良结果几率增加的患者的鉴定能够帮助医生和患者做出适当的治疗决定。
总的来说，本发明的一个方面描述了一种评价肾结构的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：确定哺乳动物的尿液CNP与血浆CNP的比率是否升高，尿液CNP与血浆CNP的比率升高表明哺乳动物肾结构改变或有可能发生肾结构改变，且尿液CNP与血浆CNP的比率未升高表明哺乳动物未发生且不会发生肾结构改变。所述哺乳动物可以是人。所述肾结构改变可以包括肾纤维化。升高的尿液CNP与血浆CNP的比率可以高于12,000pg/天比16pg/mL。升高的尿液CNP与血浆CNP的比率可以高于13,200pg/天比18pg/mL。
在另一个方面，本发明描述了一种评价肾结构的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：确定哺乳动物的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率是否升高，尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率升高表明哺乳动物肾结构改变或有可能发生肾结构改变，且不存在尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率升高表明哺乳动物未发生且不会发生肾结构改变。所述哺乳动物可以是人。所述肾结构改变可以包括肾纤维化。升高的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率可以高于12,000pg/天比16pg/mL。升高的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率可以高于13,200pg/天比18pg/mL。
在另一个方面，本发明描述了一种评价肾结构的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：(a)检测哺乳动物的尿液CNP与血浆CNP的比率是否升高，以及(b)至少部分基于检测结果将哺乳动物鉴定为存在肾结构改变或可能发生肾结构改变。所述哺乳动物可以是人。所述肾结构改变可以包括肾纤维化。升高的尿液CNP与血浆CNP的比率可以高于12,000pg/天比16pg/mL。升高的尿液CNP与血浆CNP的比率可以高于13,200pg/天比18pg/mL。
在另一个方面，本发明描述了一种评价肾结构的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：(a)检测哺乳动物的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率是否升高，以及(b)至少部分基于检测结果将哺乳动物鉴定为存在肾结构改变或可能发生肾结构改变。所述哺乳动物可以是人。所述肾结构改变可以包括肾纤维化。升高的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率可以高于12,000pg/天比16pg/mL。升高的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率可以高于13,200pg/天比18pg/mL。
在另一个方面，本发明描述了一种评价结果的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：确定哺乳动物是否患有一种会使尿液CNP水平升高的疾病，尿液CNP水平升高表明哺乳动物可能发生不良结果，且尿液CNP水平未升高表明哺乳动物不可能发生不良结果。所述哺乳动物可以是人。所患疾病可以是心力衰竭、高血压、糖尿病、代谢综合征或慢性肾脏疾病。所述不良结果可以是死亡、住院治疗、心力衰竭、心肌梗塞、肾功能恶化、心脏功能恶化或透析。所述尿液CNP可以是尿液NT-CNP-53。升高的水平可以高于36,000pg的NT-CNP-53/天。升高的水平可以高于42,000pg的NT-CNP-53/天。
在另一个方面，本发明描述了一种评价结果的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：(a)检测患病哺乳动物的尿液CNP是否升高，以及(b)至少部分基于检测结果将哺乳动物鉴定为可能发生不良结果。所述哺乳动物可以是人。所患疾病可以是心力衰竭、高血压、糖尿病、代谢综合征或慢性肾脏疾病。所述不良结果可以是死亡、住院治疗、心力衰竭、心肌梗塞、肾功能恶化、心脏功能恶化或透析。所述尿液CNP可以是尿液NT-CNP-53。升高的水平可以高于36,000pg的NT-CNP-53/天。升高的水平可以高于42,000pg的NT-CNP-53/天。
在另一个方面，本发明描述了一种评价肾结构的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：(a)使用抗-CNP抗体进行免疫试验以检测哺乳动物中尿液CNP与血浆CNP的比率升高，以及(b)将哺乳动物鉴定为存在肾结构改变或可能发生肾结构改变。所述哺乳动物可以是人。所述肾结构改变可以包括肾纤维化。升高的尿液CNP与血浆CNP的比率可以高于12,000pg/天比16pg/mL。升高的尿液CNP与血浆CNP的比率可以高于13,200pg/天比18pg/mL。
在另一个方面，本发明描述了一种评价肾结构的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：(a)使用抗-CNP抗体进行免疫试验以检测哺乳动物中尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率升高，以及(b)将哺乳动物鉴定为存在肾结构改变或可能发生肾结构改变。所述哺乳动物可以是人。所述肾结构改变可以包括肾纤维化。升高的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率可以高于12,000pg/天比16pg/mL。升高的尿液CNP-22与血浆CNP-22的比率可以高于13,200pg/天比18pg/mL。
在另一个方面，本发明描述了一种评价结果的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：(a)使用抗-CNP抗体进行免疫试验以检测患病哺乳动物中尿液CNP水平是否升高，以及(b)至少部分基于检测结果将哺乳动物鉴定为可能发生不良结果。所述哺乳动物可以是人。所患疾病可以是心力衰竭、高血压、糖尿病、代谢综合征或慢性肾脏疾病。所述不良结果可以是死亡、住院治疗、心力衰竭、心肌梗塞、肾功能恶化、心脏功能恶化或透析。所述尿液CNP可以是尿液NT-CNP53。升高的水平可以高于36,000pg的NT-CNP53/天。升高的水平可以高于42,000pg的NT-CNP53/天。
在另一个方面，本发明描述了一种评价哺乳动物是否存在死亡或心肌梗塞风险升高的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：确定哺乳动物的血浆CNP-22水平是否升高，血浆水平升高表明该哺乳动物有可能比该水平未升高的同等哺乳动物早发生死亡或心肌梗塞，且血浆水平未升高表明该哺乳动物有可能比该水平升高的同等哺乳动物晚发生死亡或心肌梗塞。所述哺乳动物可以是人。升高的水平可以高于14pg/mL。升高的水平可以高于16pg/mL。
在另一个方面，本发明描述了一种评价哺乳动物是否存在死亡或心肌梗塞风险升高的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：(a)使用抗-CNP抗体进行免疫试验以检测哺乳动物中血浆CNP-22水平是否升高，以及(b)至少部分基于检测结果将哺乳动物鉴定为可能发生死亡或心肌梗塞。所述哺乳动物可以是人。升高的水平可以高于14pg/mL。升高的水平可以高于16pg/mL。所述方法可包括将哺乳动物鉴定为可能比该水平未升高的同等哺乳动物早发生死亡或心肌梗塞。
在另一个方面，本发明描述了一种治疗肾结构改变风险升高的哺乳动物的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：(a)确定哺乳动物的尿液CNP与血浆CNP的比率升高，(b)监测哺乳动物是否存在肾结构改变的风险因素，以及(c)指导给予哺乳动物治疗剂以减轻肾结构改变的症状。所述哺乳动物可以是人。升高的尿液CNP与血浆CNP的比率可以高于12,000pg/天比16pg/mL。升高的尿液CNP与血浆CNP的比率可以高于13,200pg/天比18pg/mL。所述风险因素可以选自由以下因素组成的组：年龄因素、高血压、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、体重指数升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和糖尿病。所述治疗剂可以是ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、醛固酮拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿钠肽。
在另一个方面，本发明描述了一种治疗不良结果风险升高的哺乳动物的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：(a)确定哺乳动物的尿液CNP水平升高，(b)监测哺乳动物是否存在不良结果的风险因素，以及(c)指导给予哺乳动物治疗剂以降低不良结果发生的可能性。所述哺乳动物可以是人。所述尿液CNP可以是尿液NT-CNP-53。升高的水平可以高于36,000pg的NT-CNP-53/天。升高的水平可以高于42,000pg的NT-CNP-53/天。所述风险因素可以选自由以下因素组成的组：年龄因素、高血压、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、体重指数升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和糖尿病。所述治疗剂可以是ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、醛固酮拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿钠肽。
在另一个方面，本发明描述了一种治疗心肌梗塞风险升高的哺乳动物的方法的特征。所述方法包括，或基本由以下步骤组成：(a)确定哺乳动物的血浆CNP-22水平升高，(b)监测哺乳动物是否存在心肌梗塞的风险因素，以及(c)指导给予哺乳动物治疗剂以降低心肌梗塞的风险。所述哺乳动物可以是人。升高的水平可以高于14pg/mL。升高的水平可以高于16pg/mL。所述风险因素可以选自由以下因素组成的组：年龄因素、高血压、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、体重指数升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和糖尿病。所述治疗剂可以是ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、醛固酮拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿钠肽。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。
从下文的详述和权利要求中能够很容易地了解本发明的其他特征和优点。
附图说明
图1.(A)天狼猩红染色在20x物镜放大下的代表性组织学图像和定量(B)2、11和20个月龄费歇尔大鼠的肾皮质纤维化的20x物镜放大下的代表性组织学图像。数值为平均值±SE。所有年龄组中n＝7。*P<0.05相对于2个月，相对于11个月。
图2.(A)天狼猩红染色在20x物镜放大下的代表性组织学图像和定量(B)2、11和20个月龄费歇尔大鼠的肾髓质纤维化的20x物镜放大下代表性组织学图像。数值为平均值±SE。所有年龄组中n＝7。*P<0.05相对于2个月，相对于11个月。
图3.来自2个月(A)、11个月(B)和20个月(C)龄费歇尔大鼠的肾小球在8000x放大下的代表性电子显微镜图。
图4.来自2、11和20个月龄费歇尔大鼠中肾小球基底增厚的定量。数值为平均值±SE。所有年龄组中n＝5。*P<0.05相对于2个月，相对于11个月。
图5.来自2、11和20个月龄费歇尔大鼠中肾皮质和髓质CNP的免疫组化定位在20x物镜放大下的代表性图像。
图6.2、11和20个月龄费歇尔大鼠之间血浆CNP(A)、尿液CNP排泄(B)、尿液与血浆CNP的比率(C)和蛋白尿(D)的变化。数值为平均值±SE。所有年龄组中n＝10。*P<0.05相对于2个月，相对于11个月。
图7.尿液CNP排泄与肾皮质(A)和髓质(B)纤维化、以及尿液与血浆CNP的比率与肾皮质(C)和髓质(D)纤维化之间的关联。
图8为CNP分子形式的示意图。
图9为CNP分子形式的氨基酸序列表。
图10.来自年轻人类供体(A-C)和年长人类供体(D-F)的肾组织内CNP免疫组化定位在20x物镜放大下的图像。阴性对照(G)。
图11.肾小球基底膜(GBM)厚度与尿液CNP排泄之间(A)以及GBM厚度与尿液与血浆CNP的比率之间(B)的关联。
图12.ADHF患者(HHF)对比对照组中尿液KIM-1排泄。带有24小时KIM-1排泄数值的中位数和四分位差(IQR；盒)以及1.5*IQR(误差线)的异常值盒状图。
图13A-C。NT-CNP-53排泄和临床结果之间的关联：(A)死亡率，(B)首次非选择性(所有原因)再入院治疗的时间/死亡，(C)首次非选择性心血管再入院治疗的时间/死亡。带有24小时NT-CNP-53排泄数值的中位数和四分位差(IQR；盒)以及1.5*IQR(误差线)的异常值盒状图(转化成自然对数数据)。
图14A-C。ADHF中主要结果(死亡率)形成的CNP分子的尿液排泄。显示ADHF中24小时尿液的(A)CNP22、(B)CNP53和(C)NT-CNP53排泄数值的中位数和四分位差(IQR；盒)以及1.5*IQR(误差线)相对于死亡率的异常值盒状图。
图15A-B。普通人群中根据血浆CNP-22水平四分位数的死亡(A)和心肌梗塞(MI；B)的卡普兰-迈耶曲线。CNP-22Q1为2.0至10.1pg/mL；CNP-22Q2为10.2至13.1pg/mL；CNP-22Q3为13.2至16.7pg/mL；且CNP-22Q4为16.8至265.0pg/mL。
发明详述
本发明提供了涉及评价肾结构改变(如肾纤维化)的方法和材料。例如，本发明提供了使用尿液CNP水平(例如尿液与血浆CNP的比率)和/或血浆CNP水平以确定哺乳动物是否肾结构改变或有可能发生肾结构改变的方法和材料。如本文所述，存在尿液CNP水平升高、血浆CNP水平降低和/或尿液与血浆CNP的比率升高表明哺乳动物肾结构改变或有可能发生肾结构改变。肾结构改变的示例包括但不限于肾纤维化、肾小球基底膜增厚、系膜基质膨胀、足细胞肿胀和足突消失。本文所提供的方法和材料可用于评价任何适当哺乳动物中的肾结构改变，所述哺乳动物包括但不限于人类、猴、马、奶牛、绵羊、山羊、小鼠和大鼠。
人类CNP的六种分子形式的氨基酸序列列于图8和9。
本文中相对于血浆或尿液CNP水平(或CNP的一种特定分子形式，如CNP-53)所用术语“升高的水平”表示高于没有肾疾病的健康哺乳动物的年龄匹配随机群体(如含有10、20、30、40、50、100或500个健康哺乳动物的年龄匹配随机群体)中血浆或尿液水平中位数的任意水平。在一些情况下，血浆CNP(如血浆CNP-22)升高的水平可以是高于16pg/mL的任意水平。在一些情况下，尿液CNP(如尿液CNP-22)升高的水平可以是高于12,000pg/天的任意水平。
本文中相对于尿液CNP与血浆CNP的比率所用术语“升高”表示高于没有肾疾病的健康哺乳动物的年龄匹配随机群体(如含有10、20、30、40、50、100或500个健康哺乳动物的年龄匹配随机群体)中尿液CNP与血浆CNP的比率平均值的任意比率水平。在一些情况下，升高的尿液CNP与血浆CNP的比率可以是高于12,000pg/天的尿液CNP比16pg/mL血浆CNP的一个比率。在一些情况下，可使用血浆CNP与尿液CNP的比率替代尿液CNP与血浆CNP的比率。
在一些情况下，血浆CNP水平降低可表明哺乳动物肾结构改变或有会发生肾结构改变或可能发生不良结果。本文中相对于血浆CNP水平所用术语“降低的水平”表示低于没有肾疾病的健康哺乳动物的年龄匹配随机群体(如含有10、20、30、40、50、100或500个健康哺乳动物的年龄匹配随机群体)中血浆CNP水平中位数的任意水平。在一些情况下，降低的血浆CNP水平可以是低于10pg/mL的任意水平。
在一些情况下，存在血浆CNP水平降低、尿液CNP水平升高和血浆NT-proBNP水平升高可表明哺乳动物肾结构改变或可能发生肾结构改变或可能发生不良结果。本文中相对于血浆NT-proBNP水平所用术语“升高的水平”表示高于没有肾疾病的健康哺乳动物的年龄匹配随机群体(如含有10、20、30、40、50、100或500个健康哺乳动物的年龄匹配随机群体)中血浆水平中位数的任意水平。在一些情况下，血浆NT-proBNP升高的水平可以是高于450pg/mL的任意水平。
可使用任意适当方法以确定尿液CNP水平、血浆CNP水平、尿液CNP与血浆CNP的比率、血浆NT-proBNP水平或血浆CNP与尿液CNP的比率。例如，可使用多肽检测法(如免疫试验(如ELISA或放射免疫试验))和质谱确定血浆或尿液样品中的CNP水平。在一些情况下，可使用放射免疫试验确定尿液CNP与血浆CNP的比率。
本发明还提供了涉及评价结果的方法和材料。例如，本发明提供了使用尿液CNP或其六种可能的分子形式(如CNP-53或NT-CNP-53)的水平以确定哺乳动物是否可能发生不良结果的方法和材料。如本文所述，存在尿液CNP水平升高表明哺乳动物可能发生不良结果。不良结果的示例包括但不限于死亡、住院、心力衰竭、心肌梗塞、肾功能恶化、心脏功能恶化和透析。本文所提供的方法和材料可用于评价任何适当哺乳动物中的结果，所述哺乳动物包括但不限于人类、猴、马、奶牛、绵羊和山羊。
在一些情况下，本文中相对于尿液NT-CNP-53水平所用术语“升高的水平”表示高于健康哺乳动物的年龄匹配随机群体(如含有10、20、30、40、50、100或500个健康哺乳动物的年龄匹配随机群体)中尿液NT-CNP-53水平中位数的任意水平，所述健康哺乳动物没有其他共病病史，如心力衰竭、高血压、糖尿病、代谢综合征或慢性肾脏疾病。在一些情况下，升高的尿液NT-CNP-53水平可以是高于36,000pg/天的任意水平。
本发明还提供了帮助医疗或研究专家确定哺乳动物是否肾结构改变或有可能发生肾结构改变的方法和材料以及帮助医疗或研究专业人员确定哺乳动物是否可能发生不良结果的方法和材料。医疗专业人员可以是例如医生、护士、医疗实验室技术人员和药剂师。研究专业人员可以是例如研究负责人、研究技术员、博士后研究员或研究生。可以通过(1)确定尿液CNP水平、血浆CNP水平、尿液CNP与血浆CNP的比率或血浆CNP与尿液CNP的比率，以及(2)将上述水平和比率的信息与专业人员交流的方式帮助专业人员确定哺乳动物是否肾结构改变或有可能发生肾结构改变。可以通过(1)确定尿液CNP水平，以及(2)将上述水平的信息与专业人员交流的方式帮助专业人员确定哺乳动物是否可能发生不良结果。
可使用任何方法与其他人员(如专业人员)交流信息。例如，可以将信息直接或间接地提供给专业人员。此外，可使用任何形式的交流方式以交流信息。例如，可使用邮件、电子邮件、电话和面对面交谈。也可以通过将这些信息电子化的方式将信息传递给专业人员来与专业人员交流信息。例如可以通过将信息置于计算机数据库中以使专业人员能够获得该信息，从而实现与专业人员交流信息。此外，信息可以传递给医院、诊所、或者作为所述专业人员媒介的研究机构。
本发明还提供了治疗肾结构改变或有可能发生肾结构改变的哺乳动物的方法和材料。例如，可以评价哺乳动物以确定哺乳动物的尿液CNP与血浆CNP的比率是否升高。如本文所述，尿液CNP与血浆CNP的比率升高的哺乳动物可能肾结构改变或有可能发生肾结构改变。一旦哺乳动物被鉴定为尿液CNP与血浆CNP的比率升高，可监测该哺乳动物以确定是否存在肾结构改变的一项或多项风险因素。例如，可监测或评价该哺乳动物以确定是否存在年龄因素、高血压、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、男性性别、体重指数升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和/或糖尿病。一旦鉴定存在尿液CNP与血浆CNP的比率升高和一项或多项风险因素的哺乳动物，可使用一种或多种治疗剂治疗该哺乳动物，所述治疗剂被设计用于缓解或抵消肾结构改变的症状。例如，可使用ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂(ARB)、醛固酮拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿钠肽治疗尿液CNP与血浆CNP的比率升高和高血压的哺乳动物以缓解肾结构改变的症状。在一些情况下，可指导尿液CNP与血浆CNP的比率升高且带有一项或多项风险因素的哺乳动物使用一种或多种治疗剂进行自我治疗，所述治疗剂被设计用于缓解或抵消肾结构改变的症状。
本发明还提供了治疗可能发生不良结果(如死亡、住院、心力衰竭、心肌梗塞、肾功能恶化、心脏功能恶化和透析)的哺乳动物的方法和材料。例如，可对哺乳动物进行评价以确定哺乳动物的尿液CNP或其六种可能分子形式(如CNP-53或NT-CNP-53)的水平是否升高。如本文所述，尿液CNP或其六种可能分子形式(如CNP-53或NT-CNP-53)的水平升高的哺乳动物可能发生不良结果。一旦哺乳动物被鉴定为尿液CNP或其六种可能分子形式(如CNP-53或NT-CNP-53)的水平升高，则可监测该哺乳动物以确定是否存在不良结果的一项或多项风险因素。例如，可监测或评价该哺乳动物以确定是否存在年龄因素、高血压、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、男性性别、体重指数升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和/或糖尿病。一旦鉴定存在尿液CNP或其六种可能分子形式(如CNP-53或NT-CNP-53)的水平升高和一种或多种风险因素的哺乳动物，可使用一种或多种治疗剂治疗该哺乳动物，所述治疗剂被设计用来降低不良结果发生的可能性。例如，可使用ACE抑制剂、ARB、醛固酮拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿钠肽治疗存在尿液CNP或其六种可能分子形式(如CNP-53或NT-CNP-53)的水平升高和高血压的哺乳动物以降低不良结果发生的可能性。在一些情况下，可指导尿液CNP或其六种可能分子形式(如CNP-53或NT-CNP-53)的水平升高且有一项或多项风险因素的哺乳动物使用一种或多种治疗剂进行自我治疗，所述治疗剂被设计用来降低不良结果发生的可能性。
本发明还提供了治疗哺乳动物的方法和材料。例如，可以评价哺乳动物以确定哺乳动物的血浆CNP-22水平是否升高。如本文所述，血浆CNP-22水平升高的哺乳动物遭受死亡或心肌梗塞的风险上升。一旦哺乳动物被鉴定为血浆CNP-22水平升高，可监测该哺乳动物以确定是否存在死亡或心肌梗塞的一项或多项风险因素。例如，可监测或评价该哺乳动物以确定是否存在年龄因素、高血压、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、男性性别、体重指数升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和/或糖尿病。一旦鉴定到血浆CNP-22水平升高且有一项或多项风险因素的哺乳动物，可使用一种或多种治疗剂治疗该哺乳动物，所述治疗剂被设计用来降低哺乳动物遭受死亡或心肌梗塞的风险。例如，可使用ACE抑制剂、ARB、醛固酮拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿钠肽治疗血浆CNP-22水平升高且胆固醇水平升高的哺乳动物以降低该哺乳动物遭受死亡或心肌梗塞的风险。在一些情况下，可指导血浆CNP-22水平升高且有一项或多项风险因素的哺乳动物使用一种或多种治疗剂进行自我治疗，所述治疗剂被设计用来降低哺乳动物遭受死亡或心肌梗塞的风险。
以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例并不限制权利要求书所述的本发明的范围。
实施例
实施例1–使用尿液CNP排泄作为衰老期间肾纤维化的生物标记
动物
研究在2、11和20个月龄雄性费歇尔大鼠中进行(哈伦实验室公司(HarlanLaboratories，Inc.)，威斯康星州麦迪逊，每个年龄组n＝8-10，另有说明者除外)。实验性研究按照动物福利法和梅约临床机构动物管理和使用委员会(Mayo ClinicInstitutional Animal Care and Use Committee)的批准进行。
人类肾活检组织
人类肾组织获得自捐献肾脏时健康生活的肾供体的细针抽吸活检样本，如他处所述(Rule等，Ann.Intern.Med.，152:561-567(2010))。本研究中检测了总共六份石蜡包埋肾活检样本。年轻组由三名平均年龄为19岁(年龄范围18至20岁)的女性供体组成，年老组由三名71岁的女性供体组成。
24小时尿液收集
大鼠置于代谢笼中，能够自由进食和饮水并用24小时时间使之适应环境。适应期后，随即用24小时收集尿液用于蛋白尿和CNP评价。使用邻苯三酚红染色结合试验测量24小时尿液样品中的尿蛋白排泄。
急性血压研究、肾小球过滤速率和血浆收集
麻醉大鼠(氧气中1.5％异氟烷)，将PE-50管置于颈动脉以使用CardioSOFT Pro软件(Sonometrics公司，安大略省伦敦)采集血压(BP)并取血样。将插管插入膀胱进行尿液收集。将PE-50管插入颈静脉并持续注入含2％菊粉的生理盐水(西格玛公司(Sigma)，密苏里州圣路易斯)。60分钟平衡后，进行廓清研究。廓清研究持续60分钟，在廓清研究结束时同血样一起收集尿液以计算菊粉廓清中的GFR并用于测量血浆CNP。从颈动脉中收集血液并置于冰上的EDTA管中(Stingo等，Am.J.Phys.，263:H1318-1321(1992))。立即将血液在4℃下2,500rpm离心10分钟，血浆储存于聚苯乙烯管，在-80oC保存以备后续使用。使用用于GFR分析的蒽酮法测量菊粉浓度，如他处所述(Davidson和Sackner，J.Lab.Clin.Med.，62:351-356(1963))。
大鼠肾组织
急性研究后，完整移除大鼠肾脏，随后将其分成几部分。将肾组织的横截面保存于10％福尔马林中用于纤维化和CNP的组织学分析，较小的方形部分保存于2.5％戊二醛中用于电子显微镜(EM)分析。
纤维化的组织学分析
将固定后的大鼠肾组织(n＝7)脱水并包埋于石蜡中，切成厚度为4μm的切片。使用天狼猩红对纤维化的胶原蛋白和延伸进行染色。使用Axioplan II KS400显微镜(卡尔蔡司公司(Carl Zeiss，Inc)，德国)在每张切片中捕捉至少4张随机选择的图像，使用20x物镜并使用KS400软件确定纤维化区域占组织总面积的百分比。
电子显微镜分析
将2.5％戊二醛中固定的大鼠肾组织脱水并包埋于树脂模具中。根据EM核心设备程序切割超薄切片。使用JEM-1400透射电子显微镜在5000x和8000x放大下对肾小球进行成像。
肾小球基底膜厚度测量
在每个年龄组(n＝5)的大鼠中使用5000x放大捕捉肾小球EM图像。使用应用数字显微照片(Digital Micrograph)(Gatan公司，加利福尼亚州普莱森顿)测量GBM的厚度。对于每只大鼠，由一名有经验的EM技术员测量20次并使用Excel形态测量宏处理数据，给出以纳米(nm)为单位的平均厚度。
血浆和尿液CNP
使用来自于菲尼克斯制药有限公司(Phoenix Pharmaceutical)(加利福尼亚州芒廷维尤)的市售非平衡放射免疫试验试剂盒和与大鼠CNP-22具有完全交叉反应性的抗-人CNP-22抗体确定血浆和尿液CNP-22的方法如他处所述(Stingo等，Am.J.Phys.，263:H1318-1321(1992))。使用C-18Bond Elut固相萃取筒提取一毫升血浆。使用4mL100％甲醇和4mL水清洗筒后，加入血浆并清洗筒。在Savant快速真空浓缩器中浓缩洗脱液，并用300μL试验缓冲液重悬沉淀。将100μL标准品和样品与100μL抗-人CNP抗体在4℃下孵育。18小时后，加入100μL(10,000计数)I125标记的CNP并在4℃下孵育18小时。随后，在所有样品中加入二抗以使游离和结合的部分分离，并对样品进行离心。吸出游离的部分并在γ计数器上对结合的部分进行计数。生成并使用标准曲线以计算未知样品的浓度，其报告单位为pg/mL。标准曲线的范围为0.5至128pg，检测的下限为0.5pg。试验间和试验内差异分别为11％和5.2％。回收率为72±6％。与ANP、BNP、内皮素和肾上腺髓质素的交叉反应性<1％，与CNP-53的交叉反应性为97％。
CNP免疫组化
评价是否存在肾脏CNP免疫组化的方法如他处所述(Stingo等，Am.J.Phys.，263:H1318-1321(1992))。简单地说，将石蜡包埋的肾组织切片在60℃加热炉中孵育2小时，随后使用已有的实验室方法进行脱石蜡。脱石蜡后，用甲醇中0.6％过氧化氢室温下孵育切片20分钟以限制内源性过氧化氢酶活性，随后在加入一抗前使用5％正常山羊血清封闭非特异性蛋白结合位点。将切片置于保湿室，以1:500的稀释比例加入一抗(兔抗人CNP-22，菲尼克斯制药有限公司(Phoenix Pharmaceutical)，加利福尼亚州芒廷维尤)，室温反应18–24小时。使用正常兔血清处理对照切片。将切片与共价连接了辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG以及过氧化物酶的底物3-氨基-9-乙基-咔唑孵育，并使用苏木精反染以强化核的细节。随后由一名不知道年龄分组的肾脏病理学家观察并解释染色的切片。
统计学分析
结果表示为平均值±SE。使用ANOVA及随后的Newman-Keuls多重比较检验进行组内比较。进行皮尔森相关以计算尿液CNP排泄和肾纤维化以及GFR之间和尿液与血浆CNP的比率和肾纤维化之间的关联。上述计算使用GraphPad Prism软件(图形软件有限公司(GraphPad Software)，加利福尼亚州拉由拉市)。统计的显著性接受为P<0.05。
结果
与年龄相关的人体测量、肾脏特征和血液动力学确定了体重(BW)、肾脏总重量(TKW)、血浆肌酸酐、GFR以及平均动脉压(MAP)水平(表1)。相比于2个月的组，11个月时BW和TKW有显著增加，在20个月时持续。当使用BW对TKW进行标准化时，TKW:BW比率在11和20个月时出现显著下降。此外，相比于2个月，11和20个月时血浆肌酸酐水平显著上升，11个月时GFR存在下降的趋势，在20个月时持续。MAP仅在20个月时出现显著上升。
表1.老化费歇尔大鼠中体重、肾脏特征和血压汇总。
BW＝体重；TKW＝肾脏总重量；Cr＝血浆肌酸酐；GFR＝肾小球过滤速率；MAP＝平均动脉压。数值为平均值±SE。所有年龄组中n＝10。*P<0.05相对于2个月，相对于11个月。
肾纤维化和肾小球超结构
获得了使用天狼猩红对肾皮质(图1A)和髓质(图2A)进行染色的代表性显微照片。这些显微照片提供了对纤维胶原沉积的估计。具体而言，随着年龄的增长，皮质(图1B)和髓质(图2B)间隙的胶原染色出现明显且逐步的增长。此外，还获得了肾小球的代表性电子显微照片(图3)。在2个月时(图3A)，内脏表皮细胞的足突是完整的。11个月时(图3B)，系膜区域与基质一起温和膨胀，且相比于2个月时毛细血管袢基膜呈现温和增厚。20个月时(图3C)，系膜基质出现弥漫性膨胀。相比于2和11个月时，毛细血管袢基膜增厚且内脏表皮细胞的足突出现集中性消失。对GBM的厚度进行了形态测量分析(图4)。随着年龄的增长，毛细血管袢基膜逐步且明显地增厚，20个月时基膜的厚度几乎达到了2个月时基膜厚度的3倍。
肾CNP的免疫组化定位
评估了2、11和20个月龄的费歇尔大鼠中肾皮质(左图)和髓质(右图)内CNP的免疫组化定位(图5)。2个月时，近端肾管没有明显染色，CNP的免疫染色位于肾皮质的远端肾管中。在11个月时，肾皮质中CNP的免疫染色主要位于远端肾管，近端肾管中只有微弱染色。在20个月时，可在肾皮质的远端肾管内和近端肾管的集中观察到强烈的CNP免疫染色。在肾髓质的远端肾管中也可观察到强烈的CNP免疫染色，且不随年龄出现显著变化。
此外，图10显示了在来自健康人类肾脏供体的年轻(A-C)和年老(D-F)活检样本中CNP的免疫组化定位。在从年轻肾脏供体获得的活检样本中，CNP染色主要位于远端肾管，在近端肾管中可观察到相对较弱且集中的染色。在从年老肾脏供体(D-F)获得的活检样本中，在远端和近端肾管中均可观察到强烈的CNP染色。
尿液和血浆CNP、尿液与血浆CNP的比率和蛋白尿
评估了随年龄增长血浆和尿液CNP的变化(图6)。在三个年龄组间观察到血浆CNP明显且逐步的降低(2个月平均值±SE：29±3pg/mL；11个月平均值±SE：20±1*pg/mL；20个月平均值±SE：*P<0.05相对于2个月，相对于11个月)(图6A)。相反地，11个月时尿液CNP排泄出现显著增长，在20个月时保持上升(2个月平均值±SE：64±4pg/天；11个月平均值±SE：110±6*pg/天；20个月平均值±SE：103±7*pg/天；*P<0.05相对于2个月)(图6B)。此外，尿液与血浆CNP的比率也出现了明显且逐步的增加(图6C：2个月平均值±SE：2.2±0.2pg/天/pg/mL；11个月平均值±SE：5.4±0.3*pg/天/pg/mL；20个月平均值±SE： *P<0.05相对于2个月，相对于11个月)。仅在20个月时观察到蛋白尿的显著升高(图6D)。
尿液CNP排泄和尿液血浆CNP的比率之间的关联
CNP和肾皮质纤维化之间(图7A；n＝21，r＝0.54，P＝0.01)以及CNP和肾髓质纤维化之间(图7B；n＝21，r＝0.65，P＝0.001)存在正相关关系。此外，尿液与血浆CNP的比率和肾皮质纤维化(图7C；n＝21，r＝0.83，P＝0.0001)之间之间，以及尿液与血浆CNP的比率和肾髓质纤维化(图7D；n＝21，r＝0.77，P＝0.0001)之间存在强烈的正相关关系。尿液CNP和GFR之间不存在关联(n＝30，r＝0.01，P＝0.97)。图11显示了GBM厚度、尿液CNP(图11A；n＝15，r＝0.77，P＝0.0008)和尿液与血浆CNP的比率(图11B；n＝15，r＝0.95，P＝0.0001)之间强烈的正相关关系。
本文所提供的结果证明衰老期间尿液CNP排泄增加，且尿液CNP排泄的增加与肾纤维化及GBM增厚强烈相关，后者的出现早于明显的蛋白尿或BP升高。随着肾脏老化可观察到尿液CNP排泄的增加，并与尿液与血浆CNP的比率显著增加和循环CNP及肾功能的下降同时出现。这些结果证明尿液CNP及其与血浆CNP的比率是衰老期间临床迹象出现前所发生的早期肾结构改变的生物标记。
实施例2–CNP是一种在住院急性失代偿性心力衰竭(ADHF)中有预后价值且独立于 肾小球过滤速率和NT-proBNP的尿液生物标记
患者群体
共研究了60名ADHF(急性失代偿性心力衰竭)患者，对照组包括20名健康对象。ADHF患者接受预期鉴定并通过连续入院的登记簿招募。对于新发生或已建立的慢性HF，准入标准均为与弗雷明汉标准一致的收缩HF临床诊断(McKee等，N.Engl.J.Med.，285:1441-6(1971))，通过超声心动描记术中左心室射血分数(LVEF)的降低(<50％)加以确认。为使研究群体反映正常临床实践的异质性，对于适当的尿液生物标记而言，单一的排除标准是不完整或不正确的尿液收集。基于此排除了两名ADHF患者，在ADHF组中总共剩下58名同意的连续患者。对所有患者进行基线历史评价、身体检查和经胸壁超声心动图，作为部分常规临床护理。在入院后72小时内取得用于CNP和NT-proBNP测量的血浆样品并进行24小时尿液收集。在冰上将尿液样品收集于醋酸中(30mL1:1醋酸；17.4M)。在定时的尿液收集(平均值22.9±4小时)结束时，记录总量并将样品分至各个容器，冻存于-80℃至分析。对于初级分析，GFR被定义为24小时肌酸酐清除。重复验证结果以与肾病膳食改良(MDRD)中估计的GFR一致。
对照对象从健康志愿者群体中招募。所有人都是不吸烟者且没有心血管或系统疾病病史。招募后即对用于CNP和NT-proBNP测量的血浆样品进行取样并进行24小时尿液收集。
尿液生物标记测定
NGAL和KIM-1
根据生产商的说明书( ELISA，R&D系统公司(R&D Systems))，通过酶连免疫试验测量尿液中NGAL和KIM-1的浓度。NGAL的最低可检测剂量为0.012ng/mL，而KIM-1的最低可检测剂量为0.009ng/mL。两个试验的试验内和试验间变异系数分别为<5％和<8％。NGAL被认为能与MMP9形成复合物；重组人类MMP-9/NGAL复合物在所用试验中表现出0.3％的交叉反应性。在KIM试验中没有明显的交叉反应性或干扰。
CNP-22(AA82-103)
可使用来自菲尼克斯制药有限公司(Phoenix Pharmaceutical)(加利福尼亚州芒廷维尤)的市售非平衡放射免疫试验试剂盒以及能够检测人类CNP-22的抗体确定尿液CNP-22，如他处所述(Sangaralingham等，Am.J.Physiol.Renal Physiol.，301:F943-52(2011))。标准曲线的范围为0.5-128pg，检测的下限为0.5pg。试验间和试验内差异分别为11％和5％。回收率为85％。与ANP、BNP、内皮素和NT-CNP53的交叉反应性为0％，与CNP-53的交叉反应性为59％。
CNP-53(AA51-103)和NT-CNP53(AA51-81)
与CNP-22相似，可使用来自于菲尼克斯制药有限公司(Phoenix Pharmaceutical)(加利福尼亚州芒廷维尤)的市售非平衡放射免疫试验试剂盒以及能够检测人类CNP-53和仅当CNP-53与环结构分离时其氨基端起始的前29个氨基酸(NT-CNP-53)的抗体确定尿液CNP-53和NT-CNP-53。生成并使用标准曲线以计算未知样品的浓度，其报告单位为pg/mL。对于CNP-53，标准曲线的范围为0.5-128pg。试验间和试验内差异分别为8％和7％。回收率为81±4％。与CNP-22的交叉反应性为100％，与NT-CNP-53、ANP和BNP的交叉反应性为0％。对于NT-CNP-53，标准曲线的范围为0.5-128pg。试验间和试验内差异分别为10％和6％。回收率为82±5.2％。与ANP、BNP、CNP-22、CNP-53和内皮素的交叉反应性为0％。
尿液生物标记排泄
可通过尿液总体积(mL)和尿液收集时间(小时)确定平均尿流(mL/小时)。以尿液生物标记浓度(pg/mL或ng/mL)和尿流速率(mL/小时)的结果计算尿液生物标记排泄，并在对尿液肌酸酐排泄(ng/gCr)进行调节后报道。
血浆生物标记试验
将血液置于EDTA管中并冷冻，直至4℃、2500rpm离心10分钟。将血浆分装为1mL并冻存于-20℃直至测试。使用与尿液相同的非平衡RIA(菲尼克斯制药公司(PhoenixPharmaceuticals)，加利福尼亚州贝尔蒙特)以及抗-人CNP抗体确定CNP分子形式的血浆浓度。使用电化学发光免疫试验测量血浆NT-proBNP，如先前他处所述(Costello-Boerrigter等，J.Am.College Cardiol.，47:345-53(2006))。NT-proBNP检测的下限为5pg/mL；试验间和试验内差异分别为3.1％和2.5％。与CNP形式不存在交叉反应性。
统计分析
所有尿液生物标记均表现为非高斯分布；因此数值表示为中位数±四分位差。对于ADHF和对照对象之间的比较，使用了非参数威尔科克森(Wilcoxon)秩和检验。使用斯皮尔曼(Spearman's)秩相关确定连续变量之间的关系。在Cox回归分析前使用自然对数转化标准化生物标记排泄数据以检测以下独立预测因子：(i)死亡率，以及(ii)到首次非选择性所有原因再入院治疗/死亡的时间。通过包括当地初级护理数据的机构记录确定死亡率和再入院治疗。否则在末次已知随访时审查患者。使用c-统计以比较生物标记的分辨力(Harrell等，Statistics in medicine，15:361-87(1996))。c-统计与二元端点(binaryendpoint)的曲线下面积相似，并可将其解释为使用Cox模型的风险评分正确排序的事件时间的可能性。使用计算标准误差中的近似重叠法计算c-统计的置信区间。此外，利用综合鉴别指数(IDI)(Pencina等，Statistics in medicine，27:157-72(2008)；讨论部分207-12)，使用CNP和血浆NT-proBNP的组合代替单独使用NT-proBNP评价用于ADHF中的不良后果(死亡率和重新入院/死亡)预测精确度方面的提升。概率值为双侧的；p<0.05被认为具有显著性。使用JMP软件版本9.0(SAS研究院有限公司(SAS Institute，Inc)，北卡罗来纳州卡雷)和SAS版本9.2(SAS研究院有限公司(SAS Institute，Inc)，北卡罗来纳州卡雷)分析数据。
结果
表2显示了研究群体的基线临床和生化特性。确认为ADHF的患者的年龄大于对照组(70.1±10.3对比53.5±6.1岁，p<0.0001)，23名(40％)为女性；且平均左心室射血分数(LVEF)为38.4±18.9％。22名(38％)ADHF患者的主要症状为单独的呼吸困难；4名(7％)患者为单独的水肿；而24名(41％)患者为呼吸困难和外周性水肿。剩余的一些患者在心率失常相关的症状下出现为乏力或ADHF。55％的患者存在NYHA III类。相比于对照组，ADHF患者中血浆NT-proBNP显著升高同时GFR下降(p<0.0001)(表2)。观察到ADHF患者中的尿液肌酸酐浓度低于对照组(表3)，可能与临床ADHF管理期间的鼓舞或利尿疗法的升级相关。
表2.基线特征。
*数值表示为平均值(SD)
μ值表示为中位数(第25–75百分位)。
CVA，脑血管意外；CRT，心脏再同步治疗；LVEF，左心室射血分数；GFR，肾小球过滤速率；NT-proBNP，脑利尿钠肽前体N端；CNP-22，C型利尿钠肽-22；CNP-53，C型利尿钠肽-53；NT-CNP-53，C型利尿钠肽-53N端片段。
急性失代偿性心力衰竭和尿液生物标记排泄
所有尿液生物标记的排泄速率均表现为非高斯分布。ADHF中KIM-1和所有三种CNP分子形式的排泄的中位数显著高于对照组，尿总蛋白/肌酸酐比率也是如此(表3和图12)。尿液NGAL排泄没有变化(p＝NS)。对ADHF患者的尿液生物标记排泄与临床特性之间的关系进行了研究。KIM-1表现出与GFR之间较弱且不明显的关系(Spearman’sρ-0.19；p＝0.098)，但任意尿液生物标记和出现的NYHA类(III或IV)之间不存在明显的关系，也没有明显的与LVEF(无收缩剂)相关的趋势(两者中p＝NS)。
表4显示了尿液CNP的排泄速率与其他测量的HF生物标记之间的单变相关系数。三种尿液CNP分子形式之间均观察到中度关联，但只有尿液CNP-22与其在血浆中的浓度有关联，尽管只是中度关联(ρ0.28，p＝0.04)。尿液CNP-22和CNP-53与血浆NT-proBNP弱相关(分别为ρ0.45，p＝0.0003；ρ0.33，p＝0.01)；尿液NT-CNP-53没有相关性。尿液CNP-22(ρ0.68,p＝0.0001)和尿液KIM-1(ρ0.78,p<0.0001)与尿液总蛋白/肌酸酐比率显著相关，而以下的其他尿液生物标记并不明显：CNP-53、NT-CNP-53或NGAL。
在ADHF患者中，入院时药物包括血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素受体阻断剂(66％)、β阻断剂(76％)、髓袢利尿药(84％)和醛固酮拮抗剂(21％)。探索性分析中，在使用髓袢利尿药的ADHF患者中，在使用ACEI或ARB的情况下尿液NGAL高于(中位数±IQR：443±1924相对于177±227ng/gCr；p＝0.003)，且尿液NT-CNP-53低于(34.0±43.7相对于60.4±202.0；p＝0.01)那些不使用者。当前组中未观察到使用这些药剂与尿液CNP-22、CNP-53、或KIM-1水平之间的其他显著关联。
表3.尿液生物标记排泄。
*数值表示为平均值(SD)
§值表示为中位数(第25–75百分位)。
KIM-1，肾损伤分子1；NGAL，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白；CNP-22，C型利尿钠肽-22；CNP-53，C型利尿钠肽-53；NT-CNP-53，C型利尿钠肽-53N端片段。
表4.相关性分析：ADHF患者中CNP分子形式和疾病严重性或预后的其他潜在重要生物标记之间的斯皮尔曼ρ(rho)秩相关系数。
GFR，肾小球过滤效率；KIM-1，肾损伤分子1；NGAL，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白；CNP-22，C型利尿钠肽-22；CNP-53，C型利尿钠肽-53；NT-CNP-53，C型利尿钠肽-53N端片段；NT-proBNP，脑利尿钠肽前体N端。
C型利尿钠肽的血浆浓度
表2显示了CNP分子形式和NT-proBNP的血浆浓度。相比于对照组，ADHF组中血浆CNP-22和CNP-53水平升高，而血浆NT-CNP-53水平没有改变。血浆CNP-22与其同时的尿液排泄限制性相关(ρ0.28,p＝0.04)，并与尿液CNP-53(ρ0.24,p＝0.07)和NT-CNP-53(ρ0.26,p＝0.05)排泄之间存在微弱的正相关关系(表4)。相反地，血浆CNP-53和血浆NT-CNP-53与任何CNP分子形式的尿液排泄之间均不存在任何关系。
临床结果
58名被研究的ADHF患者中，在后续随访的平均(SD)时间为1.5(0.9)年中有18人死亡(总ADHF死亡率为31％)。另外有18名ADHF患者再入院治疗(所有原因再入院治疗/死亡率为62％)，其中13名患者再入院治疗时主要存在心血管病因。对两名患者进行选择性心脏再同步治疗；最终分析的事件中并不包括这些。
死亡的ADHF患者的年龄大于对照组(74.8±9.2相对于67.9±10.2岁，p＝0.02)但两组的性别、NYHA类型和LVEF类似。同样，随访期间出现所有原因再入院治疗/死亡的次要结果的ADHF患者与没有这些基线特征相关事件的ADHF患者之间没有差异。该组中有或没有不良结果的ADHF患者之间的血浆NT-proBNP或GFR水平均没有显著性差异。所评估的尿液生物标记中，相比与幸存者，死亡的ADHF患者中所有三种CNP形式的水平均有升高(图13A-C和14A-C)。尿液KIM-1和NGAL排泄没有变化(两者p＝NS)。死亡的ADHF患者的血浆CNP-22水平高于幸存者(15.8±18.8相对于10.5±8.3pg/mL；p＝0.02)，但血浆CNP-53和NT-CNP-53没有显著差异。对于出现次要结果的患者，尿液CNP-22和NT-CNP-53排泄表现出升高的趋势(CNP-22中位数：15.3相对于9.3ng/gCr，p＝0.07；NT-CNP-53：37.4相对于32.6ng/gCr，p＝0.06)，血浆CNP-22也是如此(13.8±16.3相对于10.5±7.7；p＝0.06)。其他尿液生物标记和血浆CNP形式没有变化。
Cox回归分析(表5)表明，在所有评估的尿液和血浆生物标记中，只有尿液NT-CNP-53排泄能够显著地预测死亡率(单变量HR1.67，95％CI1.14-2.37，p＝0.01)和所有原因再入院治疗/死亡(单变量HR1.78，95％CI1.30-2.39，p＝0.0004)。此外，在对年龄、尿液蛋白质/肌酸酐比率和血浆NT-proBNP调整后其关联仍持续存在(表5)。在所有原因死亡率发生的c-统计(c-指数)分析中，尿液NT-CNP-53的c-统计(0.66；95％CI0.53-0.78)与NT-proBNP的(0.57,95％CI0.43-0.71)相当，且生物标记的组合(尿液NT-CNP-53和血浆NT-proBNP)提供了递增效应的证据，组合c-统计为0.69(95％CI0.56-0.82)。综合鉴别指数的检测为尿液NT-CNP-53和血浆NT-proBNP组合显著提升该组中不良结果的预测提供了进一步证据(表6)。本研究中其他尿液或血浆生物标记均未表现出显著的预测价值。
表5.ADHF患者中尿液NT-CNP-53排泄和血浆NT-proBNP对于临床结果的预测价值。单变量和调整后Cox比例风险分析。
*Ln转换数据(风险比率以1个对数单位为单位增加)
模型1：根据年龄调整
模型2：根据年龄和尿液蛋白质/肌酸酐比率调整
模型3：根据年龄、尿液蛋白质/肌酸酐比率和血浆NT-proBNP调整CV，心血管；NT-CNP-53，C型利尿钠肽-53N端片段；NT-proBNP，B型利尿钠肽前体N端；NS，无显著性(即p>0.05)。
表6.预测精确度的测量
血浆NT-proBNP
尿液NT-CNP-53
*相比于单独的NT-proBNP
NT-proBNP，B型利尿钠肽前体N端；NT-CNP-53，C型利尿钠肽-53N端片段；SE，标准误差。
这些结果证明升高的KIM-1排泄水平似乎能够区分失代偿性心力衰竭患者和健康的对照患者，但与心力衰竭结果不相关。相反地，升高的尿液NT-CNP-53排泄水平与异质性入院治疗心力衰竭群体(如ADHF患者)中的不良结果之间显著相关，独立于GFR。NT-CNP-53是唯一有预测价值的尿液生物标记。
实施例3–血浆CNP-22是一种能够预测普通人群中死亡和心肌梗塞的内皮细胞生 物标记
以下实施例用于确定血浆CNP-22是否是一种来源于内皮细胞的、能够预测普通人群中未来死亡率和心肌梗塞(MI)的生物标记。评估了1,841名对象(平均年龄62±11岁，48％为男性)的血浆CNP-22，这些对象随机选自美国明尼苏达州奥姆斯特德县(OlmstedCounty)的普通社区。对死亡率和MI的随访时间中位数为12年。在12年的随访期间内，升高的血浆CNP-22水平(CNP-22>16pg/mL)与死亡率(未调整HR1.41，95％CI1.12-1.79；P＝0.004)和MI(未调整HR1.60，95％CI1.19-2.16；P＝0.002)显著相关(表7)。在根据传统风险因素(如年龄、性别、体重指数(BMI)、胆固醇、血清肌酸酐、吸烟、以及糖尿病和高血压的发生)进行调整后，升高的血浆CNP-22水平仍与死亡率(调整后HR1.34，95％CI1.02-1.75；P＝0.04)和MI(调整后HR1.59，95％CI1.13-2.25；P＝0.008)显著相关(表7)。
表7.升高的血浆CNP-22水平预测死亡率和心血管疾病(所有组；n＝1841)。
模型3：年龄、性别、BMI、总胆固醇、血清肌酸酐、吸烟，发生糖尿病、高血压、冠状动脉疾病
图15A和15B分别显示了根据血浆CNP-22四分位数的死亡和MI。未调整的死亡和MI事件发生率随着分别显示了根据血浆CNP-22四分位数的升高显著提高，其中CNP-22Q1＝2.0至10.1pg/mL；CNP-22Q2＝10.2至13.1pg/mL；CNP-22Q3＝13.2至16.7pg/mL；且CNP-22Q4＝16.8至265.0pg/mL。
这些结果证明升高的血浆CNP-22水平是一种能够预测普通人群中未来心脏相关死亡和MI的内皮细胞生物标记。这些结果还证明可对血浆CNP-22水平升高者使用早期MI检测策略和/或用于MI预防的积极治疗策略。
其他实施方式
应理解虽然本发明已结合其详述进行描述，但以上描述意在说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。

Claims (9)

1.测定哺乳动物血浆CNP-22水平的材料在制备产品中的应用，所述产品用于评估哺乳动物的心肌梗塞风险是否升高的方法中，所述方法包括采用所述产品确定所述哺乳动物的血浆CNP-22水平是否升高，该水平升高表明所述哺乳动物比该水平不升高的同等的哺乳动物早发生心肌梗塞的风险升高，所述水平未升高表明所述哺乳动物会比该水平升高的同等的哺乳动物晚发生心肌梗塞，其中所述哺乳动物是人，所述水平升高至高于14pg/mL。
2.如权利要求1所述的应用，所述水平升高至高于16pg/mL。
3.抗-CNP-22抗体在制备产品中的应用，所述产品用于评估哺乳动物的心肌梗塞风险是否升高的方法中，所述方法包括：
(a)用所述产品进行免疫试验以检测哺乳动物中血浆CNP-22水平是否升高，以及
(b)至少部分基于所述检测结果将所述哺乳动物鉴定为发生心肌梗塞的风险升高，其中，所述哺乳动物是人，所述水平升高至高于14pg/mL。
4.如权利要求3所述的应用，所述水平升高至高于16pg/mL。
5.如权利要求3所述的应用，所述方法包括将所述哺乳动物鉴定为比所述水平未升高的同等哺乳动物早发生心肌梗塞的风险高。
6.测定哺乳动物血浆CNP-22水平的材料在制备产品中的应用，所述产品用于对待心肌梗塞高风险哺乳动物的方法中，所述方法包括：
(a)采用所述产品确定所述哺乳动物的血浆CNP-22水平是否升高，
(b)监测所述哺乳动物中是否存在心肌梗塞的风险因素，以及
(c)指示所述哺乳动物使用治疗剂以降低心肌梗塞的风险，其中，所述哺乳动物是人，所述水平升高至高于14pg/mL。
7.如权利要求6所述的应用，所述水平升高至高于16pg/mL。
8.如权利要求6所述的应用，所述风险因素选自：年龄因素、高血压、血清肌酸酐水平升高、蛋白尿、体重指数升高、胆固醇水平升高、吸烟习惯和糖尿病。
9.如权利要求6所述的应用，所述治疗剂是ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、醛固酮拮抗剂、抑制素、天然利尿钠肽或设计利尿钠肽。
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