JP2019530854A - 複数標的線維症検査 - Google Patents

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Abstract

本発明は、１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、２）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを多重線形回帰において組み合わせて新しい複数標的スコアを得る工程と、３）任意に、工程２）で得られた前記複数標的スコアを肝臓病変ステージまたはグレードの分類においてソートし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの肝臓病変ステージまたはグレードに属するかを判定する工程とを含む、対象における肝臓病変の存在および重症度または死亡または肝臓に関連するイベントのリスクを評価するための非侵襲的方法に関する。本発明は、単一標的診断検査と比較して正確性が向上した独特なスコアおよび独特な分類を提供する単一標的非侵襲的検査の組み合わせによって得られる単一の複数標的非侵襲的検査について記載している。【選択図】図１

Description

本発明は、肝臓学における診断の分野に関し、より詳細には複数標的検査を用いて肝臓病変、好ましくは肝線維症または肝硬変を診断するための非侵襲的方法に関する。本発明は、複数標的検査を用いて肝臓病に罹患している対象における死亡または肝臓に関連するイベントのリスクを評価するための非侵襲的予後判定方法にも関する。
慢性肝疾患は肝線維症などの肝臓病変の発生を特徴とする。肝線維症は損傷した肝細胞を徐々に置き換え、このようにして肝臓の構造を変える瘢痕化プロセスである。線維症の程度は様々であり得、通常はステージで表される。初期と診断された場合、線維症は通常は可逆的である。
歴史的に肝線維症は、生検によって得られた肝臓試料を専門の肝臓病理学者が顕微鏡検査することによって診断される。専門の肝臓病理学者は、確立されている線維症分類に従って線維症のステージを判定する。Ｍｅｔａｖｉｒ分類は最も使用されている線維症分類である。それは肝線維症をＦ０〜Ｆ４の５つのステージに区別し、Ｆ０ステージは「線維症ではない」に対応し、Ｆ４ステージは肝硬変の最終的なステージに対応する。
臨床業務では、ＭｅｔａｖｉｒステージがＦ≧２の患者は臨床的に有意な線維症に罹患しているとみなされる。臨床的に有意な線維症であると診断された場合に通常は治療が推奨されるため、このカットオフは特にＣ型肝炎を有する患者に特に適している。対照的に、ＭｅｔａｖｉｒステージＦ０〜Ｆ１の患者は通常はどんな治療も受けないが、線維症の進行について監視される。ＭｅｔａｖｉｒステージＦ２の患者は有意な線維症に罹患しているとみなされ、ＭｅｔａｖｉｒステージＦ３の患者は深刻な線維症に罹患しているとみなされ、ＭｅｔａｖｉｒステージＦ４の患者は肝硬変に罹患しているとみなされる。
最近では、肝生検に代わる方法を提供するために多くの非侵襲的診断検査が開発されている。肝生検は今でも対象における肝臓病の存在および／または重症度を評価するための至適基準とみなされているが、これは特に試料サイズが小さいことに関連する観察者間または観察者内における再現性の低さおよび試料の偏りの可能性により限界を有する。さらに肝生検は侵襲的医療処置であり、従って合併症のリスクおよび大きなコストを伴うままである。
対照的に、非侵襲的診断検査で必要になるのは実施される対象からの血液試料くらいである。従って、そのような検査は対象における肝線維症の存在および／または重症度を判定することを目的としているため、「血液検査」または「線維症検査」と呼ばれることが多い。第１世代の非侵襲的血液検査では、一般的な間接的バイオマーカーおよび任意に臨床マーカーの測定とこれらのマーカーの比の計算とを行う。そのような単純な血液検査の例としては、ＡＰＲＩ（Ｗａｉら Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００３）およびＦＩＢ−４（Ｓｔｅｒｌｉｎｇら Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００６）が挙げられる。第２世代の非侵襲的血液検査は、独立した直接的および／または間接的バイオマーカーおよび臨床マーカーの統計的組み合わせを含む。Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ（Ｉｍｂｅｒｔ−Ｂｉｓｍｕｔら Ｌａｎｃｅｔ ２００１）、ＥＬＦスコア（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００４）、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（Ｃａｌｅｓら Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００５）、Ｆｉｂｒｏｓｐｅｃｔ（Ｐａｔｅｌら Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００４）およびＨｅｐａｓｃｏｒｅ（Ａｄａｍｓら Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００５）は、これらのより精緻な血液検査の例である。別の種類の非侵襲的検査は、例えばＦｉｂｒｏｓｃａｎとしても知られている振動制御過渡エラストグラフィ（ＶＣＴＥ：Ｖｉｂｒａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）によって肝硬度評価を実施するなどの、肝線維症の診断にとって有用な物理データを収集および解釈することからなる。最後に、血液検査から得られたスコアをロジスティック回帰において物理データと組み合わせて新しいスコアを得ることができる。米国特許出願公開第２０１１０３０６８４９号はそのような組み合わせ、特にＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒとＦｉｂｒｏｓｃａｎとの組み合わせについて記載している。
非侵襲的診断検査は通常、単一標的二項検査であり、０〜１の範囲の連続的な数字である検査結果、すなわち検査スコアが得られる。それらは標的とされる臨床的特徴、すなわち診断標的が存在しない（０）または存在する（１）か否かを評価するように構築されている。従って、大部分の非侵襲的線維症検査は、有意な線維症（Ｍｅｔａｖｉｒ Ｆ≧２）という診断標的と共に構築されており、Ｍｅｔａｖｉｒ Ｆ０／１をＦ２／３／４に対して区別することを目的としている。血液検査結果はＭｅｔａｖｉｒステージの順序尺度とよく相関しているため、いくつかの線維症分類は血液検査結果からの線維症ステージの推定を提供するために開発されている。但し、血液検査は正確な診断標的（通常はＦ≧２）のために較正されるためこの手法には限界があり、従って肝硬変（Ｆ＝４）のようなそれらの診断標的から離れている臨床的特徴を診断するためのそれらの性能はあまり正確ではない。この欠陥を緩和するために、有意な線維症ではなく肝硬変を診断標的にする非侵襲的検査であるＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒが開発された（Ｂｏｕｒｓｉｅｒら Ｅｕｒ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ，２００９）。
臨床業務では、医師は実施する必要のある既存の非侵襲的血液検査のうちのどれか１つを選択しなければならない。実際には、所与の患者のために診断標的Ｆ＝４を用いる検査は診断標的Ｆ≧２を用いる検査よりも信頼できる結果を保証する場合があり、その逆も同様である。患者に関してあまり情報が入手できない場合、前記患者にどの検査を指示すべきかという優先度を知ることは難しいと分かるであろう。
従って、全ての診断標的のために良好な信頼性および正確性で肝硬変（Ｆ＝４）を含む線維症の異なるステージの診断を可能にする、複数の診断標的を扱う単一かつ独特な検査がなお必要とされている。単一かつ独特な検査は実際に、特にどの単一標的検査を実施するかを知るための十分な情報を有し得ない医師にとって最も簡単かつ最も好都合な解決法となる。従って本発明は、高い正確性で臨床的に有意な線維症および肝硬変の両方を診断することができる複数標的診断検査に関する。本発明の別の目的は、対象における死亡または肝臓に関連するイベントのリスクを評価するための複数標的診断検査の使用である。
従って、本発明は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
２）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを多重線形回帰において組み合わせて対象における肝臓病変の存在および重症度を評価するのに有用な新しい複数標的スコアを得る工程と、
３）任意に、工程２）で得られた複数標的スコアを肝臓病変ステージまたはグレードの分類においてソートし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの肝臓病変ステージまたはグレードに属するかを判定する工程と
を含む、対象における肝臓病変の存在および重症度を評価するための非侵襲的方法に関する。
一実施形態によれば、対象における肝臓病変の存在および重症度を評価するための本発明の非侵襲的方法は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
１ａ）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを含む少なくとも別の二項ロジスティック回帰を行い、前記二項ロジスティック回帰の診断標的は臨床的に関連する二項標的であり、それにより、工程１）の二項ロジスティック回帰によって得られたもののうち有意な単一標的スコアを特定し、前記有意な単一標的スコアは前記臨床的に関連する二項診断標的に独立して関連づけられている工程と、
１ｂ）工程１ａ）において有意であることが分かった単一標的二項ロジスティック回帰のそれぞれのために肝臓病変ステージまたはグレードの分類を導出する工程と、
１ｃ）工程１ｂ）の分類を組み合わせて肝臓病変ステージまたはグレードの複数標的分類を作成する工程と、
２）工程１ａ）で特定された有意なスコアを多重線形回帰において組み合わせて単一の複数標的スコアを得、それにより対象における肝臓病変の存在および重症度を評価する工程と
を含む。
特定の実施形態では、本発明の非侵襲的方法は、対象における肝硬変を含む肝線維症の存在および重症度を評価するためのものである。
一実施形態では、本発明の非侵襲的方法の工程１）は、それぞれがＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４ステージに対応する異なるＭｅｔａｖｉｒ線維症ステージを標的にする４回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
別の実施形態では、本発明の非侵襲的方法の工程１）は、それぞれがＭｅｔａｖｉｒ線維症ステージＦ≧１（Ｆ０に対してＦ≧１）、Ｆ≧２（Ｆ≦１に対してＦ≧２）、Ｆ≧３（Ｆ≦２に対してＦ≧３）、Ｆ４（Ｆ≦３に対してＦ４）、Ｆ０＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ２およびＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ４に対してＦ３に対応する異なる線維症標的を有する７回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
別の実施形態では、本発明の非侵襲的方法の工程１）は、それぞれがＭｅｔａｖｉｒ線維症ステージＦ＝０に対してＦ≧１、Ｆ≦１に対してＦ≧２、Ｆ≦２に対してＦ≧３、Ｆ≦３に対してＦ＝４、Ｆ０＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ２、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ４に対してＦ３、Ｆ０＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１＋Ｆ２、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ４に対してＦ２＋Ｆ３およびＦ０＋Ｆ４に対してＦ１＋Ｆ２＋Ｆ３に対応する異なる線維症標的を有する１０回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
本発明の非侵襲的方法の一実施形態によれば、工程１）の二項ロジスティック回帰は、バイオマーカー、臨床マーカー、定性的マーカー、物理的診断法によって得られるデータ、線維症検査のスコア、イメージング法によって以前に得られた対象の肝臓組織の少なくとも１つの画像の記述子およびそれらの数学的組み合わせから選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの変数に対して行う。
本発明の非侵襲的方法の一実施形態では、工程１）の二項ロジスティック回帰は、イメージング法によって以前に得られた対象の肝臓組織の少なくとも１つの画像の少なくとも２つの記述子に対して行い、前記記述子は、エッジの直線性の割合、平均の線維症の周りの領域の割合（すなわち小結節形成の割合）、肝生検標本の全表面のうち星形線維症の面積、架橋の数、架橋の厚さ、平均の門脈−中隔領域の面積、架橋の周長、門脈−中隔領域間の架橋の比、架橋の中の線維症の面積、類洞周囲線維症のフラクタル次元、臓器、組織またはその断片の周長、門脈−中隔線維症のフラクタル次元、線維症全体の中での類洞周囲線維症の比、臓器、組織またはその断片の長さ、曲折記述子（生来の周長、平滑化された周長および両周長間の比）、線維症のフラクタル次元、総密度の四分位数間範囲、アランチウス管（Ａｒａｎｔｉｕｓ ｆｕｒｒｏｗ）の厚さ、生来の肝臓の平均周長、脾臓全体の平均周長、脾臓表面と肝臓表面との比およびそれらの数学的組み合わせを含む群から選択される。
本発明の非侵襲的方法の別の実施形態では、工程１）の二項ロジスティック回帰は、物理的診断法によって得られる少なくとも１つのデータに対して行い、前記物理的診断法は、Ｆｉｂｒｏｓｃａｎとしても知られている振動制御過渡エラストグラフィ（ＶＣＴＥ）、音響放射力インパルス（ＡＲＦＩ）、超音波剪断波イメージング（ＳＳＩ）弾性率測定法およびＭＮＲ／ＭＲＩエラストグラフィから選択されるエラストグラフィ法である。
本発明の非侵襲的方法の別の実施形態では、工程１）の二項ロジスティック回帰は、物理的診断法によって得られる少なくとも１つのデータに対して行い、前記物理的診断法は、Ｘ線、超音波検査、コンピュータスキャナ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、機能的磁気共鳴画像法、断層撮影法、コンピュータＸ線体軸断層撮影法、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影法および断面デンシトメトリー（ｔｏｍｏｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）から選択される放射線撮影法である。
本発明の非侵襲的方法の別の実施形態では、工程１）の二項ロジスティック回帰は、ＡＰＲＩ、ＦＩＢ４、Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ、ＥＬＦスコア、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ、Ｆｉｂｒｏｓｐｅｃｔ、Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ、ＺｅｎｇスコアおよびＮＡＦＬＤ線維症スコアから選択される線維症検査により得られる線維症検査の少なくとも１つのスコアに対して行い、前記線維症検査は、生物学的マーカーおよび／または臨床マーカーから選択されるマーカーの単純な数学的関数または二項ロジスティック回帰における組み合わせを含む。
本発明の非侵襲的方法の別の実施形態では、工程１）の二項ロジスティック回帰は、線維症検査のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒファミリーおよびそれらの振動制御過渡エラストグラフィ（ＶＣＴＥ）（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎとしても知られている）との組み合わせから選択される線維症検査に対応する。
本発明の非侵襲的方法の一実施形態によれば、工程１）の二項ロジスティック回帰は線形判別分析および多変量解析から選択される別の統計分析と置き換えられる。
一実施形態では、本発明の非侵襲的方法は、肝機能障害、慢性肝疾患、肝炎ウイルス感染（特にＢ型、Ｃ型もしくはＤ型肝炎ウイルスによって引き起こされる感染）、肝毒性、肝癌、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、自己免疫疾患、代謝性肝疾患および肝臓の続発性合併症を伴う疾患を含む群から選択される肝臓病に罹患している対象における肝臓病変の存在および重症度を評価するためのものである。
本発明は、本発明の非侵襲的方法を実行するマイクロプロセッサにも関する。
本発明は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
２）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを多重線形回帰において組み合わせて新しい複数標的スコアを得る工程と、
３）任意に、工程２）で得られた複数標的スコアを肝臓病変ステージまたはグレードの分類においてソートし、それにより対象における肝臓に関連しない死亡および／または肝臓に関連する死亡を含む死亡または肝臓に関連するイベントのリスクを評価する工程と
を含む、対象における肝臓に関連しない死亡および／または肝臓に関連する死亡を含む死亡または肝臓に関連するイベント、特に合併症のリスクを評価するための非侵襲的方法にも関する。
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
数字の前の「約」は、前記数字の値の±１０％を意味する。
診断検査の「正確性」とは、正確に診断された患者の割合、すなわち前記診断検査によって正確に判定された線維症ステージ（例えば、肝線維症のＭｅｔａｖｉｒステージ分類に基づく）を有する患者の割合を指す。
「ＡＵＲＯＣ」はＲＯＣ曲線下面積を表し、診断検査の正確性の指標である。統計では、受信者動作特性（ＲＯＣ）またはＲＯＣ曲線は、その識別閾値の変化に伴う二項分類システムの性能を示すグラフィカルプロットである。この曲線は０〜１の連続値において特異度に対して感度（通常は１−特異度）をプロットすることによって作成される。ＲＯＣ曲線およびＡＵＲＯＣは統計の分野において周知である。
「バイオマーカー」または「生物学的マーカー」とは、対象からの試料において測定することができる変数を指し、前記試料は、例えば血液、血清または尿試料、好ましくは血液または血清試料などの体液試料である。
本発明で使用される「血液検査」とは、少なくとも１つの変数を非侵襲的に測定することを含む検査を指し、少なくとも２つ変数を測定する場合は、スコア内の前記少なくとも２つの変数を数学的に組み合わせる。本発明では、前記変数はバイオマーカー、臨床マーカー、定性的マーカー、物理的診断法によって得られるデータまたはそれらの任意の組み合わせ（例えばスコア内の任意の数学的組み合わせなど）であってもよい。
「肝硬変」とは、Ｍｅｔａｖｉｒ分類による線維症の最終的なステージ（Ｆ＝４）を指す。
本発明において「分類」とは、病変ステージまたはグレード（例えば、肝線維症ステージ）をソートして異なるクラスを作成することを目的とする非侵襲的診断検査のために開発されたシステムを指す。対象は非侵襲的検査において自身のスコアに従ってクラスに割り当てられ、それにより非侵襲的検査の診断標的に対する単純な二項回答（はい／いいえ）よりも正確な診断が可能になる。
「臨床データ」とは、臨床検査を使用することなく対象の外部観察から収集されるデータを指す。年齢、性別および体重は臨床データの例である。
「記述子」とは、例えば顕微鏡法によって得られた画像または放射線画像などの臓器または組織の画像に関連するかそれらに由来する任意のコンピュータ生成データを指す。一実施形態では、記述子は形態学的記述子である。一実施形態では、記述子は解剖学的もしくは生理学的記述子である。コンピュータ生成データの例としては、限定されるものではないが、臓器または組織の構造的特性（例えば、その長さなど）、臓器または組織画像のスペクトル特性（例えば、コントラストまたは明度など）、臓器または組織のフラクタル特性、臓器または組織の形状に関するデータおよび他の画像データ媒体変換物が挙げられる。
「診断カットオフ」とは検査スコアの診断カットオフを指す。このカットオフは通常二項ロジスティック回帰によって得られ、診断標的の有無（はい／いいえ）で患者を区別する。これは２つの方法、すなわち統計学的伝統的手法による０．５までの演繹的なもの、および特定の選択に従う帰納的なもの、通常は最も高いＹｏｕｄｅｎ指数（Ｓｅ＋Ｓｐｅ−１）または検査性能を最適化するための最大の全体的な正確性で固定することができる。
「診断標的」とは非侵襲的診断検査の主な対象を指す。大部分の非侵襲的線維症検査は単一の診断標的のために、すなわち標的とされる臨床的特徴の有無（はい／いいえ）を判定するために構築された二項検査（単一標的検査）である。従って一実施形態では、線維症検査の診断標的は、それらの間に診断カットオフ（例えば、Ｆ≧２として定められる有意な線維症の有無の診断のためにＦ２／３／４に対してＦ０／１）を有するＭｅｔａｖｉｒ線維症ステージの２つの範囲によって定めてもよい。
「線維症」とは、線維性タンパク質または糖タンパク質（コラーゲン、プロテオグリカン．．．）を含む瘢痕組織からなる肝臓の異常な病変を指す。
「線維症検査」とは、対象における肝線維症の存在および／または重症度を評価することを目的とした非侵襲的診断検査を指す。
Ｋｎｏｄｅｌｌスコアとしても知られている「組織学的活動指数（Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）またはＨＡＩシステム」とは、肝臓組織試料の組織学的描写に基づく肝線維症分類システムを指す。ＨＡＩシステムは、壊死性炎症活動（ｎｅｃｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を０〜１８で、線維症を４つのステージ（０、１、３または４）でスコア化する。
「Ｉｓｈａｋスコアリングシステム」とは、肝臓組織試料の組織学的描写に基づく肝線維症分類システムを指す。Ｉｓｈａｋシステムは壊死性炎症活動の変化を０〜１８の尺度で、線維症を０〜６の尺度でスコア化する。
「Ｋｌｅｉｎｅｒグレード分類／ステージ分類」とは、ＮＡＦＬＤ（非アルコール性脂肪性肝疾患）に特化した分類システムを指し、脂肪症（従来通りにグレード分類と呼ぶ）または線維症（従来通りにステージ分類と呼ぶ）のいずれかのための異なるクラスにおける形態学的描写に基づく。この半定量的（統計では順序）システムは一番最近の従来の組織学的分類である。このシステムはＮＡＳＨ臨床研究ネットワーク（ＮＡＳＨ−ＣＲＮ：ＮＡＳＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ）システムとしても知られている。
「肝臓病変」とは肝臓におけるあらゆる異常を指す。本発明の一実施形態では、肝臓病変は疾患によって引き起こされることがあり、従って「病理学的病変」と呼ぶ場合がある。肝臓病変としては、限定されるものではないが、肝線維症、肝硬変、肝臓脂肪症、断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、壊死性炎症活動または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）が挙げられる。
「Ｍｅｔａｖｉｒ」とは、肝臓組織試料の組織学的描写に基づく５つのステージ（Ｆ０〜Ｆ４）での肝線維症の病理学上の半定量的分類を指す。Ｍｅｔａｖｉｒシステムは壊死性炎症活動も４つのグレード（Ａ０〜Ａ３）に分類する。
本発明における「複数標的検査」とは、病態の様々な、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個の診断標的、より好ましくは全ての診断標的を同時に扱うように構築された非侵襲的診断検査を指す。
「Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ」とは、複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＭＦＭ）検査を指す。１つの構築は主として線維症検査分類を提供することを目的としており、この検査をＭＦＭｃと呼ぶ。別の構築は主として検査スコアを提供することを目的としており、この検査をＭＦＭｓと呼ぶ。ウイルス性病因（「ウイルス」）において構築される場合、ＭＦＭをＭＦＭＶと呼ぶ。同様に、単一標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒは、バイオマーカーとして、とりわけヒアルロン酸（第２世代のウイルス性病因のためのＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒすなわちＦＭＶ２Ｇ）またはＧＧＴ（第３世代のウイルス性病因のためのＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒすなわちＦＭＶ３Ｇ）のいずれかを含むため、対応するＭＦＭをＭＦＭＶ２ＧまたはＭＦＭＶ３Ｇと呼ぶ。従って、少なくとも４種類のＭＦＭが利用可能である。
Figure 2019530854
但し、各ＭＦＭは２つの表現、すなわちスコア（範囲：０〜１）および線維症分類（例えば、Ｆ０〜Ｆ４）で利用可能であることに留意されたい。
「非侵襲的」は、本発明において検査について言及する場合、前記検査を実施するために個体の体から組織が採取されないことを意味する（血液は組織とはみなさない）。
「百分位数」は、特定の割合の観測値が含まれる間隔に対応する。例えば、集団を１０％の１０個の百分位数に分けた場合、各百分位数はその集団の１０％を含む。
「物理データ」とは、例えば振動制御過渡エラストグラフィ（ＶＣＴＥ）によって行われる肝硬度評価などの物理的方法によって得られる変数を指す。
「定性的マーカー」とは、値０または値１（すなわち「はい」または「いいえ」）を有する対象のために決定されるマーカーを指す。治療データ、病因、ＳＶＲ（「ＳＶＲ」は「持続性ウイルス学的著効」を表す）は定性的マーカーの例である。
「信頼できる診断間隔（ＲＤＩ：Ｒｅｌｉａｂｌｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｉｎｔｅｒｖａｌ）」は、診断の正確性が臨床業務のために十分に信頼できるとみなされる診断検査値の間隔（例えば、線維症および／または壊死性炎症活動についてのその間隔など）に対応する。
非侵襲的検査についての「感度」は、真陽性として正確に同定される、非侵襲的検査の診断標的のための真陽性の患者の割合の尺度である。
非侵襲的検査についての「特異度」は、真陰性として正確に同定される、非侵襲的検査の診断標的のための真陰性の患者の割合の尺度である。
「単一標的検査」または「単標的検査」とは、単一の診断標的のために構築された二項検査を指す。一実施形態では、単一標的線維症検査は、それらの間に診断カットオフを有するＭｅｔａｖｉｒ線維症ステージの２つの範囲（例えば、Ｆ≧２として定められる有意な線維症の診断ではＦ２／３／４に対してＦ０／１、すなわちＦ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１）によって通常定められる診断標的を扱う。
検査スコア（検査値と呼んでもよい）またはスコア値などにおける「スコア」とは、少なくとも１つのバイオマーカーおよび／または少なくとも１つの臨床データおよび／または少なくとも１つの物理データおよび／または少なくとも１つの血液検査結果の数学的組み合わせによって得られるあらゆる数値を指す。一実施形態では、スコアは数学的関数によって得られる有界の数値である。好ましくは、このスコアは０〜１の範囲であってもよい。
「脂肪症」は、細胞の液胞内への通常はトリグリセリドである脂質の蓄積として定められている。これは主にメタボリックシンドロームでは肝臓および筋肉に関わる。
「対象」とは哺乳類、好ましくはヒトを指す。一実施形態では、対象は、医療的ケアを受けるのを待っているか現在受けている、あるいは過去に医療処置の対象であったか現在対象であるか今後対象になる、あるいは疾患の発現または進行について監視されている「患者」すなわち温血動物、より好ましくはヒトであってもよい。一実施形態では、対象は成人（例えば年齢が１８歳以上の対象）である。別の実施形態では、対象は小児（例えば年齢が１８歳未満の対象）である。一実施形態では、対象は男性である。別の実施形態では、対象は女性である。
本発明の方法における「変数」とは、二項ロジスティック回帰において組み合わせることができる患者から得られる尺度を指す。本発明における変数としては、生物学的マーカー、臨床マーカー、定性的マーカー、物理データ、線維症検査スコア、指標および画像の記述子が挙げられる。
「Ｙｏｕｄｅｎ指数」は、感度＋特異度−１として定められており、ここでは感度および特異度は割合として計算される。Ｙｏｕｄｅｎ指数はそれぞれ−１および＋１である最小値および最大値を有し、ここでは＋１の値はアルゴリズムにとって最適な値を表す。
本発明は、複数標的検査を行う工程を含む、対象における肝臓病変の存在および重症度を評価するための非侵襲的方法に関する。肝臓病変としては、限定されるものではないが、肝線維症、肝硬変、肝臓脂肪症、断片化、壊死性炎症活動または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）が挙げられる。
一実施形態では、本発明は、複数標的検査を行う工程を含む、対象における肝硬変を含む肝線維症の存在および重症度を評価するための非侵襲的方法に関する。
本発明の別の目的は、複数標的検査を行う工程を含む、対象における死亡、肝臓に関連しない死亡もしくは肝臓に関連する死亡または肝臓に関連するイベント、特に合併症のリスクを評価するための非侵襲的方法である。本発明は、複数標的検査を行う工程を含む、対象における死亡または肝臓に関連するイベントのリスクの増加を決定するための非侵襲的方法にも関する。
一実施形態では、本発明の非侵襲的方法は生体外方法である。
好ましくは、本発明の複数標的検査は多重線形回帰により構築される。
以下の表は、本発明の複数標的検査の構築の概略を提供する。
Figure 2019530854
 ａＭＦＭｓの主目的（太字の変数）
ｂＭＦＭｃの主目的（太字の変数）
本発明の方法は、単一標的検査と比較して正確性が向上した独特なスコアおよび独特な分類を提供する、単一標的二項ロジスティック回帰の組み合わせに基づく単一の複数標的診断または予後判定検査について記載している。
一実施形態では、本発明の方法は、単一標的診断検査と比較して正確性が向上した独特なスコアおよび独特な分類を提供する、単一標的診断検査の組み合わせに基づく単一の複数標的診断検査について記載している。
従って一実施形態では、本発明は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
２）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを多重線形回帰において組み合わせて対象における肝臓病変の存在および重症度を評価するのに有用な新しい複数標的スコアを得る工程と
を含む、対象における肝臓病変の存在および重症度を評価するための非侵襲的方法に関する。
従って本実施形態では、本発明の方法は、少なくとも３つの診断標的を対象とする複数標的検査を行う工程を含む。
好ましい実施形態では、多重線形回帰は段階的な多重線形回帰、すなわち独立変数の段階的選択による多重線形回帰である。
一実施形態では、本発明の方法は、工程２）で得られた複数標的スコアを肝臓病変ステージまたはグレードの分類においてソートし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの肝臓病変ステージまたはグレードに属するかを判定する工程を任意に含む。
従って一実施形態では、対象における肝臓病変の存在および重症度を評価するための非侵襲的方法は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
２）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰において組み合わせて新しい複数標的スコアを得る工程と、
３）工程２）で得られた複数標的スコアを肝臓病変ステージまたはグレードの分類において位置付けし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの病変ステージまたはグレードに属するかを判定する工程と
を含む。
特定の一実施形態では、本発明は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
２）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを多重線形回帰において組み合わせて新しい複数標的スコアを得る工程と、
３）任意に、工程２）で得られた複数標的スコアを線維症ステージの分類において位置付けし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの線維症ステージ（または線維症ステージのクラス）に属するかを判定する工程と
を含む、対象における肝硬変を含む肝線維症の存在および重症度を評価するための非侵襲的方法に関する。
特定の一実施形態では、本発明は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
２）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを前記対象のＭｅｔａｖｉｒスコアを標的にする重線形回帰において組み合わせて新しい複数標的スコアを得る工程と、
３）任意に、工程２）で得られた複数標的スコアを線維症ステージの分類において位置付けし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの線維症ステージ（または線維症ステージのクラス）に属するかを判定する工程と
を含む、対象における肝硬変を含む肝線維症の存在および重症度を評価するための非侵襲的方法に関する。
別の実施形態では、本発明は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
２）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰において組み合わせて、対象における肝臓に関連しない死亡もしくは肝臓に関連する死亡を含む死亡または肝臓に関連するイベントのリスクを評価するのに有用な新しい複数標的スコアを得る工程と
を含む、対象における肝臓に関連しない死亡および／または肝臓に関連する死亡を含む死亡または肝臓に関連するイベント、特に合併症のリスクを評価するための非侵襲的方法に関する。
一実施形態では、本発明の方法は、工程２）で得られた複数標的スコアを肝臓病変ステージまたはグレードの分類においてソートし、それにより対象における肝臓に関連しない死亡および／または肝臓に関連する死亡を含む死亡または肝臓に関連するイベントのリスクを評価する工程を任意に含む。
従って一実施形態では、対象における肝臓に関連しない死亡および／または肝臓に関連する死亡を含む死亡または肝臓に関連するイベント、特に合併症のリスクを評価するための非侵襲的方法は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
２）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを多重線形回帰において組み合わせて新しい複数標的スコアを得る工程と、
３）工程２）で得られた複数標的スコアを肝臓病変ステージまたはグレードの分類において位置付けし、それにより対象における肝臓に関連しない死亡および／または肝臓に関連する死亡を含む死亡または肝臓に関連するイベントのリスクを評価する工程と
を含む。
一実施形態では、本発明の方法の工程２）の多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰は、Ｍｅｔａｖｉｒ Ｆステージを標的にする。
従って一実施形態では、本発明の複数標的検査は、複数標的スコアを肝臓病変ステージまたはグレード、例えば線維症ステージの分類においてソートし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの肝臓病変ステージまたはグレード（または病変ステージまたはグレードのクラス）、例えば線維症ステージ（または線維症ステージのクラス）に属するかを判定する任意の工程を含む。
一実施形態では、本発明の方法の任意の工程３）で使用される分類は、以前に得られたものである。
一実施形態によれば、本発明の方法の分類は、線維症ステージのＭｅｔａｖｉｒ分類に基づいている。従って一実施形態では、前記分類は、工程２）で得られたスコアと線維症Ｍｅｔａｖｉｒステージとの対応を導出することによって参照集団から得られる。一実施形態では、この分類は、線維症Ｍｅｔａｖｉｒステージに基づく４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個のクラス、好ましくは線維症Ｍｅｔａｖｉｒステージに基づく５つ、６つ、７つまたは８つのクラスを含む。
一実施形態では、この分類は、線維症Ｍｅｔａｖｉｒステージに基づく５つのクラスを含む。一実施形態では、線維症Ｍｅｔａｖｉｒステージに基づく前記５つのクラスは、０／１（Ｆ０／１）、１／２（Ｆ１／２）、２／３（Ｆ２／３）、３／４（Ｆ３／４）および４（Ｆ４）である。別の実施形態では、この分類は線維症Ｍｅｔａｖｉｒステージに基づく６つのクラスを含む。一実施形態では、線維症Ｍｅｔａｖｉｒステージに基づく前記６つのクラスは、Ｆ０／１、１／２（Ｆ１／２）、２（Ｆ２±１）、３（Ｆ３±１）、３／４（Ｆ３／４）および４（Ｆ４）である。
別の実施形態によれば、本発明の方法の分類は、線維症ステージを含む組織学的活動指数（ＨＡＩ）分類に基づいている。従って一実施形態では、前記分類は、工程２）で得られたスコアとＨＡＩシステムに従って定められる線維症ステージとの対応を導出することによって参照集団から得られる。
別の実施形態によれば、本発明の方法の分類は、線維症ステージのＩｓｈａｋ分類に基づいている。従って一実施形態では、前記分類は、工程２）で得られたスコアとＩｓｈａｋシステムに従って定められる線維症ステージとの対応を導出することによって参照集団から得られる。
別の実施形態によれば、本発明の方法の分類は、壊死性炎症活動グレードのＭｅｔａｖｉｒ分類に基づいている。従って一実施形態では、前記分類は、工程２）で得られたスコアとＭｅｔａｖｉｒ壊死性炎症活動グレードとの対応を導出することによって参照集団から得られる。
別の実施形態によれば、本発明の方法の分類は、ＮＡＳＨ臨床研究ネットワーク（ＮＡＳＨ−ＣＲＮ）システムとしても知られているＮＡＦＬＤに特化したＫｌｅｉｎｅｒグレード分類／ステージ分類に基づいている。従って一実施形態では、前記分類は、工程２）で得られたスコアとＫｌｅｉｎｅｒグレード分類／ステージ分類すなわちＮＡＳＨ−ＣＲＮシステムとの対応を導出することによって参照集団から得られる。
一実施形態によれば、本発明の方法の分類は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４００５５００号に記載されているように、病変ステージまたはグレードを百分位数に従ってクラスに割り当てる方法によって得られる。簡単に言うと、参照集団の患者をそれらのスコア結果に従って百分位数に分類する。次いで、各集団百分位数のために、１つの参照システム（例えば、Ｍｅｔａｖｉｒ、Ｉｓｈａｋ、Ｋｌｅｉｎｅｒ）に従って定められる関連する至適基準病変ステージまたはグレードを高い固定された最小正分類率（例えば８０％）に従って決定する。各百分位数に関連づけることができる至適基準ステージまたはグレードの最大数は限られている（例えば３まで）。従って、固定された最小正分類率に従って限られた数の至適基準病変ステージまたはグレードを各集団百分位数と関連づけることにより、病変ステージまたはグレードをグループ化して新しいクラスを作成することが可能になる。
別の実施形態によれば、本発明の方法の分類は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４００５５００号に記載されているように信頼できる診断間隔（ＲＤＩ）法に従って得られる。
一実施形態によれば、本発明の方法において分類を得るためには、慢性肝疾患を有する患者の参照集団が必要となる。一実施形態では、参照集団は肝炎ウイルス、好ましくはＣ型肝炎ウイルスに罹患している患者の集団であってもよい。一実施形態では、参照集団は少なくとも約５００人の患者、好ましくは少なくとも約７００人の患者、より好ましくは少なくとも約１０００人の患者を含む。
本発明は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
１ａ）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを含む少なくとも別の二項ロジスティック回帰を行い、前記二項ロジスティック回帰の診断標的は臨床的に関連する二項標的であり、それにより、工程１）の二項ロジスティック回帰によって得られたもののうち有意な単一標的スコアを特定し、前記有意な単一標的スコアは前記臨床的に関連する二項診断標的に独立して関連づけられている工程と、
１ｂ）工程１ａ）において有意であることが分かった単一標的二項ロジスティック回帰のそれぞれのために肝臓病変ステージまたはグレードの分類を導出する工程と、
１ｃ）工程１ｂ）の分類を組み合わせて肝臓病変ステージまたはグレードの複数標的分類を作成する工程と、
２）工程１ａ）で特定された有意なスコアを多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰において組み合わせて単一の複数標的スコアを得て、それにより対象における肝臓病変の存在および重症度を評価する工程と
を含む、対象における肝臓病変の存在および重症度を評価するための非侵襲的方法にも関する。
特定の一実施形態では、本発明は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
１ａ）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを含む少なくとも別の二項ロジスティック回帰を行い、前記二項ロジスティック回帰の診断標的は臨床的に関連する二項標的であり、それにより、工程１）の二項ロジスティック回帰によって得られたもののうち有意な単一標的スコアを特定し、前記有意な単一標的スコアは前記臨床的に関連する二項診断標的に独立して関連づけられている工程と、
１ｂ）工程１ａ）において有意であることが分かった単一標的二項ロジスティック回帰のそれぞれのために線維症ステージの分類を導出する工程と、
１ｃ）工程１ｂ）の分類を組み合わせて線維症ステージの複数標的分類を作成する工程と、
２）工程１ａ）で特定された有意なスコアを多重線形回帰において組み合わせて単一の複数標的スコアを得て、それにより対象における肝硬変を含む肝線維症の存在および重症度を評価する工程と
を含む、対象における肝硬変を含む肝線維症の存在および重症度を評価するための非侵襲的方法に関する。
別の実施形態では、本発明は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
１ａ）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを含む少なくとも別の二項ロジスティック回帰を行い、前記二項ロジスティック回帰の診断標的は臨床的に関連する二項標的であり、それにより、工程１）の二項ロジスティック回帰によって得られたもののうち有意な単一標的スコアを特定し、前記有意な単一標的スコアは前記臨床的に関連する二項診断標的に独立して関連づけられている工程と、
１ｂ）工程１ａ）において有意であることが分かった単一標的二項ロジスティック回帰のそれぞれのために肝臓病変ステージまたはグレードの分類を導出する工程と、
１ｃ）工程１ｂ）の分類を組み合わせて肝臓病変ステージまたはグレードの複数標的分類を作成する工程と、
２）工程１ａ）で特定された有意なスコアを多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰において組み合わせて単一の複数標的スコアを得て、それにより対象における肝臓に関連しない死亡および／または肝臓に関連する死亡を含む死亡または肝臓に関連するイベントのリスクを評価する工程と
を含む、対象における肝臓に関連しない死亡および／または肝臓に関連する死亡を含む死亡または肝臓に関連するイベント、特に合併症のリスクを評価するための非侵襲的方法に関する。
従って一実施形態では、本発明の方法は、単一標的二項ロジスティック回帰のそれぞれから導出された分類を組み合わせて複数標的分類を作成し、それにより対象がどの肝臓病変ステージまたはグレード（または病変ステージまたはグレードのクラス）に属するかを判定する工程を含む。
一実施形態では、工程１ａ）で行われる少なくとも別の二項ロジスティック回帰の臨床的に関連する二項標的は、有意な線維症および／または肝硬変である。
一実施形態では、工程２）で得られる複数標的スコアは有界であり、０〜１の範囲である。
一実施形態では、本発明の方法の工程２）の多重線形回帰は、正規化されたＭｅｔａｖｉｒ Ｆを標的にする。別の実施形態では、本発明の方法の工程２）の多重線形回帰は、工程１ｃ）の正規化された（上下限：０および１）複数標的検査分類を標的にする。
従って一実施形態では、本発明の複数標的検査は、二項ロジスティック回帰によって得られる単一標的スコアのそれぞれのために分類を導出する工程と、得られた「単一標的」分類を組み合わせて複数標的分類を作成する工程とを含む。
一実施形態では、「単一標的」分類は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４００５５００号に記載されているように、病変ステージまたはグレードを百分位数に従ってクラスに割り当てる分類方法によって得られる。
別の実施形態では、「単一標的」分類は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４００５５００号に記載されているように、信頼できる診断間隔（ＲＤＩ）に基づく分類方法によって得られる。
本発明では、二項ロジスティック回帰によって得られた各有意な単一標的スコアのために導出された分類を組み合わせて複数標的分類を作成する工程は、以下に簡単に説明され、かつ実施例３に例示されている特定の独自の統計学的技術を用いて実施する。一実施形態では、本発明の複数標的分類は、単一標的分類の一対比較による最大の正確性に基づく分割方法を用いて得られる。
本目的は、工程１ａ）で有意であると特定された単一標的二項ロジスティック回帰（ＢＬＲ）のために得られた分類の最も正確な部分を選択して組み合わせることである。有意であると分かった二項ロジスティック回帰（ＢＬＲ）は、スコア（カットオフの決定のため）または分類（正確性の決定のため）のいずれかで表される。
中間分類（検討される二項ロジスティック回帰の数に応じた数）を生成した後に、最終的な複数標的分類が得られる。例えば、３つの二項ロジスティック回帰（ＢＬＲ１、ＢＬＲ２、ＢＬＲ３）が工程１ａ）で有意であることが分かった場合、１つの中間分類（ＢＬＲ１／ＢＬＲ２またはＢＬＲ２／ＢＬＲ３またはＢＬＲ１／ＢＬＲ３）を生成した後に、最終的な複数標的分類が得られる（ＢＬＲ１／ＢＬＲ２／ＢＬＲ３）。
最初に、正確に分類された患者の割合（すなわち正確性）を２つの隣接する有意な二項ロジスティック回帰間（ＢＬＲ１とＢＬＲ２またはＢＬＲ２とＢＬＲ３またはＢＬＲ１とＢＬＲ３）で比較する。この目的は、最良のカットオフを決定して、これらの２つの二項ロジスティック回帰を含む全体的な正確性を最大化することである。保持される病変クラスまたはグレードの限界は、対応するスコアの限界によって決定される。
例えば正確性は、ＢＬＲ１スコアのカットオフ未満のＢＬＲ１分類およびこのカットオフ未満のＢＬＲ２分類によって正確に分類された患者の合計である。この計算を低いスコア値から高いスコア値まで繰り返してＢＬＲ１スコアの増加値のうち最良のカットオフを見つけて全体的な正確性（「全体的な正確性」とは２つの正確性の合計を意味する）を最大化する。次いで、同じ計算を繰り返してＢＬＲ２スコアの最良のカットオフを決定する。このようにして、第１または第２のＢＬＲのいずれかによって決定されるカットオフにより２つが組み合わせられた分類ＢＬＲ１／ＢＬＲ２が得られる。２つが組み合わせられた分類間での選択は、主に得られる最大の全体的な正確性によって、次いでＢＬＲ３を含む次の計算のためにＢＬＲ２により利用可能なままにする最大の集団サイズによって決まる。
次いで、同じ計算を行ってＢＬＲ１／ＢＬＲ２分類をＢＬＲ３分類と比較するかＢＬＲ２／ＢＬＲ３分類をＢＬＲ１分類と比較するか、ＢＬＲ１／ＢＬＲ３分類をＢＬＲ２分類と比較し、最良の組み合わせられたＢＬＲ１／ＢＬＲ２／ＢＬＲ３分類を決定する。
４つ以上の二項ロジスティック回帰が存在する場合、最終的な分類が得られるまで同じプロセスを繰り返し、前記最終的な分類は、工程１ａ）で有意であると特定された二項ロジスティック回帰のために導出された分類のそれぞれの部分を組み合わせたものである。
一実施形態では、各有意な単一標的二項ロジスティック回帰のために得られた分類を組み合わせたものである複数標的分類は、一対比較による最大の正確性に基づく統計学的方法により得られる。
一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回または少なくとも１０回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの変数に対して３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
一実施形態では、他の好適な統計分析または組み合わせを工程１）の二項ロジスティック回帰の代わりに用いてもよい。本発明の複数標的検査の工程１）で使用することができる統計分析の例としては、限定されるものではないが、線形判別分析または多変量解析が挙げられる。
一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の線形判別分析を行う工程を含む。
一実施形態では、本発明の検査方法は、少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の多変量解析を行う工程を含む。
一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０個の変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
別の実施形態では、本発明の方法は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個の変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
一実施形態によれば、前記少なくとも１つの変数は、バイオマーカー、臨床マーカー、定性的マーカー、物理的診断法によって得られるデータ、線維症検査のスコア、イメージング法によって以前に得られた肝臓組織の画像の記述子およびそれらの数学的組み合わせを含む群から選択されてもよい。
一実施形態では、前記少なくとも１つの変数は生物学的マーカーと呼ばれることもあるバイオマーカーである。
別の実施形態では、本発明の複数標的検査は、少なくとも２つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含み、少なくとも１つの変数はバイオマーカーであり、かつ少なくとも１つの他の変数はバイオマーカー、臨床マーカー、定性的マーカー、物理的診断法によって得られるデータ、線維症検査のスコア、イメージング法によって以前に得られた肝臓組織の画像の記述子およびそれらの数学的組み合わせを含む群から選択される。
一実施形態では、対象から得られる試料は血液試料である。
従って一実施形態では、本発明の方法は、工程１）の二項ロジスティック回帰を行うためにバイオマーカーを測定する工程を含む。
一実施形態では、本発明の方法は、対象から血液試料を得てバイオマーカーを測定する工程も含んでもよい。
そのような生物学的マーカーの例としては、限定されるものではないが、総コレステロール、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ）、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、血小板（ＰＬＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）またはプロトロンビン指数（ＰＩ）またはＩＮＲ（国際標準比）、ヒアルロン酸（ＨＡまたはヒアルロナート）、ヘモグロビン、トリグリセリド、α２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、尿素、ビリルビン（例えば、総ビリルビンなど）、アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）、ＩＩＩ型プロコラーゲンＮ端末プロペプチド（Ｐ３ＮＰまたはＰ３Ｐ）、γ−グロブリン（ＧＢＬ）、ナトリウム（Ｎａ）、アルブミン（ＡＬＢ）（例えば、血清アルブミンなど）、フェリチン（Ｆｅｒ）、グルコース（Ｇｌｕ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ＹＫＬ−４０（ヒトの軟骨糖タンパク質３９）、マトリックスメタロプロテアーゼ組織阻害因子−１（ＴＩＭＰ−１）、ＴＧＦ、サイトケラチン１８、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）〜９（ＭＭＰ−９）、ハプトグロビン、α−フェトプロテイン、クレアチニン、白血球、好中球、分葉核球、分葉核好中球、単球、例えばＡＳＴ／ＡＬＴ（比）、ＡＳＴ．ＡＬＴ（生成物）、ＡＳＴ／ＡＬＴ＋プロトロンビン、ＡＳＴ／ＡＬＴ＋ヒアルロン酸などのそれらの比および数学的組み合わせが挙げられる。
一実施形態では、生物学的マーカーは、α２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、ヒアルロン酸（ＨＡまたはヒアルロナート）、プロトロンビン指数（ＰＩ）、血小板（ＰＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、尿素、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、フェリチン（Ｆｅｒ）およびグルコース（Ｇｌｕ）を含む群から選択される。
生物学的マーカーは対象から得られた血液試料で測定してもよい。従って、生物学的マーカーを測定することは、血液中の細胞の計数（例えば血小板数）、血液中のタンパク質濃度（例えば、α２−マクログロブリン、ハプトグロビン、アポリポタンパク質Ａ１、フェリチン、アルブミン）の測定、血液中の化合物（例えば、尿素、ビリルビン、ヒアルロン酸、グルコース）濃度の測定、血液中の酵素（例えば、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ）活性の測定、または血液の凝固能力の評価（プロトロンビン指数）からなってもよい。そのようなアッセイまたは計数を行うための方法は、生物医学研究所においてよく使用されており、肝臓学における診断の分野で非常によく知られている。これらの方法は、免疫学的検定技術（例えば、放射免疫測定法すなわちＲＩＡ、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロットなど）において前記タンパク質を認識する１つ以上のモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を使用してもよく、前記タンパク質のｍＲＮＡの量の分析は、ノーザンブロット、スロットブロットまたはＰＣＲ型の技術、任意に質量分析と組み合わせられたＨＰＬＣなどの技術などを使用する。上記酵素活性アッセイは、これらの酵素のそれぞれに特異的な少なくとも１種の基質に対して行われるアッセイを使用する。国際特許出願の国際公開第０３／０７３８２２号は、α２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）およびヒアルロン酸（ＨＡまたはヒアルロナート）を定量化するために使用することができる方法を列挙している。
非網羅的な例として、本発明の方法において血液試料に対して実施されるバイオマーカーの測定のために使用することができる市販のキットまたはアッセイのリストを以下に示す。
・プロトロンビン時間：Ｑｕｉｃｋ時間（ＱＴ：Ｑｕｉｃｋ ｔｉｍｅ）は、カルシウムトロンボプラスチン（例えば、Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｎ ＣＩ ｐｌｕｓ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社、アニエール、フランス）を血漿に添加して決定し、凝固時間を秒で測定する。プロトロンビン時間（ＰＴ）を得るために、１００％で推定される正常血漿の各種希釈のプールから較正直線をプロットする。患者の血漿について得られた結果は正常血漿のプールに対する割合として表す。ＰＴの上限値は限定されておらず、１００％を超えてもよい。
・Ａ２Ｍ：このアッセイはレーザー免疫比濁法、例えばベーリングネフェロメータアナライザーを用いて行う。この試薬はヒトＡ２Ｍに対するウサギ抗血清であってもよい。
・ＨＡ：血清中濃度は、ウシの軟骨から単離された特異的ＨＡ結合タンパク質を使用するＥＬＩＳＡ（例えば：Ｃｏｒｇｅｎｉｘ社製Ｂｉｏｇｅｎｉｃ ＳＡ ３４１３０、モーギオ、フランス）で決定する。
・ＰＬＴ：血液試料はＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含むバキュテナー（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、フランス）の中に採取し、アドヴィア１２０計数器（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社）で分析することができる。
・尿素：例えば「尿素のための動力学ＵＶ（Ｋｉｎｅｔｉｃ ＵＶ）アッセイ」（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてアッセイを行う。
・ＧＧＴ：例えば「Ｓｚａｓｚに対して標準化されたγ−グルタミル転移酵素アッセイ」（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてアッセイを行う。
・ビリルビン：例えば「ビリルビンアッセイ」（Ｊｅｎｄｒａｓｓｉｋ−Ｇｒｏｆ法）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてアッセイを行う。
・ＡＬＴ：例えば「ＡＬＴ ＩＦＣＣ」（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）によってアッセイを行う。
・ＡＳＴ：例えば「ＡＳＴ ＩＦＣＣ」（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてアッセイを行う。
・グルコース：例えば「グルコースＧＯＤ−ＰＡＰ」（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてアッセイを行う。
・尿素、ＧＧＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ナトリウム、グルコース、ＡＬＴおよびＡＳＴは、分析装置、例えば、Ｈｉｔａｃｈｉ ９１７（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、Ｄ−６８２９８、マンハイム、ドイツ）を用いてアッセイすることができる。
・γ−グロブリン、アルブミンおよびα−２グロブリン：タンパク質電気泳動、例えば：毛管電気泳動（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ）（ＳＥＢＩＡ２３、ロベスピエール通り（ｒｕｅ Ｍ Ｒｏｂｅｓｐｉｅｒｒｅ）、９２１３０、イシー・レ・ムリノー、フランス）を用いてアッセイする。
本発明の方法において測定されるバイオマーカーでは、得られた値を以下のように：
・例えばα２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）などのためにｍｇ／ｄｌ、
・例えばヒアルロン酸（ＨＡまたはヒアルロナート）またはフェリチンなどのためにμｇ／ｌ、
・例えばアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）、γ−グロブリン（ＧＬＢ）またはアルブミン（ＡＬＢ）などのためにｇ／ｌ、
・例えばＩＩＩ型プロコラーゲンＮ端末プロペプチド（Ｐ３Ｐ）などのためにＵ／ｍｌ、
・例えばγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などのためにＩＵ／ｌ、
・例えばビリルビンなどのためにμｍｏｌ／ｌ、
・例えば血小板（ＰＬＴ）などのためにＧｉｇａ／ｌ、
・例えばプロトロンビン時間（ＰＴ）などのために％、
・例えば、トリグリセリド、尿素、ナトリウム（ＮＡ）、グルコースなどのためにｍｍｏｌ／ｌ、または
・例えばＴＩＭＰ１、ＭＭＰ２またはＹＫＬ−４０などのためにｎｇ／ｍｌ
で表わしてもよい。
一実施形態では、前記少なくとも１つの変数は臨床マーカーである。
別の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも２つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含み、少なくとも１つの変数は臨床マーカーであり、かつ少なくとも１つの他の変数は、バイオマーカー、臨床マーカー、定性的マーカー、物理的診断法によって得られるデータ、線維症検査のスコア、イメージング法によって以前に得られた肝臓組織の画像の記述子およびそれらの数学的組み合わせを含む群から選択される。
従って一実施形態では、本発明の方法は、工程１）の二項ロジスティック回帰を行うために臨床マーカーを決定する工程を含む。
臨床マーカーの例としては、限定されるものではないが、体重、ボディマス指数、年齢、性別、腰回りの長さ、腹部周りの長さ、および例えば腰回りの長さ／腹部周りの長さなどのそれらの比が挙げられる。
一実施形態では、臨床マーカーは、体重、年齢および性別の中から選択される。
一実施形態では、前記少なくとも１つの変数は定性的マーカーである。
別の実施形態では、本発明の複数標的検査は、少なくとも２つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含み、少なくとも１つの変数は定性的マーカーであり、かつ少なくとも１つの他の変数は、バイオマーカー、臨床マーカー、定性的マーカー、治療データ、物理的診断法によって得られるデータ、線維症検査のスコア、イメージング法によって以前に得られた肝臓組織の画像の記述子およびそれらの数学的組み合わせを含む群から選択される。
従って一実施形態では、本発明の方法は、工程１）の二項ロジスティック回帰を行うために定性的マーカーを決定する工程を含む。
定性的マーカーの例としては、限定されるものではないが、糖尿病、糖尿病治療または抗ウイルス治療などの治療データ、ＳＶＲ（ＳＶＲは持続性ウイルス学的著効を表し、慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染のための抗ウイルス療法の完了から６週間、好ましくは１２週間、より好ましくは２４週間後にａｖｉｒｅｍｉａ（ウイルス血症ではない）と定められる）、病因、およびＮＡＦＬＤが挙げられる。
定性的マーカーである「病因」に関しては、当業者は、前記変数が単一もしくは複数の定性的マーカーであり、かつ肝臓疾患では病因はＮＡＦＬＤ、アルコール、ウイルスまたはそれ以外であってもよいことを知っている。従って、定性的マーカーは、それ以外に対するＮＡＦＬＤ（単一の定性的マーカー）または参照病因に対するＮＡＦＬＤ＋参照病因に対するウイルス（複数の定性的マーカー）などとして表してもよい。
一実施形態では、前記少なくとも１つの変数は物理的診断法によって得られるデータであり、物理データと呼ぶこともある。
別の実施形態では、本方法は、少なくとも２つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含み、少なくとも１つの変数は物理的診断法によって得られるデータであり、かつ少なくとも１つの他の変数は、バイオマーカー、定性的マーカー、物理的診断法によって得られるデータ、線維症検査のスコア、イメージング法によって以前に得られた肝臓組織の画像の記述子およびそれらの数学的組み合わせを含む群から選択される。
本発明では、物理的診断法によって得られるデータとしてはイメージングデータが挙げられる。
従って一実施形態では、物理的診断法によって得られるデータはイメージングデータである。イメージングデータの例としては、限定されるものではないが、超音波検査、特にドップラー超音波検査、ＩＲＭ、ＭＮＲまたは速度測定によって得られるデータが挙げられる。
別の実施形態では、物理的診断法によって得られるデータは、エラストグラフィデータと呼ばれることもある弾性率測定データである。弾性率測定データの例としては、限定されるものではないが、肝硬度評価（ＬＳＥ）または脾硬度評価が挙げられ、これらは、例えばＦｉｂｒｏｓｃａｎ（商標）としても知られているＶＣＴＥ（振動制御過渡エラストグラフィ）またはＡＲＦＩ（音響放射力インパルス）、ＳＳＩ（超音波剪断波イメージング）、ＭＮＲ弾性率測定法あるいは任意の他のエラストグラフィ技術によって得てもよい。
従って一実施形態では、本発明の方法は、Ｆｉｂｒｏｓｃａｎとしても知られている振動制御過渡エラストグラフィ（ＶＣＴＥ）、音響放射力インパルス（ＡＲＦＩ）、超音波剪断波イメージング（ＳＳＩ）弾性率測定法またはＭＮＲ／ＭＲＩエラストグラフィによって得られる少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのデータに対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
別の実施形態では、本発明の複数標的検査は、少なくとも２つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含み、少なくとも１つの変数は、Ｆｉｂｒｏｓｃａｎとしても知られている振動制御過渡エラストグラフィ（ＶＣＴＥ）、音響放射力インパルス（ＡＲＦＩ）、超音波剪断波イメージング（ＳＳＩ）弾性率測定法またはＭＮＲ／ＭＲＩエラストグラフィによって得られるデータであり、かつ少なくとも１つの他の変数は、バイオマーカー、定性的マーカー、物理的診断法によって得られるデータ、線維症検査のスコア、イメージング法によって以前に得られた肝臓組織の画像の記述子およびそれらの数学的組み合わせを含む群から選択される。
特定の実施形態では、物理データは、好ましくはＶＣＴＥ（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎ（商標）としても知られている、パリ、フランス）によって測定される、肝硬度評価（ＬＳＥ）と呼ばれることもある肝硬度測定（ＬＳＭ）である。一実施形態では、ＶＣＴＥによる測定はＭプローブで行う。好ましくは、検査条件は少なくとも３つ、好ましくは１０個の有効な測定値を得るために製造業者によって推奨されているものである。結果は、全ての有効な測定値の中央値（キロパスカル）およびＩＱＲ（四分位数間範囲）または比（ＩＱＲ／中央値）として表してもよい。
従って一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含み、前記少なくとも１つの変数はＶＣＴＥ（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎ（商標）としても知られている）によって得られる。別の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも２つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含み、ここでは、少なくとも１つの変数はＶＣＴＥによって得られる肝硬度測定値（ＬＳＭ）であり、他の変数は、バイオマーカー、定性的マーカー、物理的診断法によって得られるデータ、線維症検査のスコア、イメージング法によって以前に得られた肝臓組織の画像の記述子およびそれらの数学的組み合わせを含む群から選択される。
別の実施形態では、物理的診断法によって得られるデータは放射線撮影データである。
一実施形態によれば、物理的診断法によって得られるデータは、Ｘ線、超音波検査、コンピュータスキャナ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、機能的磁気共鳴画像法、断層撮影法、コンピュータＸ線体軸断層撮影法、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影法または断面デンシトメトリーから選択される放射線撮影法によって得られる。
一実施形態では、本発明の方法は、Ｘ線、超音波検査、コンピュータスキャナ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、機能的磁気共鳴画像法、断層撮影法、コンピュータＸ線体軸断層撮影法、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影法または断面デンシトメトリーによって得られる少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのデータに対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つの変数は、非侵襲的検査のスコア、好ましくは線維症検査または脂肪症検査のスコアである。
別の実施形態では、本発明の複数標的検査は、少なくとも２つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含み、少なくとも１つの変数は非侵襲的検査のスコア、好ましくは線維症検査または脂肪症検査のスコでアであり、少なくとも１つの他の変数は、バイオマーカー、臨床マーカー、定性的マーカー、物理的診断法によって得られるデータ、線維症検査のスコア、イメージング法によって以前に得られた肝臓組織の画像の記述子およびそれらの数学的組み合わせを含む群から選択される。
従って一実施形態では、本発明の方法は、工程１）の二項ロジスティック回帰を行うために線維症スコアと呼ばれることもある線維症検査のスコアを得る工程を含む。
本発明では線維症検査のスコアは、線維症検査を行うことによって対象のために得られる。
線維症検査は、対象におけるマーカーを決定し、かつ前記マーカーを数学的に組み合わせてスコアを得る工程を含み、前記スコアは通常０〜１の範囲の値である。線維症検査（および関連する検査）の例としては、限定されるものではないが、ＡＰＲＩ、ＥＬＦスコア、Ｆｉｂｒｏｓｐｅｃｔ、ＦＩＢ−４、Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ、Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ、Ｚｅｎｇスコア、ＮＡＦＬＤ線維症スコア、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（商標）、ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒ（商標）、ＣｏｍｂｉＭｅｔｅｒ（商標）（またはＥｌａｓｔｏ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（商標）またはＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶＣＴＥ（商標））、ＩｎｆｌａＭｅｔｅｒ（商標）、Ａｃｔｉｔｅｓｔ、ＱｕａｎｔｉＭｅｔｅｒ（商標）、Ｐ２／ＭＳおよびＥｌａｓｔｏ−Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔが挙げられる。
一実施形態では、本発明の複数標的検査は、ＡＰＲＩ、ＦＩＢ４、Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ、ＥＬＦスコア、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（商標）、ＦｉｂｒｏｓｐｅｃｔまたはＨｅｐａｓｃｏｒｅ、Ｚｅｎｇスコア、ＮＡＦＬＤ線維症スコアから選択される線維症検査により得られる少なくとも１つの線維症スコアに対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含み、ここでは、前記線維症検査は、算術演算、例えば除算、または生物学的マーカーおよび／または臨床マーカーから選択されるマーカーの二項ロジスティック回帰などの単純な数学的関数における組み合わせを含む。
本発明では、対象から得られた血液試料において測定されたバイオマーカーを組み合わせる工程を含む線維症検査を「血液検査」ともいう。
ＡＰＲＩは血小板およびＡＳＴに基づく血液検査である。
ＥＬＦ（強化肝線維症）スコアは、ヒアルロン酸、Ｐ３ＰおよびＴＩＭＰ−１に基づく血液検査である。
Ｆｉｂｒｏｓｐｅｃｔは、ヒアルロン酸、ＴＩＭＰ−１およびＡ２Ｍに基づく血液検査である。
ＦＩＢ−４は、血小板、ＡＳＴ、ＡＬＴおよび年齢に基づく血液検査である。
Ｈｅｐａｓｃｏｒｅは、ヒアルロン酸、ビリルビン、α２−マクログロブリン、ＧＧＴ、年齢および性別に基づく血液検査である。
Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔは、α２−マクログロブリン、ハプトグロビン、アポリポタンパク質Ａ１、総ビリルビン、ＧＧＴ、年齢および性別に基づく血液検査である。
Ｚｅｎｇスコアは、ＧＧＴ、Ａ２Ｍ、ＨＡおよび年齢に基づく血液検査である。
ＮＡＦＬＤ線維症スコアは、ＡＳＴ、ＡＬＴ、血小板、グルコース、アルブミン、年齢および体重に基づく血液検査である。
ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（商標）およびＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒ（商標）は一緒に血液検査ファミリーを構成し、その内容は慢性肝疾患の原因および診断標的によって決まる。この血液検査ファミリーをＦＭファミリーと呼び、以下の表１に詳細が記載されている。
Figure 2019530854
 ＦＭ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ、ＣＭ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒ、ＦＭ Ａ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ ＡＬＤ（アルコール性肝疾患）、ＦＭ Ｓ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ ＮＡＦＬＤ
Ａ２Ｍ：α２−マクログロブリン、ＨＡ：ヒアルロン酸、ＰＩ：プロトロンビン指数、ＰＬＴ：血小板、Ｆｅｒ：フェリチン、Ｇｌｕ：グルコース
ａＨＡはＧＧＴに置き換えられる
ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒは、（ｉ）Ａ２Ｍ、ＨＡ、ＰＩ、ＰＬＴ、ＡＳＴ、尿素、ＧＧＴ、ＡＬＴ、フェリチンおよびグルコースから選択される少なくとも３つの生物学的マーカーと、（ｉｉ）任意に、年齢、性別および体重から選択される少なくとも１つの臨床マーカーとに基づく血液検査である。疑いのある線維症の病因がウイルス感染である場合に推奨される第１世代（１Ｇ）のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＦＭ Ｖ １Ｇ）は、Ａ２Ｍ、ＨＡ、ＰＩ、ＰＬＴ、ＡＳＴ、尿素および年齢に基づく血液検査である。疑いのある線維症の病因がウイルス感染である場合に推奨される第２世代（２Ｇ）のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＦＭ Ｖ ２Ｇ）は、Ａ２Ｍ、ＨＡ、ＰＩ、ＰＬＴ、ＡＳＴ、尿素、年齢および性別に基づく血液検査である。疑いのある線維症の病因がウイルス感染である場合に推奨される第３世代（３Ｇ）のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＦＭ Ｖ ３Ｇ）は、Ａ２Ｍ、ＧＧＴ、ＰＩ、ＰＬＴ、ＡＳＴ、尿素、年齢および性別に基づく血液検査である。疑いのある線維症の病因がアルコール摂取である場合に推奨される第１世代（１Ｇ）のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＦＭ Ａ １Ｇ）は、Ａ２Ｍ、ＨＡ、ＰＩおよび年齢に基づく血液検査である。疑いのある線維症の病因がアルコール摂取である場合に推奨される第２世代（２Ｇ）のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＦＭ Ａ ２Ｇ）は、Ａ２Ｍ、ＨＡおよびＰＩに基づく血液検査である。疑いのある線維症の病因がＮＡＦＬＤ（脂肪症）である場合に推奨されるＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＦＭ Ｓ）は、ＰＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、フェリチン、グルコース、年齢および体重に基づく血液検査である。
ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒは、（ｉ）Ａ２Ｍ、ＨＡ、ＰＩ、ＰＬＴ、ＡＳＴ、尿素およびＧＧＴから選択される少なくとも６つの生物学的マーカーと、（ｉｉ）年齢および性別の２つの臨床マーカーとに基づく血液検査である。疑いのある線維症の病因がウイルス感染である場合に推奨される第２世代（２Ｇ）のＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒ（ＣＭ Ｖ ２Ｇ）は、Ａ２Ｍ、ＨＡ、ＰＩ、ＰＬＴ、ＡＳＴ、尿素、年齢および性別に基づく血液検査である。疑いのある線維症の病因がウイルス感染である場合に推奨される第３世代（３Ｇ）のＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒ（ＣＭ Ｖ ３Ｇ）は、Ａ２Ｍ、ＧＧＴ、ＰＩ、ＰＬＴ、ＡＳＴ、尿素、年齢および性別に基づく血液検査である。
一実施形態では、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒおよびＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒファミリーの検査は生物学的マーカーである尿素を含まない。
一実施形態では、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒおよびＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒファミリーの検査において組み合わせられるマーカーは、例えば、Ａ２Ｍ、ＨＡまたはＧＧＴ、ＰＩ、ＰＬＴ、ＡＳＴ、尿素などの単一のマーカーとして、あるいは、例えばＡＳＴ／ＰＬＴまたはＡＳＴ／ＡＬＴなどのマーカーの比として、あるいは、例えば、（（ＡＳＴ／ＵＬＮ（例えば、４５））／血小板）×１００または（年齢×ＡＳＴ）／（血小板×ＡＬＴ０．５）などの算術的組み合わせ（ここでは、ＵＬＮは正常上限である）として使用される。
ＣｏｍｂｉＭｅｔｅｒ（商標）またはＥｌａｓｔｏ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒまたはＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶＣＴＥ（商標）は、ＦＭファミリーの変数（上の表１に詳細が記載されている）またはＦＭファミリーの検査の結果とＶＣＴＥ（ＦＩＢＲＯＳＣＡＮ（商標））の結果との数学的組み合わせに基づく検査ファミリーである。一実施形態では、前記数学的組み合わせは二項ロジスティック回帰である。
ＩｎｆｌａＭｅｔｅｒ（商標）は、ＡＬＴ、Ａ２Ｍ、ＰＩおよび血小板を含む壊死性炎症活動を反映するＦＭファミリーのコンパニオン診断（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｅｓｔ）である。
Ａｃｔｉｔｅｓｔは、α２−マクログロブリン、ハプトグロビン、アポリポタンパク質Ａ１、総ビリルビン、ＧＧＴ、ＡＬＴ、年齢および性別に基づくＦｉｂｒｏｔｅｓｔファミリーの血液検査、すなわちコンパニオン診断である。
ＱｕａｎｔｉＭｅｔｅｒは、線維症の領域を標的にする血液検査であり、（ｉ）アルコール性肝疾患のために設計されている場合にはα２−マクログロブリン、ヒアルロン酸、プロトロンビン時間、血小板、（ｉｉ）ＮＡＦＬＤのために設計されている場合にはヒアルロン酸、プロトロンビン指数、血小板、ＡＳＴ、ＡＬＴおよびグルコース、あるいは（ｉｉｉ）慢性ウイルス肝炎のために設計されている場合にはα２−マクログロブリン、ヒアルロン酸、血小板、尿素、ＧＧＴおよびビリルビンに基づいている。
Ｐ２／ＭＳは、血小板数、単球画分および分葉核好中球画分に基づく血液検査である。
Ｅｌａｓｔｏ−Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔは、Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔの変数またはＦｉｂｒｏｔｅｓｔの結果と例えばＦｉｂｒｏｓｃａｎ（商標）によって測定されるＬＳＭ測定値との数学的組み合わせに基づく検査である。
一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも２つ変数を組み合わせる少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
肝臓病変の存在および／または重症度を評価するために最近開発された非侵襲的線維症検査の多くは、二項ロジスティック回帰における少なくとも２つの変数の組み合わせからからなる。
従って一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも３回の単一標的線維症検査を行う工程を含み、この線維症検査は、
ｉ．バイオマーカー、臨床マーカー、定性的マーカー、物理的診断法によって得られるデータ、線維症検査のスコア、イメージング法によって以前に得られた肝臓組織の画像の記述子およびそれらの数学的組み合わせを含む群から選択される変数を測定する工程と、
ｉｉ．二項ロジスティック回帰において変数を組み合わせて、それによりスコアを得る工程と
を含む。
一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも３回の単一標的線維症検査を行う工程を含み、この線維症検査は、
ｉ．バイオマーカーとも呼ばれる生物学的マーカーおよび任意に臨床マーカーおよび任意に物理的診断法によって得られるデータを測定する工程と、
ｉｉ．これらのマーカーを二項ロジスティック回帰において組み合わせて、それによりスコアを得る工程と
を含む。
バイオマーカーとも呼ばれる生物学的マーカーおよび前記生物学的マーカーを測定するための方法の例は上に示されている。臨床マーカーの例は上に示されている。物理的診断法によって得られるデータの例は上に示されている。
マーカーを測定する工程と前記マーカーを二項ロジスティック回帰において組み合わせる工程とを含む血液検査の例としては、限定されるものではないが、ＥＬＦスコア、Ｆｉｂｒｏｓｐｅｃｔ、Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ、Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ、Ｚｅｎｇスコア、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（商標）、ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒ（商標）、ＣｏｍｂｉＭｅｔｅｒ（商標）（またはＥｌａｓｔｏ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒまたはＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶＣＴＥ（商標））およびＥｌａｓｔｏ−Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔが挙げられる。
一実施形態では、単一標的線維症検査は、少なくとも２つのバイオマーカーを測定する工程と前記マーカーを二項ロジスティック回帰において組み合わせる工程とを含む。そのような単一標的線維症検査の例としては、限定されるものではないが、Ｆｉｂｒｏｓｐｅｃｔが挙げられる。
別の実施形態では、単一標的線維症検査は、少なくとも１つのバイオマーカーおよび少なくとも１つの臨床マーカーを測定する工程と、前記マーカーを二項ロジスティック回帰において組み合わせる工程とを含む。そのような単一標的線維症検査の例としては、限定されるものではないが、Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ、Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（商標）およびＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒ（商標）が挙げられる。
別の実施形態では、単一標的線維症検査は、少なくとも１つの線維症スコアまたは前記線維症検査において組み合わせられるマーカーおよび物理的診断法によって得られる少なくとも１つのデータを決定する工程を含む。そのような単一標的線維症検査の例としては、限定されるものではないが、ＣｏｍｂｉＭｅｔｅｒ（商標）（またはＥｌａｓｔｏ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒまたはＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶＣＴＥ（商標））およびＥｌａｓｔｏ−Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔが挙げられる。
一実施形態によれば、本発明の方法の工程１）で行われる単一標的線維症検査は、それぞれが異なる単一の診断標的を有するＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（商標）である。一実施形態では、前記ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（商標）は第２世代のウイルス性病因のためのＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（商標）（ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ）である。別の実施形態では、前記ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（商標）は第３世代のウイルス性病因のためのＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（商標）（ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ）である。
従って一実施形態では、本発明の非侵襲的方法の工程（１）の二項ロジスティック回帰は、上の表１に定められているＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（商標）（またはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒ（商標））の変数を組み合わせる。
一実施形態では、対象における肝硬変を含む肝線維症の重症度を評価するための非侵襲的方法は、
１）それぞれが異なる単一の診断標的を有する少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回または少なくとも７回のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒを行い、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
２）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰において組み合わせて新しい複数標的スコアを得る工程と、
３）任意に、工程２）で得られた複数標的スコアを線維症分類においてソートし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの線維症ステージ（または線維症ステージのクラス）に属するかを判定する工程と
を含む。
一実施形態では、工程１）の二項ロジスティック回帰は、線維症検査のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒファミリーまたはそれらの振動制御過渡エラストグラフィ（ＶＣＴＥ）（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎとしても知られている）との組み合わせから選択される線維症検査に対応する。
一実施形態では、本発明の方法は、線維症検査のスコアと物理的診断法によって得られるデータとを組み合わせる少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
線維症検査のスコアとは、前記線維症検査を行った場合に得られるスコアであると理解される。
線維症検査の例は上に示されている。線維症を診断する物理的方法によって得られたデータの例は上に示されている。
米国特許第２０１１／０３０６８４９号は、線維症または肝硬変の診断にとって有用な血液検査と物理データとの組み合わせについて記載している。従って、米国特許第２０１１／０３０６８４９号は、「指標」と呼ばれる新しいスコアが得られるＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒとＦｉｂｒｏｓｃａｎとの組み合わせについて記載している。特に米国特許第２０１１／０３０６８４９号は、二項ロジスティック回帰におけるＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒとＦｉｂｒｏｓｃａｎとの組み合わせについて記載している。
ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒとＦｉｂｒｏｓｃａｎとの組み合わせは、上記のようにＣｏｍｂｉＭｅｔｅｒまたはＥｌａｓｔｏ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒまたはＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶＣＴＥ（商標）としても知られている。Ｅｌａｓｔｏ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒは、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒファミリーの変数（上の表１に詳細が記載されている）またはＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒファミリーの検査の結果とＦｉｂｒｏｓｃａｎの結果との数学的組み合わせに基づく検査ファミリーである。
従って一実施形態では、本発明の方法は、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒとＦｉｂｒｏｓｃａｎとを組み合わせる少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。言い換えると、本発明の方法は、それぞれが異なる単一の標的を扱う少なくとも３つの指標を決定する工程を含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つの変数はイメージング法によって以前に得られた肝臓組織の少なくとも１つの画像の記述子である。
別の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも２つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含み、少なくとも１つの変数はイメージング法によって以前に得られた肝臓組織の少なくとも１つの画像の記述子であり、かつ少なくとも１つの他の変数は、バイオマーカー、臨床マーカー、定性的マーカー、線維症を診断する物理的方法によって得られたデータ、線維症検査のスコア、イメージング法によって以前に得られた肝臓組織の画像の記述子およびそれらの数学的組み合わせを含む群から選択される。
本発明では、イメージング法によって以前に得られた肝臓組織の画像の記述子とは、例えば顕微鏡法によって得られた画像または放射線画像などの肝臓の画像に関連するかそれらに由来する任意のコンピュータ生成データを指す。肝臓の画像は電子もしくはデジタル画像であってもよい。肝臓の画像は健康診断直後に回収されたものであってもよく、あるいは健康診断結果のスキャンされた画像であってもよい。例えば、肝臓の画像は肝生検試料から得られたものであってもよい。
米国特許第２０１６／０１２５８３号は、臓器の医用画像のコンピュータ分析に基づいてこの臓器における病変の存在および／または重症度を評価するための自動化方法について記載している。特に、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２０１６／０１２５８３号は、スコアを計算するためのそれらの組み合わせにより肝臓における病変の存在および／または重症度を評価するのに有用であり得る画像の記述子について記載している。
一実施形態では、工程１）の二項ロジスティック回帰において組み合わせられる肝臓組織の画像の少なくとも１つの記述子は、光学技術によって得られた画像の分析により得られる。一実施形態では、光学技術は、例えば電子顕微鏡法、第二高調波発生（ＳＨＧ）、多光子イメージング、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）、二光子励起蛍光（ＴＰＥＦ）、拡散光イメージングまたは事象関連光信号などの顕微鏡による物理的イメージングであってもよい。
光学もしくは電子顕微鏡法を用いて観察することができる肝臓組織の画像の記述子の例としては、限定されるものではないが、（ａ）臓器またはその断片のエッジのフラクタル次元、（ｂ）エッジの直線性の割合、（ｃ）臓器の湾曲した不規則なエッジの小結節形成（エッジの小結節形成）、（ｄ）角のある形、（ｅ）臓器またはその断片の長さ、（ｆ）生検の長さ、例えば、（ｇ）肝生検の長さ、（ｈ）数値的標本の長さ、（ｉ）臓器の高さ、（ｊ）臓器またはその断片の周長、（ｋ）臓器の生来の平均周長および（ｌ）全体周長、（ｍ）臓器の平滑化された周長、（ｎ）曲折としても参照される生来の周長と平滑化された周長との比、（ｏ）臓器の最も大きな周長、（ｐ）臓器の窪み、（ｑ）臓器またはその断片の面積、（ｒ）粒状度の割合、（ｓ）断片化、（ｔ）赤色成分に対する画像の平均強度、（ｕ）緑色成分に対する画像の平均強度、（ｖ）青色成分に対する画像の平均強度、（ｗ）線維症の面積、（ｘ）線維症のフラクタル次元、（ｙ）平均の線維症の周りの領域の割合（すなわち小結節形成の割合）、（ｚ）小結節の数、（ａａ）３０％超の線維症の周りにある小結節の数、（ａｂ）脂肪症の面積、（ａｃ）脂肪症の相対面積、（ａｄ）脂肪症のフラクタル次元、（ａｅ）門脈−中隔線維症の面積、（ａｆ）門脈−中隔線維症のフラクタル次元、（ａｇ）類洞周囲線維症の面積、（ａｈ）類洞周囲線維症のフラクタル次元、（ａｉ）小葉の類洞周囲線維症の面積、（ａｊ）線維症全体の中での類洞周囲線維症の比（すなわち、類洞周囲線維症の面積の比）、（ａｋ）赤色、（ａｌ）緑色および／または（ａｍ）青色成分での線維症染色の明度、（ａｎ）赤色、（ａｏ）緑色および／または（ａｐ）青色成分での実質染色の明度、（ａｑ）線維症と実質との明度コントラスト、（ａｒ）線維症と臓器またはその断片との明度コントラスト、（ａｓ）肝生検標本の全表面のうち星形線維症の面積（すなわち、星形線維症の総面積）、（ａｔ）門脈−中隔の表面のうちの星形線維症の面積（すなわち、星形線維症の門脈の面積）、（ａｕ）小葉領域の表面のうちの星形線維症の面積（すなわち、星形線維症の小葉の面積）、（ａｖ）門脈−中隔の数、（ａｗ）星形線維症の平均面積、（ａｘ）平均の門脈−中隔領域の面積、（ａｙ）架橋の数、（ａｚ）門脈−中隔領域間の架橋の比（すなわち、架橋のうちの門脈の比）、（ｂａ）架橋の中の線維症の面積、（ｂｂ）架橋の厚さ、（ｂｃ）架橋の周長、（ｂｄ）架橋の表面（すなわち、架橋の面積）、（ｂｅ）門脈の距離、および（ｃｍ）断片の数が挙げられる。上に列挙されている画像の記述子の定義および上に列挙されている画像の記述子を得るための方法は、米国特許出願公開第２０１６／０１２５８３号に含まれている。
本発明の別の実施形態では、工程１）の二項ロジスティック回帰において組み合わせられる肝臓組織の画像の少なくとも１つの記述子は、非光学技術によって得られる画像の分析により得られる。一実施形態では、非光学技術は、例えば、Ｘ線、超音波検査、コンピュータスキャナ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、機能的磁気共鳴画像法、断層撮影法、コンピュータＸ線体軸断層撮影法、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）または単光子放射型コンピュータ断層撮影法、例えばシンチグラフィーなどの核医学検査、光音響法、熱的方法または脳磁気図検査などの放射線撮影であってもよい。
放射線学により観察することができる肝臓組織の画像の記述子の例としては、限定されるものではないが、（ａ）臓器またはその断片のエッジのフラクタル次元、（ｂ）エッジの直線性の割合、（ｃ）臓器の湾曲した不規則なエッジの小結節形成（エッジの小結節形成）、（ｄ）角のある形、（ｅ）臓器またはその断片の長さ、（ｆ）生検の長さ、例えば、（ｇ）肝生検の長さ、（ｈ）数値的標本の長さ、（ｉ）臓器の高さ、（ｊ）臓器またはその断片の周長、（ｋ）臓器の生来の平均周長および（ｌ）全体周長、（ｍ）臓器の平滑化された周長、（ｎ）曲折としても参照される生来の周長と平滑化された周長との比、（ｏ）臓器の最も大きな周長、（ｐ）臓器の窪み、（ｑ）臓器またはその断片の面積、（ｒ）粒状度の割合、（ｔ）赤色成分に対する画像の平均強度、（ｕ）緑色成分に対する画像の平均強度、（ｖ）青色成分に対する画像の平均強度、（ａｋ）赤色、（ａｌ）緑色および／または（ａｍ）青色成分での線維症染色の明度、（ａｎ）赤色、（ａｏ）緑色および／または（ａｐ）青色成分での実質染色の明度、（ｂｆ）臓器の脂肪比、（ｂｇ）腹部の脂肪比、（ｂｈ）肝臓セグメントＩの肥大、（ｂｉ）セグメントＩの表面、（ｂｊ）肝臓セグメントＩＶの幅、（ｂｋ）セグメントＩの寸法とセグメントＩＶの寸法との比、（ｂｌ）管の厚さ、（ｂｍ）管Ｉの表面、（ｂｎ）肝臓における内部小結節形成、（ｂｏ）門（静）脈の直径、（ｂｐ）密度強度の異質性、（ｂｑ）臓器のフラクタル組織、（ｂｒ）画像の平均総密度、（ｂｓ）画像の総密度の標準偏差、（ｂｔ）画像の総密度の変動係数、（ｂｕ）画像の総密度の中央値、（ｂｖ）画像の総密度の四分位数間範囲、（ｂｗ）総密度の四分位数間範囲と画像の総密度の中央値との比、（ｂｘ）画像上の関心領域（ＲＯＩ）の平均密度、（ｂｙ）画像上のＲＯＩ密度の標準偏差、（ｂｚ）画像上のＲＯＩ密度の変動係数、（ｃａ）画像上でのＲＯＩ密度の中央値、（ｃｂ）画像上のＲＯＩ密度の四分位数間範囲、（ｃｃ）ＲＯＩ密度の四分位数間範囲と画像上のＲＯＩ密度の中央値との比、（ｃｄ）臓器またはその断片の平均表面、（ｃｅ）臓器またはその断片の全表面、臓器またはその断片の総平均表面、（ｃｆ）臓器周長と臓器表面との比、（ｃｇ）脾臓表面と肝臓表面との比、（ｃｈ）脾臓周長と肝臓周長との比、（ｃｉ）セグメントＩ表面と肝臓表面との比、（ｃｊ）アランチウス管の厚さ、（ｃｋ）アランチウス管の表面、および（ｃｌ）門脈の管の厚さが挙げられる。上に列挙されている画像の記述子の定義および上に列挙されている画像の記述子を得るための方法は、米国特許出願公開第２０１６／０１２５８３号に含まれている。
一実施形態では、工程１）の二項ロジスティック回帰において組み合わせられる肝臓組織の画像の少なくとも１つの記述子は、断面デンシトメトリー（ＴＤＭ）とも呼ばれるＣＴスキャンによって得られる画像の分析により得られる。
一実施形態では、本発明の方法は、肝臓組織の画像の少なくとも２つの記述子に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
一実施形態では、本発明の方法は、肝臓組織の画像の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０個の記述子に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
一実施形態では、本発明の方法は、門脈−中隔線維症のフラクタル次元、類洞周囲線維症のフラクタル次元、類洞周囲線維症の面積の比（％で表示）、星形線維症の総面積（％で表示）、星形線維症の門脈の面積（％で表示）、平均の門脈の距離（μｍで表示）、架橋の数、架橋のうちの門脈の比（％で表示）、平均の架橋の厚さ（μｍで表示）、平均の粒状度の割合（％で表示）、平均の小結節形成の割合（％で表示）、断片化指標（％で表示）およびエッジの直線性の割合（％で表示）から選択される肝臓組織の画像の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの記述子に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
別の実施形態では、本発明の方法は、エッジの直線性の割合、平均の線維症の周りの領域の割合（すなわち小結節形成の割合）、組織標本の全表面のうちの星形線維症の面積、架橋の数および架橋の厚さから選択される肝臓組織の画像の記述子うちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは全てに対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
別の実施形態では、本発明の方法は、平均の門脈−中隔領域の面積、架橋の周長、門脈−中隔領域間の架橋の比、平均の線維症の周りの領域の割合（すなわち小結節形成の割合）、架橋の中の線維症の面積および類洞周囲線維症のフラクタル次元から選択される肝臓組織の画像の記述子のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは全てに対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
別の実施形態では、本発明の方法は、肝臓臓器、組織またはその断片の周長、架橋の中の線維症の面積、門脈−中隔線維症のフラクタル次元、線維症全体の中での類洞周囲線維症の比、肝臓臓器、組織またはその断片の長さ、類洞周囲線維症のフラクタル次元および曲折記述子（生来の周長、平滑化された周長および両周長間の比）から選択される肝臓組織の画像の記述子のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは全てに対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
別の実施形態では、本発明の方法は、総密度の四分位数間範囲、アランチウス管の厚さ、生来の肝臓の平均周長、脾臓全体の平均周長および脾臓表面と肝臓表面との比から選択される肝臓組織の画像の記述子のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは全てに対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
別の実施形態では、本発明の方法は、総密度の四分位数間範囲、アランチウス管の厚さ、生来の肝臓の平均周長、脾臓全体の平均周長、脾臓表面と肝臓表面との比、Ｆｉｂｒｏｓｃａｎとしても知られているＶＣＴＥ、プロトロンビン時間（ＰＩ）、α２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）から選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
別の実施形態では、本発明の方法は、エッジの直線性の割合、平均の線維症の周りの領域の割合（すなわち小結節形成の割合）、肝生検標本の全表面のうち星形線維症の面積、架橋の数、架橋の厚さ、平均の門脈−中隔領域の面積、架橋の周長、門脈−中隔領域間の架橋の比、架橋の中の線維症の面積および類洞周囲線維症のフラクタル次元、臓器、組織またはその断片の周長、門脈−中隔線維症のフラクタル次元、線維症全体の中での類洞周囲線維症の比、臓器、組織またはその断片の長さ、曲折記述子（生来の周長、平滑化された周長および両周長間の比）、線維症のフラクタル次元、総密度の四分位数間範囲、アランチウス管の厚さ、生来の肝臓の平均周長、脾臓全体の平均周長、脾臓表面と肝臓表面との比およびそれらの数学的組み合わせから選択される肝臓組織の画像の記述子のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０個に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
別の実施形態では、本発明の方法は、イメージング法によって以前に得られた対象の肝臓組織の少なくとも１つの画像の少なくとも２つの記述子に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含み、前記記述子は、エッジの直線性の割合、平均の線維症の周りの領域の割合（すなわち小結節形成の割合）、ＬＢ標本の全表面のうちの星形線維症の面積、架橋の数、架橋の厚さ、平均の門脈−中隔領域の面積、架橋の周長、門脈−中隔領域間の架橋の比、架橋の中の線維症の面積および類洞周囲線維症のフラクタル次元、臓器、組織またはその断片の周長、門脈−中隔線維症のフラクタル次元、線維症全体の中での類洞周囲線維症の比、臓器、組織またはその断片の長さ、曲折記述子（生来の周長、平滑化された周長および両周長間の比）、線維症のフラクタル次元、総密度の四分位数間範囲、アランチウス管の厚さ、生来の肝臓の平均周長、脾臓全体の平均周長、脾臓表面と肝臓表面との比およびそれらの数学的組み合わせを含む群から選択される。
本発明は、上に記載されている複数標的診断検査を用いて対象における肝臓病変、好ましくは肝線維症または肝硬変を診断するための非侵襲的方法に関する。
本発明は、上に記載されている複数標的診断検査を用いて対象にける死亡、特に肝臓に関連する死亡または肝臓に関連するイベント、特に合併症のリスクを評価するための非侵襲的方法にも関する。
一実施形態によれば、対象はヒトの患者である。一実施形態では、対象は男性である。別の実施形態では、対象は女性である。一実施形態では、対象は成人である。本発明によれば、成人は年齢が１８歳、１９歳、２０歳または２１歳以上の対象である。別の実施形態では、対象は小児である。本発明によれば、小児は２１歳、２０歳、１９歳または１８歳未満の対象である。
一実施形態では、対象は、肝機能障害、慢性肝疾患、肝炎ウイルス感染（特にＢ型、Ｃ型もしくはＤ型肝炎ウイルスによって引き起こされる感染）、肝毒性、肝癌、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、自己免疫疾患、代謝性肝疾患および肝臓の続発性合併症を伴う疾患を含む群から選択される病気に罹患するリスクがあるか罹患している。
一実施形態によれば、肝毒性はアルコール誘発性肝毒性および／または薬物誘発性肝毒性（すなわち、アルコールまたは薬物のような任意の生体異物の化合物）である。
一実施形態によれば、自己免疫疾患は、自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）、原発性胆汁性肝硬変または胆管炎（ＰＢＣ）および原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）からなる群から選択される。
一実施形態によれば、代謝性肝疾患は、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病およびα１抗トリプシン欠乏症からなる群から選択される。
一実施形態によれば、前記肝臓の続発性合併症を伴う疾患はセリアック病またはアミロイドーシスである。
本発明の方法は、少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含み、ここでは二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とする。
本発明の範囲内では、「診断標的」という用語は診断検査の主な対象を指す。本発明の方法によれば、工程１）の二項ロジスティック回帰は単一標的二項検査であり、従って、それらの主な目的は標的とされる病変の存在／不存在（はい／いいえ）を評価することにある。
一実施形態によれば、診断標的は参照システムまたは参照分類のステージに対応する。別の実施形態によれば、診断標的は参照システムまたは参照分類のステージの組み合わせに対応する。
一実施形態によれば、診断標的はＭｅｔａｖｉｒ分類のステージに対応する。一実施形態では、少なくとも３回の二項ロジスティック回帰のそれぞれが異なるＭｅｔａｖｉｒステージを対象とする。別の実施形態では、本発明の方法は、ＭｅｔａｖｉｒステージＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４、すなわち、Ｆ＝０に対してＦ≧１（Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０に対応する）、Ｆ≦１に対してＦ≧２（Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１に対応する）、Ｆ≦２に対してＦ≧３（Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２に対応する）、Ｆ≦３に対してＦ＝４（Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３に対応する）を対象とする４回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
別の実施形態によれば、工程１）の二項ロジスティック回帰の少なくとも１つの診断標的は、それ以外のステージに対して１種類のステージの組み合わせ、例えばＦ０＋Ｆ１＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ２である。一実施形態では、本発明の方法は、Ｆ≧１（Ｆ０に対してＦ≧１、すなわちＦ１＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０）、Ｆ≧２（Ｆ≦１に対してＦ≧２、すなわちＦ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１）、Ｆ≧３（Ｆ≦２に対してＦ≧３、すなわちＦ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２）、Ｆ４（Ｆ≦３に対してＦ４、すなわちＦ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３）、Ｆ０＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ２およびＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ４に対してＦ３を対象とする７回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。別の実施形態では、本発明の方法は、Ｆ＝０に対してＦ≧１（Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０に対応する）、Ｆ≦１に対してＦ≧２（Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１に対応する）、Ｆ≦２に対してＦ≧３（Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２に対応する）、Ｆ≦３に対してＦ＝４（Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３に対応する）、Ｆ０＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ２、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ４に対してＦ３、Ｆ０＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１＋Ｆ２、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ４に対してＦ２＋Ｆ３およびＦ０＋Ｆ４に対してＦ１＋Ｆ２＋Ｆ３を対象とする１０回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む。
別の実施形態によれば、診断標的は、Ｍｅｔａｖｉｒ分類の壊死性炎症活動のグレード（Ｍｅｔａｖｉｒ Ａ）に対応する。一実施形態では、少なくとも３回の二項ロジスティック回帰のそれぞれが異なるＭｅｔａｖｉｒ Ａグレードを対象とする。
別の実施形態によれば、診断標的は、組織学的活動指数（ＨＡＩ）のグレードまたはステージに対応する。一実施形態では、少なくとも３回の二項ロジスティック回帰のそれぞれが異なるＨＡＩグレードまたはステージを対象とする。
別の実施形態によれば、診断標的は、Ｉｓｈａｋシステムのグレードまたはステージに対応する。一実施形態では、少なくとも３回の二項ロジスティック回帰のそれぞれが異なるＩｓｈａｋグレードまたはステージを対象とする。
別の実施形態によれば、診断標的は、ＮＡＳＨ臨床研究ネットワーク（ＮＡＳＨ−ＣＲＮ）システムとしても知られているＮＡＦＬＤに特化したＫｌｅｉｎｅｒグレード分類／ステージ分類のグレードまたはステージに対応する。一実施形態では、少なくとも３回の二項ロジスティック回帰のそれぞれが異なるＮＡＳＨ−ＣＲＮグレードまたはステージを対象とする。
本発明の別の目的は、上に記載されている複数標的診断検査を用いて対象における死亡、特に肝臓に関連する死亡または肝臓に関連するイベント、特に合併症のリスクを評価するための非侵襲的方法である。
一実施形態では、複数標的検査を行う工程を含む本発明の方法は、対象における死亡および／または肝臓に関連する死亡のリスクを評価するためのものである。
別の実施形態では、複数標的検査を行う工程を含む本発明の方法は、対象における肝臓に関連するイベント、特に合併症を評価するためのものである。
特定の一実施形態では、本発明の複数標的検査の工程１ｃ）で得られる複数標的分類は、対象における肝臓に関連する死亡のリスクを評価するために使用される。
一実施形態では、「死亡」および「死亡率」という用語はどちらも、全体的な死亡または死亡率（原因を問わない死亡または死亡率ともいえる）および／または肝臓に関連する死亡または死亡率を指す。肝臓に関連する死亡の原因の例としては、限定されるものではないが、門脈圧亢進症に関連する出血に続発する死亡、食道もしくは胃静脈瘤関連の出血、肝細胞癌、腹水、脳症、敗血症を伴う肝不全、急性もしくは慢性肝不全、肝腎症候群、肺肝症候群または他の肝代償不全に続発する死亡が挙げられる。
一実施形態では、「肝臓に関連するイベント、特に合併症」という用語は、例えば、腹水、脳症、黄疸（５０μｍｏｌ／ｌ超の血清ビリルビンとして定めることができる）、大きな食道静脈瘤の発生（好ましくは５ｍｍ以上の直径および／または好ましくは食道外周の２５％以上の直径を有する）、静脈瘤出血、胃腸出血（例えば門脈圧亢進症に起因するものなど）、肝腎症候群、肺肝症候群、肝細胞癌、肝移植、食道静脈瘤、所定の閾値以上の門脈圧亢進症（例えば、１０ｍｍＨｇ以上または１２ｍｍＨｇ以上の肝静脈圧勾配など）、深刻な感染（例えば、敗血症性ショックなど）などの特定の治療法またはケアを必要とする肝臓に関連するイベントまたは合併症を指す。
一実施形態では、「肝臓に関連するイベント、特に合併症」という用語は、例えば線維性の非肝硬変患者における肝硬変の出現などの患者における肝臓疾患もしくは障害の進行、または患者が所定の閾値を超えていること（例えば、０．９８２以上のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの結果または１４ｋＰａ以上のＦｉｂｒｏｓｃａｎの結果など）を指す。
本発明によれば、死亡（原因を問わない死亡および肝臓に関連する死亡を含む）は、肝臓に関連するイベント、特に合併症を指さない。
一実施形態では、本発明の方法は、患者における最初の肝臓に関連するイベント、特に合併症を予測するためのものである。
本発明の一実施形態では、本発明の予後判定方法は、評価日の時点で少なくとも３ヶ月、好ましくは３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年または１０年の期間内に生じる死亡または肝臓に関連するイベントのリスクを評価するためのものである。
有利なことに一実施形態では、本発明は、
１）線維症検査のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒファミリーの変数に対してＭｅｔａｖｉｒステージＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４を標的にする４回の二項ロジスティック回帰を行い、それにより４つのスコアを得る工程と、
２）その４つのスコアを多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰において組み合わせて単一の複数標的スコアを得る工程と、
３）任意に、工程２）で得られた複数標的スコアを線維症分類において位置付けし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの線維症ステージのクラスに属するかを判定する工程と
とを含む、対象における肝硬変を含む肝線維症の存在および重症度を評価するための非侵襲的方法に関する。
従って、有利なことに一実施形態では、本発明は、
１）ＭｅｔａｖｉｒステージＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４、すなわち、Ｆ＝０に対してＦ≧１（Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０に対応する）、Ｆ≦１に対してＦ≧２（Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１に対応する）、Ｆ≦２に対してＦ≧３（Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２に対応する）、Ｆ≦３に対してＦ＝４（Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３に対応する）を標的にする４回のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒを行い、それにより４つのスコアを得る工程と、
２）その４つのスコアを多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰において組み合わせて単一の複数標的スコアを得る工程と、
３）任意に、工程２）で得られた複数標的スコアを線維症分類において位置付けし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの線維症ステージ（または線維症ステージのクラス）に属するかを判定する工程と
を含む、対象における肝硬変を含む肝線維症を診断するための非侵襲的方法に関する。
一実施形態では、本発明は、
１）Ｍｅｔａｖｉｒステージの組み合わせ：Ｆ＝０に対してＦ≧１（Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０に対応する）、Ｆ≦１に対してＦ≧２（Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１に対応する）、Ｆ≦２に対してＦ≧３（Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２に対応する）、Ｆ≦３に対してＦ＝４（Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３に対応する）、Ｆ０＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ２、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ４に対してＦ３を標的にする７回のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒを行い、それにより７つのスコアを得る工程と、
２）その７つのスコアを多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰において組み合わせて単一の複数標的スコアを得る工程と、
３）任意に、工程２）で得られた複数標的スコアを線維症分類において位置付けし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの線維症ステージ（または線維症ステージのクラス）に属するかを判定する工程と
を含む、対象における肝硬変を含む肝線維症を診断するための非侵襲的方法に関する。
一実施形態では、本発明は、
１）Ｍｅｔａｖｉｒステージの組み合わせ：Ｆ＝０に対してＦ≧１（Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０に対応する）、Ｆ≦１に対してＦ≧２（Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１に対応する）、Ｆ≦２に対してＦ≧３（Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２に対応する）、Ｆ≦３に対してＦ＝４（Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３に対応する）、Ｆ０＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ２、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ４に対してＦ３、Ｆ０＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１＋Ｆ２、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ４に対してＦ２＋Ｆ３およびＦ０＋Ｆ４に対してＦ１＋Ｆ２＋Ｆ３を標的にする１０回のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒを行い、それにより１０個のスコアを得る工程と、
２）その１０個のスコアを多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰において組み合わせて単一の複数標的スコアを得る工程と、
３）任意に、工程２）で得られた複数標的スコアを線維症分類において位置付けし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの線維症ステージ（または線維症ステージのクラス）に属するかを判定する工程と
を含む、対象における肝硬変を含む肝線維症を診断するための非侵襲的方法に関する。
別の実施形態では、本発明は、
１）ＶＣＴＥ（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎ（商標）としても知られている）によって得られる少なくとも１つの肝硬度測定値に対して、ＭｅｔａｖｉｒステージＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４、すなわちＦ＝０に対してＦ≧１（Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０に対応する）、Ｆ≦１に対してＦ≧２（Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１に対応する）、Ｆ≦２に対してＦ≧３（Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２に対応する）、Ｆ≦３に対してＦ＝４（Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３に対応する）を標的にする４回の二項ロジスティック回帰を行い、それにより４つのスコアを得る工程と、
２）その４つのスコアを多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰において組み合わせて単一の複数標的スコアを得る工程と、
３）任意に、工程２）で得られた複数標的スコアを線維症分類において位置付けし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの線維症ステージ（または線維症ステージのクラス）に属するかを判定する工程と
を含む、対象における肝硬変を含む肝線維症の存在および重症度を評価するための非侵襲的方法に関する。
一実施形態では、本発明は、
１）ＶＣＴＥ（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎ（商標）としても知られている）によって得られる少なくとも１つの肝硬度測定値に対して、それぞれがＭｅｔａｖｉｒステージの組み合わせ、すなわちＦ＝０に対してＦ≧１（Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０に対応する）、Ｆ≦１に対してＦ≧２（Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１に対応する）、Ｆ≦２に対してＦ≧３（Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２に対応する）、Ｆ≦３に対してＦ＝４（Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３に対応する）、Ｆ０＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ２、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ４に対してＦ３である異なる単一の診断標的を対象とする７回の二項ロジスティック回帰を行い、それにより７つのスコアを得る工程と、
２）その７つのスコアを多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰において組み合わせて単一の複数標的スコアを得る工程と、
３）任意に、工程２）で得られた複数標的スコアを線維症分類において位置付けし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの線維症ステージ（または線維症ステージのクラス）に属するかを判定する工程と
を含む、複数標的診断検査を用いて対象における肝硬変を含む肝線維症を診断するための非侵襲的方法に関する。
一実施形態では、本発明は、
１）ＶＣＴＥ（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎ（商標）としても知られている）によって得られる少なくとも１つの肝硬度測定値に対して、それぞれがＭｅｔａｖｉｒステージの組み合わせ、すなわちＦ＝０に対してＦ≧１（Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０に対応する）、Ｆ≦１に対してＦ≧２（Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１に対応する）、Ｆ≦２に対してＦ≧３（Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２に対応する）、Ｆ≦３に対してＦ＝４（Ｆ４に対してＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３に対応する）、Ｆ０＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ２、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ４に対してＦ３、Ｆ０＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１＋Ｆ２、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ４に対してＦ２＋Ｆ３およびＦ０＋Ｆ４に対してＦ１＋Ｆ２＋Ｆ３である異なる単一の診断標的を対象とする１０回の二項ロジスティック回帰を行い、それにより１０個のスコアを得る工程と、
２）その１０個のスコアを多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰において組み合わせて単一の複数標的スコアを得る工程と、
３）任意に、工程２）で得られた複数標的スコアを線維症分類において位置付けし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの線維症ステージ（または線維症ステージのクラス）に属するかを判定する工程と
を含む、対象における肝硬変を含む肝線維症を診断するための非侵襲的方法に関する。
一実施形態では、本発明の方法はコンピュータで実行される。
一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの変数に対する少なくとも３回の二項ロジスティック回帰から得られる少なくとも３つのスコアの多重線形回帰における組み合わせから得られる単一の複数標的スコア値を計算するように構成されたソフトウェアを含むマイクロプロセッサにより実施し、ここでは二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とする。
従って、本発明の別の目的は本発明の方法を実施するためのコンピュータソフトウェアである。
従って、本発明は、上に記載されている複数標的診断検査を用いて対象における肝線維症または肝硬変を診断するための非侵襲的方法を実行するためのマイクロプロセッサにも関する。
本発明は、本発明の非侵襲的方法を時間間隔で実施し、それにより患者ごとに時間間隔で得られた複数標的スコアの値を比較することにより前記患者の漸進的変化を評価する工程を含む、患者を監視するための方法にも関する。
一実施形態では、本発明の非侵襲的方法は、３ヶ月ごと、６ヶ月ごと、９ヶ月ごと、１２ヶ月ごと、１５ヶ月ごと、１８ヶ月ごと、２４ヶ月ごとまたは３６ヶ月ごとに行う。
本発明は、（ｉ）本発明の非侵襲的方法を実施する工程と、（ｉｉ）患者ごとに得られた複数標的スコアの値に従って患者に適し得る医薬組成物をデータベースの中で選択する工程とを含む、肝疾患または肝臓病に罹患している患者に関する医学的判断を助けるためのツールにも関する。
一実施形態では、本発明の方法は、患者への治療薬の投与前と前記患者への治療薬の投与中または後に少なくとも１回実施する。
別の実施形態では、本発明の方法は、患者への治療薬の投与前と前記患者への治療薬の投与中に規則的な時間間隔で実施する。
一実施形態では、本発明の方法は１人の患者に対して年に１回実施する。別の実施形態では、本発明の方法は、１人の患者に対して３ヶ月ごと、６ヶ月ごと、９ヶ月ごと、１２ヶ月ごと、１５ヶ月ごと、１８ヶ月ごと、２４ヶ月ごとまたは３６ヶ月ごとに繰り返す。
本発明は、例えば肝線維症または肝硬変などの肝臓病変に罹患しているものとして特定された個体にとって適した患者ケアを実施するための方法にも関する。
従って、本発明は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程、および
２）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを多重線形回帰において組み合わせて対象における肝臓病変の存在および重症度を評価するのに有用な新しい複数標的スコアを得る工程
によって、上に記載されているように個体における肝臓病変、好ましくは肝臓線維症または肝硬変の存在および重症度を判定する工程と、
肝臓病変、好ましくは肝線維症または肝硬変の重症度に従って構成された患者ケアを実施する工程と
を含む、肝臓病変、好ましくは肝線維症または肝硬変に罹患している個体を治療するための方法に関する。
一実施形態では、本発明の方法は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程、
２）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰において組み合わせて新しい複数標的スコアを得る工程、および
３）工程２）で得られた複数標的スコアを肝臓病変ステージまたはグレードの分類において位置付けし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの病変ステージまたはグレードに属するかを判定する工程
によって、上に記載されているように個体における肝臓病変、好ましくは肝臓線維症または肝硬変の存在および重症度を判定する工程と、
肝臓病変、好ましくは肝線維症または肝硬変の重症度に従って構成された患者ケアを実施する工程と
を含む。
一実施形態では、本発明の方法は、
１）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、その二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程、
１ａ）工程１）で得られた少なくとも３つのスコアを含む少なくとも別の二項ロジスティック回帰を行い、前記二項ロジスティック回帰の診断標的は臨床的に関連する二項標的であり、それにより、工程１）の二項ロジスティック回帰によって得られたもののうち有意な単一標的スコアを特定し、前記有意な単一標的スコアは前記臨床的に関連する二項診断標的に独立して関連づけられている工程、
１ｂ）工程１ａ）において有意であることが分かった単一標的二項ロジスティック回帰のそれぞれのために肝臓病変ステージまたはグレードの分類を導出する工程、
１ｃ）工程１ｂ）の分類を組み合わせて肝臓病変ステージまたはグレードの複数標的分類を作成する工程、および
２）工程１ａ）で特定された有意なスコアを多重線形回帰、好ましくは独立変数の段階的選択による多重線形回帰において組み合わせて単一の複数標的スコアを得て、それにより対象における肝臓病変の存在および重症度を評価する工程
によって上に記載されているように個体における肝臓病変、好ましくは肝臓線維症または肝硬変の存在および重症度を判定する工程と
肝臓病変、好ましくは肝線維症または肝硬変の重症度に従って構成された患者ケアを実施する工程と
を含む。
一実施形態では、個体はＭｅｔａｖｉｒステージＦ１の肝線維症に罹患していると判定されており、その適した患者ケアは、線維症重症度を一定間隔で評価することにより前記個体を監視することからなる。
一実施形態では、線維症重症度を３ヶ月ごと、６ヶ月ごと、９ヶ月ごと、１２ヶ月ごと、１５ヶ月ごと、１８ヶ月ごと、２４ヶ月ごとまたは３６ヶ月ごとに評価する。
一実施形態では、個体はＭｅｔａｖｉｒステージＦ≧２の肝線維症に罹患していると判定されており、それに適した患者ケアは、遅れることなく少なくとも１種の治療薬を投与すること、または早期の予防的もしくは治癒的処置を適用するために合併症スクリーニングプログラムを開始することからなる。
一実施形態では、個体はＭｅｔａｖｉｒステージＦ≧３の深刻な肝線維症に罹患していると判定されており、それに適した患者ケアは、遅れることなく少なくとも１種の治療薬を投与すること、および任意に早期の予防的もしくは治癒的処置を適用するために合併症スクリーニングプログラムを開始することからなる。
一実施形態では、個体は肝硬変、すなわちＭｅｔａｖｉｒステージＦ４（Ｆ＝４）の肝線維症に罹患していると判定されており、それに適した患者ケアは、遅れることなく少なくとも１種の治療薬を投与すること、および治癒的処置を適用するために合併症スクリーニングプログラムを開始することからなる。
治療薬の例としては、限定されるものではないが、ベザフィブラート、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルシステイン、シリマリン、ホスファチジルコリン、Ｎ−アセチルシステイン、レスベラトロール、ビタミンＥ、単独またはトコフェロールと組み合わせたペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｙｐｈｉｌｌｉｎｅ）（またはペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｙｆｉｌｌｉｎｅ））、単独またはビタミンＥと組み合わせたピオグリタゾン、ロバザ（ｌｏｖａｚａ）（魚油）、単独または抗ウイルス療法（例えばＩＦＮ）と組み合わせたＰＰＣ、ＩＮＴ７４７、ペグインターフェロン２ｂ（ペグ化ＩＦＮα−２ｂ）、インフリキシマブとリバビリンとの組み合わせ、幹細胞移植（特にＭＳＣ移植）、カンデサルタン、ロサルタン、テルミサルタン、イルベサルタン、アンブリセンタン、ＦＧ−３０１９、コミカンソウ、Ｆｕ Ｚｈｅｎｇ Ｈｕａ Ｙｕ、ワルファリン、インスリン、コルヒチン、コルチコステロイド、ナルトレキソン、ＲＦ２６０３３０、ソラフェニブ、メシル酸イマチニブ、ニロチニブ、ピルフェニドン、ハロフジノン、ポラオレジン（ｐｏｌａｏｒｅｚｉｎ）、グリオトキシン、スルファサラジン、リモナバン、シムツズマブ（ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、ＧＲ−ＭＤ−０２、ボセプレビル、テラプレビル、シメプレビル、ソホスブビル、ダクラタスビル、エルバスビル、グラゾプレビル、ベルパタスビル、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、クレブジン、ＡＮＡ３８０、ザダキシン（ｚａｄａｘｉｎ）、ＣＭＸ １５７、ＡＲＢ−１４６７、ＡＲＢ−１７４０、ＡＬＮ−ＨＢＶ、ＢＢ−ＨＢ−３３１、Ｌｕｎａｒ−ＨＢＶ、ＡＲＯ−ＨＢＶ、Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂ、ＧＬＳ４、ＮＶＲ ３−７７８、ＡＩＣ ６４９、ＪＮＪ５６１３６３７９、ＡＢＩ−Ｈ０７３１、ＡＢ−４２３、ＲＥＰ ２１３９、ＲＥＰ ２１６５、ＧＳＫ３２２８８３６、ＧＳＫ３３３８９４０４、ＲＮａｓｅＨ阻害剤、ＧＳ ４７７４、ＩＮＯ−１８００、ＨＢ−１１０、ＴＧ１０５０、ＨｅｐＴｃｅｌｌ、ＴｏｍｅｇａＶａｘ ＨＢＶ、ＲＧ７７９５、ＳＢ９２００、ＥＹＰ００１、ＣＰＩ ４３１−３２、トピラマート、ジスルフィラム、ナルトレキソン、アカンプロセート、バクロフェン、メサドン、ブプレノルフィン、オルリスタット、メトホルミン、アトルバスタチン、エゼチミン（ｅｚｅｔｉｍｉｎｅ）、ＡＲＢ、ＥＰＬ、ＥＰＡ−Ｅ、多系統バイオティクス（ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ブルガリカス）、オベチコール酸、エラフィブラノール（ＧＦＴ５０５）、ＤＵＲ−９２８、ＧＲ−ＭＤ−０２、アラムコール（ａｒａｍｃｈｏｌ）、ＲＧ−１２５、セニクリビロック（ＣＶＣ）、ロシグリタゾン、ＭＳＤＣ−０６０２Ｋ、ＧＳ−９６７４、ＬＪＮ４５２、ＬＭＢ７６３、ＥＤＰ−３０５、エラフィブラノール、サログリタザル、ＩＶＡ３３７、ＮＧＭ２８２、ＰＦ−０５２３１０２３、ＢＭＳ−９８６０３６、アラムコール、ボリキシバット、ＧＳ−０９７６、リラグルチド、セマグルチド、エキセナチド、タスポグルチド、タウリン、ポリエンホスファチジルコリン、ＭＧＬ−３１９６、ビタミンＣ、ＧＳ−４９９７、シタグリプチン、アログリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、ＰＸＳ−４７２８Ａ、ＶＬＸ−１０３、高度免疫牛初乳、ナルメフェン、エムリカサン（ｅｍｒｉｃａｓａｎ）、マリアアザミ、プロバイオティクスおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
一実施形態では、少なくとも１種の治療薬は、シムツズマブ、ＧＲ−ＭＤ−０２、幹細胞移植（特にＭＳＣ移植）、コミカンソウ、Ｆｕ Ｚｈｅｎｇ Ｈｕａ Ｙｕ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルシステイン、シリマリン、ホスファチジルコリン、Ｎ−アセチルシステイン、レスベラトロール、ビタミンＥ、ロサルタン、テルミサルタン、ナルトレキソン、ＲＦ２６０３３０、ソラフェニブ、メシル酸イマチニブ、ニロチニブ、ＩＮＴ７４７、ＦＧ−３０１９、オルチプラズ、ピルフェニドン、ハロフジノン、ポラオレジン、グリオトキシン、スルファサラジン、リモナバンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗線維化薬（ａｎｔｉｆｉｂｒｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ）である。
一実施形態では、少なくとも１種の治療薬は、肝線維症の原因である根本的原因を治療するため、および／または肝線維症を含む肝線維症の原因である根本的原因に伴う症状を寛解または軽減するためのものである。
一実施形態では、肝線維症の原因である根本的原因は、肝炎ウイルス感染、肝毒性、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、自己免疫疾患、代謝性肝疾患および肝臓の続発性合併症を伴う疾患からなる群から選択される。
一実施形態では、肝線維症の原因である根本的原因はウイルス感染であり、少なくとも１種の治療薬は、インターフェロン、ペグインターフェロン２ｂ（ペグ化ＩＦＮα−２ｂ）、インフリキシマブ、リバビリン、ボセプレビル、テラプレビル、シメプレビル、ソホスブビル、ダクラタスビル、エルバスビル、グラゾプレビル、ベルパタスビル、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、クレブジン、ＡＮＡ３８０、ザダキシン、ＣＭＸ １５７、ＡＲＢ−１４６７、ＡＲＢ−１７４０、ＡＬＮ−ＨＢＶ、ＢＢ−ＨＢ−３３１、Ｌｕｎａｒ−ＨＢＶ、ＡＲＯ−ＨＢＶ、Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂ、ＧＬＳ４、ＮＶＲ ３−７７８、ＡＩＣ ６４９、ＪＮＪ５６１３６３７９、ＡＢＩ−Ｈ０７３１、ＡＢ−４２３、ＲＥＰ ２１３９、ＲＥＰ ２１６５、ＧＳＫ３２２８８３６、ＧＳＫ３３３８９４０４、ＲＮａｓｅＨ阻害剤、ＧＳ ４７７４、ＩＮＯ−１８００、ＨＢ−１１０、ＴＧ１０５０、ＨｅｐＴｃｅｌｌ、ＴｏｍｅｇａＶａｘ ＨＢＶ、ＲＧ７７９５、ＳＢ９２００、ＥＹＰ００１、ＣＰＩ ４３１−３２およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態では、肝線維症の原因である根本的原因は過剰なアルコール摂取であり、少なくとも１種の治療薬は、トピラマート、ジスルフィラム、ナルトレキソン、アカンプロセートおよびバクロフェンからなる群から選択される。
一実施形態では、肝線維症の原因である根本的原因は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）であり、少なくとも１種の治療薬は、テルミサルタン、オルリスタット、メトホルミン、ピオグリタゾン、アトルバスタチン、エゼチミン、ビタミンＥ、シリマリン（ｓｙｌｉｍａｒｉｎｅ）、ペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｙｆｙｌｌｉｎｅ）、ＡＲＢ、ＥＰＬ、ＥＰＡ−Ｅ、多系統バイオティクス（ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ブルガリカス）、シムツズマブ、オベチコール酸、エラフィブラノール（ＧＦＴ５０５）、ＤＵＲ−９２８、ＧＲ−ＭＤ−０２、アラムコール、ＲＧ−１２５、セニクリビロック（ＣＶＣ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態では、肝線維症の原因である根本的原因は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、好ましくは線維性のＮＡＳＨであり、少なくとも１種の治療薬は、インスリン増感剤（ロシグリタゾン、ピオグリタゾンおよびＭＳＤＣ−０６０２Ｋなど）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）作動薬（オベチコール酸（ＯＣＡともいう）、ＧＳ−９６７４、ＬＪＮ４５２、ＬＭＢ７６３およびＥＤＰ−３０５など）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α／δ（ＰＰＡＲα／δ）作動薬（エラフィブラノール、サログリタザルおよびＩＶＡ３３７など）、線維芽細胞増殖因子１９（ＦＧＦ１９）類似体（ＮＧＭ２８２など）、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）類似体（ＰＦ−０５２３１０２３など）、組換え型ＦＧＦ２１（ＢＭＳ−９８６０３６など）、ステアロイル−補酵素Ａデサチュラーゼ１（ＳＣＤ１）阻害剤（アラムコールなど）、頂端側ナトリウム依存性胆汁酸輸送（ＡＳＢＴ）阻害剤（ボリキシバットなど）、アセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）阻害剤（ＧＳ−０９７６など）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）類似体（リラグルチド、セマグルチド、エキセナチドおよびタスポグルチドなど）、ウルソデオキシコール酸およびノルウルソデオキシコール酸（ＮｏｒＵＤＣＡ）、タウリン、ポリエンホスファチジルコリン、甲状腺ホルモン受容体（ＴＨＲ）β−作動薬（ＭＧＬ−３１９６など）、抗酸化剤（ビタミンＥおよびビタミンＣなど）、アポトーシスシグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）阻害剤（ＧＳ−４９９７など）、ＤＰＰ−４阻害剤（シタグリプチン、アログリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチンおよびリナグリプチンなど）、血管接着タンパク質−１（ＶＡＰ−１）阻害剤（ＰＸＳ−４７２８Ａなど）、ホスホジエステラーゼ−４（ＰＤＥ−４）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ−１型受容体拮抗薬（ロサルタンおよびテルミサルタンなど）、抗炎症性化合物（セニクリビロック、ＶＬＸ−１０３（経口ペンタミジン）および高度免疫牛初乳）など、トール様受容体４拮抗薬（ナルメフェンなど）、カスパーゼ阻害剤（エムリカサンなど）、ペントキシフィリン、Ｓ−アデノシルメチオニン、マリアアザミおよびプロバイオティクスからなる群から選択される。
本発明の別の目的は、対象における肝硬変を含む肝線維症の治療に使用するための少なくとも１種の治療薬であり、ここでは、治療される対象は上に記載されているように特定され、その治療は、前記対象における肝線維症の重症度および／または前記対象における肝線維症の原因である根本的原因に応じて上に記載されているようにその対象に合わせて構成される。
複数標的検査は、いくつかの単一標的検査（すなわち、二項ロジスティック回帰）を行う工程と、これらの相補的な単一標的検査を組み合わせる工程とを含む。従って、それらはいくつかの診断標的、すなわちいくつかの線維症ステージを扱うように構成されている。
複数標的検査の主な利点は、それらの診断性能における有意な向上、特に全体的な正確性における有意な向上である。
本発明の複数標的検査から導出される複数標的の組み合わせは、対象の肝臓に関連する死亡のリスク、対象の肝臓に関連しない死亡または対象における合併症などの肝臓に関連するイベントのリスクを評価するためにも使用することができる。
実施例１では、本出願人は、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＭＦＭｓＶ２Ｇ）の肝硬変のためのＡＵＲＯＣが対応するＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒと比較して有意に増加することを実証している。肝硬変診断では、ＭＦＭの比較対象（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）はＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒでありＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒではないが、それはＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒが複数標的診断のための過去の基準であったからである。言い換えると、ＭＦＭｓを構築する場合、その目的は、ＭＦＭｓがＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒの肝硬変のための診断性能をＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒに追加することであった。全てのＭｅｔａｖｉｒ線維症ステージを検討すると、Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標によって評価される性能は、特に第３世代の大部分の公開されている単標的検査（ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒおよびＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒ）と比較してＭＦＭｓでは有意に向上する。複数のクラスにおける線維症分類に関しては、参照としての公開されているＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ検査による８７．６％に対して、新しいＭＦＭｓＶ２Ｇ検査により９２．３％の正確性が得られた。これは、慢性肝炎Ｃ検証集団（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）（４．４％）において持続された正しい分類における統計的に有意な４．７％の増加に対応する。これらの増加はＭＦＭｓＶ３Ｇ検査を用いた場合にさらに顕著であり、それぞれ５．９％および７．１％であった。この正確性の増加は、異なる肝疾患病因（慢性肝炎Ｂ、ＨＩＶ／慢性肝炎Ｃ、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性肝疾患）を代表する他の検証集団でさらに観察された。
さらに、本出願人は、他の血液検査と比較した場合に、ＭＦＭｓは肝硬変診断のために慢性肝炎Ｃにおいて評価される全ての検査よりも有意に優れており、これはＡＰＲＩ、Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ、ＺｅｎｇスコアおよびＨｅｐａｓｃｏｒｅに対する新しい当然の利点（過去の対応する単標的検査に関して）である（ＭＦＭｓＶ３Ｇを用いる場合を除くが、ＭＦＭｓＶ３ＧはＨｅｐａｓｃｏｒｅに対してＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標において有意な増加を得たので有利なままである）ことを示す。また他の病因では、ＭＦＭｓは肝硬変診断および／またはＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標のために慢性肝炎Ｃにおいて評価される全ての血液検査よりも有意に優れている（Ｈｅｐａｓｃｏｒｅに対するものを除く）。これはＦｉｂｒｏｔｅｓｔとＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇとの比較およびＨｅｐａｓｃｏｒｅとＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇとの比較に関する新しい利点を意味する。実際には、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３ＧはＨｅｐａｓｃｏｒｅよりも有意に劣るものであり、ＭＦＭｓＶ３ＧはＨｅｐａｓｃｏｒｅとは有意に異ならなかった。
重要なことに、実施例１に示されている複数標的診断検査の構築は、半定量的（順序）基準、例えば放射線学における重症度スコアに基づく任意の非侵襲的診断検査に適用することができる。
実施例２では、本出願人は、参照としての公開されているＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ検査による８７．６％に対して新しいＭＦＭｃ検査により得られた９２．７％の正確性について記載している。正しい分類における５．１％の増加は、１２．３％のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇにより誤分類された患者の割合における４１．１％の減少に対応する。この５％の正確性の増加は、異なる肝疾患病因（慢性肝炎Ｃ、ＨＩＶ／慢性肝炎Ｃ、慢性肝炎Ｂ）を代表する３つの検証集団においてさらに観察される。
別の利点は、複数標的がＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２ＧおよびＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇのような以前に公開された相補的な単標的検査を組み合わせるための自動化手段である点である。このように、複数標的は肝硬変のような重要な診断標的のためにより高い正確性を提供する。従って、ＭＦＭｃは個体の患者線維症ステージに合わせてより良好に構成されている。
肝硬変診断に関しては、非侵襲的検査の基準はＶＣＴＥなどの肝臓の弾性率測定法である。実施例１に示されている結果は、ＶＣＴＥが実際にＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇよりも高い有意差で肝硬変専用の血液検査（ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ）よりも優れていることを示している。ＭＦＭｃはこの欠点をなくし、評価される全ての病因におけるＶＣＴＥの正確性よりも有意ではないが優れている正確性を提供する。
主な臨床的診断標的が肝硬変である場合、単一のカットオフを用いる単一標的検査による二項診断は十分であることを立証することができた。但し、単一のカットオフを用いる二項診断手法の使用には２つの主な限界がある。第１に、肝硬変の非侵襲的診断のための基準であるＶＣＴＥ（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎとしても知られている）は、臨床医によって使用される１４ｋＰａの通常のカットオフを用いた場合、慢性肝炎Ｃでは肝硬変のための陽性予測値（ＰＰＶ）がたった５７％であった（Ｃａｌｅｓ Ｐ．ら．「肝硬変診断および肝線維症ステージ分類：肝硬変血液検査に対する過渡弾性率測定法（Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｓｔａｇｉｎｇ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｙ Ｖｅｒｓｕｓ Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ Ｂｌｏｏｄ Ｔｅｓｔ）．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０１５；４９：５１２−５１９）。実施例に示されているＭＦＭｃ分類の目的は、肝硬変診断の３つのカテゴリ、すなわち確定的な肝硬変（Ｆ４、ＭＦＭｃＶ２Ｇの肝硬変のための陽性予測値（ＰＰＶ）：９６％、結果は示されていない）または初期肝硬変（Ｆ３／４、肝硬変ＰＰＶ：６７％）のための２つの確定的クラスおよび検査結果をＶＣＴＥまたはイメージングおよびより緻密な経過観察などの他の利用可能な検査の観点において検討する必要がある疑わしい肝硬変のための残りのクラス（Ｆ３±１、肝硬変ＰＰＶ：２１％）を提供することである。二項肝硬変診断の第２の限界は、非肝硬変結果が臨床医に大きな不確定性を残すことである。特に、それらは、緻密な経過観察またはより積極的な介入を必要とする深刻な線維症を有する患者を有意な線維症を有していない患者から容易に区別することができない。その点において、複数標的検査を用いて得ることができるような詳細かつ高性能な分類は、はるかに情報価値がある。
実施例２では本出願人は、ＭＦＭｃ分類が特に４つの線維症クラス、すなわちＦ２±１、Ｆ３±１、Ｆ３／４およびＦ４間の良好な予後識別を提供することも実証している。ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇと比較してＦ３／４とＦ４クラスとの予後識別が向上する。ＭＦＭｃ分類は、１つのクラス当たり最大２つのＦステージを有する単純化された分類である。徹底的な分類（１つのクラス当たり最大３つのＦ）は、単純化された分類（１つのクラス当たり最大２つのＦ）と比較してより良好な正確性という明白な利点を有する。但し、後者はより良好な精度および予後判定を提供する。従って、単純化された分類は臨床業務にとって十分であるように思われる。徹底的な分類という関心の欠如は、組織学的病期分類による誤分類の原因（試料サイズおよび観察者の読取り）に起因し得る。これは非組織学的病期分類によってではなく、侵襲的検査によるより良好な予後判定によって強固にされる（Ｎａｖｅａｕ Ｓ．ら．アルコール性肝疾患を有する患者における線維症の非侵襲的バイオマーカーの診断および予後値（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００９；４９：９７−１０５）。最後に、予後判定はＦ２±１またはさらにはＦ２／３クラスによってのみ有意に変化し、このようにして最小分類を４つのクラス、すなわちＦ０／１（有意でない線維症）、Ｆ２／３（有意な線維症）、Ｆ３／４（初期の肝硬変）およびＦ４（確定的な肝硬変）に分けることができる。
非侵襲的検査の線維症分類を示す図である。ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２ＧおよびＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇは０〜１の範囲の対応する検査値から導出される。ＶＣＴＥの目盛は２．５〜７５ｋＰａの範囲である。複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＭＦＭｃ）分類は独特な検査スコアから導出されないので図解の限界を有する（すなわち、対応する数値目盛が存在しない）。線維症クラスは、各矩形内の対応するＭｅｔａｖｉｒ Ｆステージによって示されている。 Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＭＦＭｃ）の構築を示す図の組み合わせである。パネルＡは４つの異なる統計学的工程を示す。工程１（ＢＬＲ：二項ロジスティック回帰）は、ＦＭＦ≧１、ＦＭＦ≧２、ＦＭＦ≧３およびＦＭＦ＝４と呼ばれる４つの単一標的検査を含む例を記述している。パネルＢはパネルＡの工程４の構築に関する詳細を示し、これにより単一標的検査分類の一部を組み込むことによって複数標的検査の最終的な組み合わせられた分類が得られた。これは、４つの統計学的下位工程、すなわち１）ＦＭＦ≧１分類の一部とＦＭＦ≧２分類の一部との正確性の比較、２）ＦＭＦ≧１分類の一部とＦＭＦ≧２分類の一部との組み合わせ、３）ＦＭＦ≧１＋ＦＭＦ≧２分類の一部とＦＭＦ＝４分類の一部との正確性の比較、４）ＦＭＦ≧１＋ＦＭＦ≧２分類の一部とＦＭＦ＝４分類との一部との組み合わせ（すなわち複数標的検査分類）を含んでいた。図は単一標的検査のスコアカットオフを示す。 検査分類による慢性肝疾患の多岐にわたる原因における肝臓に関連する死亡率のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示すグラフの組み合わせである（検証集団＃４：１５５９人の患者）：（Ａ）ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ。垂直のダッシュは打ち切り患者を示す。 検査分類による慢性肝疾患の多岐にわたる原因における肝臓に関連する死亡率のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示すグラフの組み合わせである（検証集団＃４：１５５９人の患者）：（Ｂ）徹底的な複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＭＦＭｃ）。垂直のダッシュは打ち切り患者を示す。 検査分類による慢性肝疾患の多岐にわたる原因における肝臓に関連する死亡率のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示すグラフの組み合わせである（検証集団＃４：１５５９人の患者）：（Ｃ）単純化された複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＭＦＭｃ）。垂直のダッシュは打ち切り患者を示す。 ３８０９人の患者の集団全体においてＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ（ＦＭ２Ｇ）、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ（ＦＭ３Ｇ）、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ（ＭＦＭ２Ｇ）およびＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ（ＭＦＭ３Ｇ）により得られた正確に分類された患者の割合を示すグラフである。矢印は正確に分類された患者の割合の一対比較に関連づけられたｐ値を示す。実線は有意差を示し、破線は非有意差を示す。
以下の実施例によって本発明をさらに例示する。
実施例１：複数標的スコアのために構築された複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＭＦＭｓ）
患者および方法
集団
最初に計２５８９人の患者を本研究に含めた。１０１２人の患者（導出集団（ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ））からのデータを用いて複数標的診断検査を開発し、１５７７人の患者（検証集団＃１〜＃５）において外部検証を行った。
異なる病因を有する慢性肝疾患に罹患している１２２０人の患者を含む検証集団（検証集団＃６）によりさらなるデータを得た。
従って、集団全体は３８０９人の患者を含んでいた。
導出集団
導出集団はＣＨＣを有する１０１２人の患者を含んでいた［４］。従って個々の患者データは、研究設計、患者動員、血液マーカー判定および専門の病理学者による肝組織像解釈のために独立した５つのセンターから入手可能であった。
検証集団
診断集団−検証集団＃１は慢性肝炎Ｃ（ＣＨＣ）を有する６４１人の患者を含んでいた［５、６］。慢性肝炎Ｂ（ＣＨＢ）のための検証集団＃２は、以前に公開されたデータベースから抽出し［７］、全員が慢性肝炎（３０．４％がＨＢｅＡｇ陽性）を有する１５２人の患者を含み、ＨＢｓＡｇの不活性キャリアを除外した。検証集団＃３は、もし抗ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）および抗ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）抗体ならびに血清中にＨＣＶ ＲＮＡを有していれば１９９７年４月から２００７年８月まで前向き研究に含められた、ＣＨＣおよび（ＨＩＶ）感染を有する４４４人の患者を含んでいた［８］。集団＃４は、２００２年１月から２０１３年３月までアンジェ大学病院での研究および２００５年９月から２０１１年７月までペサック大学病院での研究に連続的に含められた、生検により確定診断された非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する２２５人の患者からなっていた。ＮＡＦＬＤは、同時の脂肪症誘発性薬物（コルチコステロイド、タモキシフェン、アミオダロンまたはメトトレキサートなど）、過剰なアルコール摂取（男性では２１０ｇ／週超または女性では１４０ｇ／週超）、慢性肝炎ＢもしくはＣ感染および他の同時の慢性肝疾患（ＣＬＤ）の組織学的証拠の排除後に肝生検において肝臓脂肪症として定めた。肝硬変合併症（腹水、静脈瘤出血、全身感染または肝細胞癌）を有していた場合には患者を除外した。集団＃５は以前に公開された研究で使用されたデータベースから抽出したアルコール性肝疾患（ＡＬＤ）を有する１１５人の患者を含んでいた［９］。集団＃６は、異なる慢性肝疾患（ＣＬＤ）病因、すなわちＣＨＣ：４１．３％、ＮＡＦＬＤ：３１．３％、単なるアルコール性肝疾患（ＡＬＤ）：８．１％または混合型：１１．７％、ＣＨＢ：５．７％、重感染（ＨＩＶ／ＣＨＣ、ＨＩＶ／ＣＨＢ、ＣＨＢ／ＶＨＤ、その他）：１．２％、先の病因の他の組み合わせ：０．７％を有する１２２０人の患者を含んでいた。これらの患者は２０１１年から２０１６年までアンジェおよびペサックセンターにおける研究に連続的に含められ、血液検査とＶＣＴＥとが一致しない場合には肝生検がより頻繁に指示されるより最近の臨床業務集団の代表である。従って、この集団は別々に検討した。
診断方法
組織学的評価
１．４〜１．６ｍｍの直径の針を用いるＭｅｎｇｈｉｎｉの技術を用いて肝生検を行った。生検標本をホルマリン−アルコール−酢酸溶液に固定してパラフィンで包埋し、次いで５μｍ厚の切片に切断し、ヘマトキシリン−エオシン−サフランで染色した。アンジェおよびＦｉｂｒｏｓｔａｒ研究（検証集団＃１の一部）において不一致の場合には［１１］、コンセンサスリーディングによる２人の上級専門家と他のセンターの上級専門家とによって、Ｍｅｔａｖｉｒ線維症（Ｆ）ステージに従って肝線維症を評価した［１０］。これらの肝臓標本の所見は非侵襲的検査による肝線維症評価のための基準として機能した。
ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの変数
生物学的マーカーは、慢性ウイルス肝炎において異なる病変を診断するために行われる血液検査で以前に使用されたものであった［９、１２］。以下の生物学的マーカー：血小板、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ヒアルロン酸、尿素、プロトロンビン指数、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇで使用されるα２−マクログロブリン［４、９］＋ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇで使用されるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）［１２］および肝臓の活性を標的にするＩｎｆｌａＭｅｔｅｒ［１３］で使用されるアラニンアミノトランスフェラーゼを含めた。臨床マーカー（ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇで使用される年齢および性別）も含めた。従って、１０個の変数が利用可能であった。ヒアルロン酸を含めるか（ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇの場合のような第２世代）、含めずに（ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇの場合のような第３世代）、新しい検査を構築した。新しい検査との比較のための参照血液検査は、有意な線維症（Ｆ≧２）を標的にするＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２ＧまたはＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇおよび肝硬変を標的にするＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２ＧまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇであり、これらは以前に計算された分類によるものである［１４、１５］。
非侵襲的検査
計１９個の変数（４つの臨床マーカーおよび１５個の生物学的マーカー）を、１７個の検査（１４個の血液検査、１つの弾性率測定法技術および２つの組み合わせ検査）で使用した。１１個の検査をＣＨＣ集団において構築し、かつ５つの検査を他のＣＬＤ原因集団において構築した（ＮＡＦＬＤにおいて２つ、ＡＬＤ、ＣＨＢまたはＨＩＶ−ＨＣＶにおいてそれぞれ１つ）。
血液検査−Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ［１６］、Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ［１７］、Ｆｉｂ−４［１８］およびＡＰＲＩ［１９］を公開されているか特許取得されている式に従って計算した。ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ［２０］、ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ［３］、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ［１２］およびＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ［１２］は、ＣＨＣにおけるＭｅｔａｖｉｒ線維症ステージ分類のために構築された。ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ／ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２ＧはＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ／ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇとは異なり、前者に含められるヒアルロン酸が後者においてＧＧＴに置き換えられる。ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒは肝硬変診断のために構築されたものであり、全てのＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒバイオマーカーを含む［３］。ＺｅｎｇスコアはＣＨＢにおいて構築された［２１］。ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＡＬＤ２Ｇ（第２世代）［１３］およびＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＮＡＦＬＤ［２２］はそれぞれＡＬＤおよびＮＡＦＬＤにおけるＭｅｔａｖｉｒ線維症ステージ分類のために構築された。ＮＡＦＬＤ線維症スコアは、ＮＡＦＬＤにおけるＮＡＳＨ−ＣＲＮ（またはＫｌｅｉｎｅｒ）線維症ステージ分類のために構築された［２３］。これらの多くの検査は各病因に特異的な少なくとも１つの検査を提供した。一括管理されたＦｉｂｒｏｓｔａｒ研究（集団＃１の一部）を除く全ての血液アッセイを各センターの同じ研究室で行った。検査結果は補正ルール（例えばエキスパートシステム）を使用せずに生データとして使用した。
肝臓の弾性率測定法−振動制御過渡弾性率測定法すなわちＶＣＴＥ（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎ、Ｅｃｈｏｓｅｎｓ社、パリ、フランス）を、患者データに対して盲検化された経験豊富な（本研究前に５０回を超える検査経験を有する）観察者によって行った。検査条件は製造業者によって推奨されるものであった［２４］。１０個の有効な測定値が記録された場合にＶＣＴＥ検査を止めた。結果（ｋＰａ）は全ての有効な測定値の中央値および四分位数間範囲として表した。
検査の構築
本研究の主目的は、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒファミリーの単標的検査と比較した場合に診断性能における有意な向上を示す複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒを構築することであった。特にこの目的は、肝硬変のＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標および受信者動作特性下面積（ＡＵＲＯＣ）がＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのものよりも有意に高く、かつ肝硬変のＡＵＲＯＣがＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒのものよりも高いか同等である複数標的検査を得ることであった。
本研究の第２の目的は、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒファミリーに属していない他の線維症検査、特にＦｉｂｒｏｔｅｓｔ、Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ、ＺｅｎｇスコアおよびＶＣＴＥ（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎとしても知られている）と比較した場合に向上した診断性能を示す複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒを得ることであった。
複数標的分類子システムの構築は３回の連続した工程で行った。
工程１：単一標的検査の構築−単一検査は、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ検査ファミリーのマーカーに対する二項ロジスティック回帰に一致し、ここでは、前記マーカーは単一のマーカーとして、またはマーカーの比として、あるいはマーカーの算術的組み合わせとして組み合わせられる。これらの検査は、５つのＭｅｔａｖｉｒ Ｆステージによって可能な限り多くの診断標的を用いる従来の二項ロジスティック回帰手法を用いて構築した。これらの標的は、線維症（Ｆ≧１）、有意な線維症（Ｆ≧２）、深刻な線維症（Ｆ≧３）および肝硬変（Ｆ＝４）であった。このようにして４つの単一標的検査を得た。６つのさらなる標的を、２つのカットオフ、例えばそれ以外のステージに対してＦ１またはＦ１＋Ｆ２またはＦ１＋Ｆ２＋Ｆ３を用いる二項標的によって得た。６つのさらなる標的は、Ｆ０＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ２、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ４に対してＦ３、Ｆ０＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１＋Ｆ２、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ４に対してＦ２＋Ｆ３およびＦ０＋Ｆ４に対してＦ１＋Ｆ２＋Ｆ３であった。このようにして全部で１０個の単一標的検査を得ることができた。
工程２：単一標的検査の選択−先の単標的検査を５つのＭｅｔａｖｉｒステージを標的にする段階的な多重線形回帰に含めた。Ｍｅｔａｖｉｒステージを１に正規化する、すなわち４で割って、０と１との間のスコアを得た。この新しいスコアを複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＭＦＭ）と呼んだ。
工程３：複数標的検査の分類−簡単に言うと、先のＭＦＭスコアとＭｅｔａｖｉｒステージとの対応を公開されている方法に従って導出した［２０］。この任意の工程により６つの線維症クラス、すなわち０／１（Ｍｅｔａｖｉｒ Ｆ０／１に対応する）、１／２（Ｆ１／２）、２（Ｆ２±１）、３（Ｆ３±１）、３／４（Ｆ３／４）および４（Ｆ４）を含む分類を得た。
統計
正確性−各検査スコアの診断の正確性は２つの記述子で表した。主な記述子は、集団間の線維症ステージ有病率における差をより良好に考慮し、かつ、このようにして範囲バイアスを限定するためのＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標（ＯＩ）［２５］であった。この指標は、異常な線維症ステージ分類などの順序基準に合わせて構成された多項バージョンのＡＵＲＯＣである。至適基準の結果のＮ（＝５：Ｆ０〜Ｆ４）個のカテゴリおよびＡＵＲＯＣｓｔを用いて、カテゴリ「ｓ」とカテゴリ「ｔ」とを区別する診断検査のＡＵＲＯＣを推測する。ＯＩは、Ｎ個のカテゴリのうちの２つの間の全ての一対比較に対応するＮ（Ｎ−１）／２（＝１０）個の異なるＡＵＲＯＣｓｔの重み付け平均である。さらに、線維症ステージにおける差、すなわちステージ間の差が１である場合に１のペナルティ、その差が２である場合に２のペナルティ．．．に比例するペナルティ関数を用いてＯＩを評価した。肝生検による最も大きな一連のＣＨＣに従って参照有病率を標準化して［２６］、病因間の比較を容易にした。従って、その結果は、非侵襲的検査が異なる線維症ステージを有する２つのランダムに選択された患者を正確にランク付けする確率として解釈することができる。
検査スコアの診断の正確性のための第２の記述子はＡＵＲＯＣ、すなわち二項診断標的のための古典的な指標であった。
分類検査の全体的な正確性は、Ｍｅｔａｖｉｒ Ｆに従って良好に分類された患者の割合によって評価した。
楽観バイアス−その名の通り、楽観バイアスは検査が構築される集団において性能を最大化する。これは、その線維症分類のためのＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ、ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒおよび導出集団におけるＭＦＭおよび検証集団＃１におけるＶＣＴＥに影響を与えた。従って、これらの集団以外で外部検証を行った。
試料サイズの計算−主な集団（導出および検証＃１）のサイズは肝硬変診断のための２つの検査間の有意差を検出するのに必要なサイズであった。０．０５のαリスク、０．０５のβリスク、０．１２の肝硬変有病率、０．８２のＡＵＲＯＣ相関および両側性検査の場合、肝硬変のために以下の期待されるＡＵＲＯＣ値、すなわち第１の検査：０．９２、第２の検査：０．９０のために必要な試料サイズは６５９人の患者であった［３］。
その他−定量的変数は平均±標準偏差として表した。データはＳＴＡＲＤ［２７］および肝臓ＦｉｂｒｏＳＴＡＲＤ声明［２８］に従って報告し、診断意図基準（ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ ｔｏ ｄｉａｇｎｏｓｅ ｂａｓｉｓ）で分析した。ＳＰＳＳバージョン１８．０（ＩＢＭ社、アーモンク、ニューヨーク、米国）およびＳＡＳ９．２（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、カリー、ノースカロライナ州、米国）を用いて専門の統計学者（ＳＢ、ＧＨ）の管理下で主な統計分析を行った。
結果
集団の特性
研究した集団の主な特性が表２に示されている。
Figure 2019530854
 ＮＡ：該当なし
診断性能
導出集団
性能は全てのこれらの検査のために楽観バイアスにより最適化され、それ以外の検査のために最適化されていないため、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒをこの１０１２人のＣＨＣ集団において単標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのみと比較した。主な診断指標は表３に報告されている（以下を参照）。これらの診断指標は、有意な線維症のためのＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２ＧとＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ（診断標的：有意な線維症）または肝硬変のためのＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ（診断標的：肝硬変）との間で同様であり、特に正確性は有意に異なっていなかった（詳細は示さず）。全ての診断標的のためのＡＵＲＯＣおよびＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標は以下の表４に列挙されている。予期したとおり、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇは全ての診断標的の中でランクが一番であった（表４）。一対比較は主な二項診断標的であるため、肝硬変ＡＵＲＯＣについては以下の表５に詳細が記載されており、Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標は全体的な性能を反映しているいるため、以下の表６に詳細が記載されている。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの肝硬変ＡＵＲＯＣは、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒおよびＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒよりも高かった。この向上はＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒに対しては有意であったがＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒに対しては有意でなかったため、本目的は達せられた。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標は、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（目的は達せられた）およびＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒ（本目的を超える）に対して有意に向上した。
Figure 2019530854
 診断標的ごとの最良の結果は太字で示されている。

Figure 2019530854
 ＡＵＲＯＣ：受信者動作特性下面積。
ａこの導出集団において血液検査の診断カットオフを帰納的に固定した（有意な線維症のための最大のＹｏｕｄｅｎ指数（＝最大の正確性）および肝硬変のための最大の正確性）。
ｂ肝臓標本との一致を反映するカッパ指数（全てがｐ＜０．００１）。
ｃＡＵＲＯＣは診断カットオフとは独立している。

Figure 2019530854
 ＦＭ２Ｇ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＣＭ２Ｇ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＭＦＭ２Ｇ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＦＭ３Ｇ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ、ＣＭ３Ｇ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ、ＭＦＭ３Ｇ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ
有意差は太字で示されている。

Figure 2019530854
 ＦＭ２Ｇ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＣＭ２Ｇ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＭＦＭ２Ｇ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒｖ２Ｇ、ＦＭ３Ｇ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ、ＣＭ３Ｇ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ、ＭＦＭ３Ｇ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ
有意差は太字で示されている。
ＣＨＣ検証集団
Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒをこの６４１人のＣＨＣ集団において１０個の他の単一検査と比較し、ここでは楽観バイアスを排除した（以下の表７）。組み合わせられたＥｌａｓｔｏ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒは楽観バイアスによりこの比較では別個に検討した。ここでも、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２ＧはＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標においてランクが一番であった。
Figure 2019530854
 ＶＣＴＥ：振動制御過渡エラストグラフィ（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎによる）。
ａＮＤ：楽観バイアスが原因で行われなかった。

Figure 2019530854
 ＦＭ２Ｇ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＣＭ２Ｇ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＭＦＭ２Ｇ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＦＭ３Ｇ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ、ＣＭ３Ｇ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＭＦＭ３Ｇ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ、ＦＴ：Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ、ＨＳ：Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ、ＶＣＴＥ：振動制御過渡エラストグラフィ（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎによる）、ＥＦＭ２Ｇ：Ｅｌａｓｔｏ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＥＦＭ３Ｇ：Ｅｌａｓｔｏ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ。有意差は太字で示されている。
ａ楽観バイアス
肝硬変ＡＵＲＯＣのための一対比較は上の表８に詳細に記載されている。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのＡＵＲＯＣは、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒに対して有意に向上し（ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２ＧとＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇとの境界線上の有意性（ｂｏｒｄｅｒｌｉｎｅｓ ｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ））、これは本目的を超えており、導出集団において観察される結果を強固にした。また、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのＡＵＲＯＣは、ＶＣＴＥ以外の全ての他の単一血液検査よりも有意に高かった（Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３ＧとＨｅｐａｓｃｏｒｅとの間を除く）。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒによってもたらされる有意な向上を考慮すると、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２ＧがＦｉｂｒｏｔｅｓｔ（ｐ＜０．００１）またはＨｅｐａｓｃｏｒｅ（ｐ＝０．０２５）に対する有意な優位性という新しい利点を有し、これはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇでは以前に認められなかった事例であることを理解されたい（それぞれｐ＝０．１２８またはｐ＝０．６７１）。この新しい利点はＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇではより際立っていたが、その理由は、その差がＡＰＲＩ、ＦｉｂｒｏｔｅｓｔおよびＺｅｎｇスコアに対して有意になったが、これらの最後の３つの検査の肝硬変のためのＡＵＲＯＣはＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２ＧおよびさらにはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇとは有意に異なっていなかったからである。ＶＣＴＥを検討すると、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇの肝硬変のためのＡＵＲＯＣはＶＣＴＥのＡＵＲＯＣとは有意に異なっていなかったが、後者はＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３ＧまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ３ＧのＡＵＲＯＣよりも有意に高かった。言い換えると、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇはその対応する単標的検査に対するＶＣＴＥの優位性を有していなかった。
Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標のための一対比較は以下の表９に詳細に記載されている。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標はＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒに対して有意に向上した（Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２ＧとＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇとの間を除く）。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標は他の血液検査の全てのＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標よりも有意に高かった。これは、主にＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３ＧとＨｅｐａｓｃｏｒｅとの間での新しい利点であった。ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒの差において全ての単一血液検査に対するＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの有意な優位性の発生も認められたが、ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒが肝硬変診断のためにのみ使用されたため、この向上は臨床的関心が低かった。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒとＶＣＴＥとの比較を検討すると、その差はＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒの場合とは異なって有意でないままであった。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３ＧとＥｌａｓｔｏ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒとの比較を検討すると、Ｅｌａｓｔｏ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒを支持する楽観バイアスにも関わらず、その差はＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３ＧまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇとは対照的に有意にならなかった。言い換えると、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇは対応する単標的血液検査に対するＥｌａｓｔｏ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの優位性を有していなかった。
Figure 2019530854
 ＦＭ２Ｇ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＣＭ２Ｇ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＭＦＭ２Ｇ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＦＭ３Ｇ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ、ＣＭ３Ｇ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＭＦＭ３Ｇ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ、ＦＴ：Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ、ＨＳ：Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ、ＶＣＴＥ：振動制御過渡エラストグラフィ（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎによる）、ＥＦＭ２Ｇ：Ｅｌａｓｔｏ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＥＦＭ３Ｇ：Ｅｌａｓｔｏ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ。有意差は太字で示されている。
ａ楽観バイアス
非ＣＨＣ検証集団
肝硬変のためのＡＵＲＯＣおよびＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標を、以下の表１０の４つの他の病因について１１〜１７個の線維症検査で比較した。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒは対応する単標的血液検査よりも高いＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標を有していた（ＡＬＤを除く）。大部分の検査において全ての病因間で診断指標において若干のばらつきが認められたが（すなわち、ＣＨＣ検証集団と比較してＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標の有意差は認められなかった、結果は示されていない）、病因を統合して以下の表１１の９３５人の患者からなる非ＣＨＣ集団を得た。
以下の表１２に肝硬変ＡＵＲＯＣのための一対比較が詳細に記載されている。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのＡＵＲＯＣはＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒに対して有意に向上したがＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒに対して向上せず、これは目的に叶っていた。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのＡＵＲＯＣはいくつかの単一血液検査：ＡＰＲＩ、Ｆｉｂ４およびＦｉｂｒｏｔｅｓｔ（ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇを除く）よりも有意に高く、この最後の差はＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇに対するｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇの新しい利点である。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇを検討すると、Ｈｅｐａｓｃｏｒｅと対応するＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇとの間で観察される有意な劣等性が失われて有意でなくなった。
Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標のための一対比較は以下の表１３に詳細に記載されている。Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標はＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒに対して有意に向上した。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標は全ての他の単一血液検査（Ｈｅｐａｓｃｏｒｅを除く）よりも有意に高かった。他の新しい（小さい）利点は、ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒの差におけるＡＰＲＩ、ＦｉｂｒｏｔｅｓｔまたはＺｅｎｇスコアに対するＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇの有意な優位性であった。
３７６人の患者のサブセットにおいてＶＣＴＥを含む３つの検査との比較を行った（以下の表１４）。
Figure 2019530854
 ＶＣＴＥ：振動制御過渡エラストグラフィ（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎによる）
ａ楽観バイアス

Figure 2019530854
Figure 2019530854
 ＦＭ２Ｇ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＣＭ２Ｇ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＭＦＭ２Ｇ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＦＭ３Ｇ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ、ＣＭ３Ｇ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ、ＭＦＭ３Ｇ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ、ＦＴ：Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ、ＨＳ：Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ、ＦＭＡ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＡＬＤ２Ｇ。有意差は太字で示されている。

Figure 2019530854
 ＦＭ２Ｇ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＣＭ２Ｇ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＭＦＭ２Ｇ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＦＭ３Ｇ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ、ＣＭ３Ｇ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ、ＭＦＭ３Ｇ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ、ＦＴ：Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ、ＨＳ：Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ、ＦＭＡ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＡＬＤ２Ｇ。有意差は太字で示されている。

Figure 2019530854
組み合わせられた検証集団＃１〜＃６（１７４６人の患者）においてＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒとＶＣＴＥとの比較も行った。有意な線維症（Ｆ≧２）および肝硬変（Ｆ＝４）のためのＡＵＲＯＣ、Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標および正確に分類された患者の割合を比較した。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇは、Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標（ＯＩ＝０．７７７）および正確に分類された患者の割合（８３％）の点で最良の結果を示した。ＶＣＴＥは、０．７５５のＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標および８０％の正確に分類された患者の割合を示した。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇも、Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標（ＯＩ＝０．７５９）および正確に分類された患者の割合（８２．７％）の点でＶＣＴＥよりも良好な結果を示した。有意な線維症（Ｆ≧２）のためのＡＵＲＯＣはＭＦＭＶ２Ｇの０．８１７およびＭＦＭＶ３Ｇの０．８０４に対してＶＣＴＥでは０．７８６であった。肝硬変（Ｆ＝４）のためのＡＵＲＯＣは、ＭＦＭＶ２Ｇ（０．８８５）またはＭＦＭＶ３Ｇ（０．８６０）とＶＣＴＥ（０．８９８）との間で同等であった。
集団全体
以下の表１５に示すように、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒファミリー内での統計学的比較において楽観バイアスが存在しなかったので、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの診断性能も集団全体（３８０９人の患者）において評価した。ＭＦＭＶ２Ｇは、有意な線維症のためのＡＵＲＯＣ、深刻な線維症のためのＡＵＲＯＣ、肝硬変のためのＡＵＲＯＣおよびＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標の点で最良の結果を示した。ＭＦＭＶ２Ｇも非常に高い正確に分類された患者の割合を示したが、それはＭＦＭＶ３Ｇに次いで二番目にすぎなかった。
Figure 2019530854
 診断標的ごとの最良の結果は太字で示されている。
線維症ステージ分類
ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ［２０］、ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒ［１５］およびＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの分類は、Ｍｅｔａｖｉｒステージ分類を反映する６〜７つの線維症クラスを含んでいた。Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのために開発された新しいクラスは、Ｆ０／１、Ｆ１／２、Ｆ２±１、Ｆ３±１、Ｆ３／４およびＦ４であった。正確に分類された患者の割合は、３つの集団すなわち導出集団（１０１２人のＣＨＣ患者）、検証集団＃１（６７６人のＣＨＣ患者）および組み合わせられた検証集団＃２〜＃５（９３６人の非ＣＨＣ患者）の関数として６つの検査で同じ順位でランクした（以下の表１６）。これらの割合は、３つの集団において対応するＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２／３ＧまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２／３Ｇに対してＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒにおいて有意に高かった（ｐ＜０．００１）。これらの割合は両方のＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２／３Ｇの間で有意に異なっていなかった。
図４に示すように、集団全体（３８０９人の患者）において同様の結果を得、この際に正確に分類された患者の割合は対応するＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２／３ＧまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２／３Ｇに対してＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒにおいて有意に高かった（ｐ＜０．００１）が、両方のＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２／３Ｇ間で有意に異なっていなかった。
Figure 2019530854
 診断標的ごとの最良の結果は太字で示されている。
ａこれらの６つの検査によりコア集団よりも多くの患者が利用可能であった
ｂ対応のあるウィルコクソン検定によって対応するＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒｖ２／３ＧまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒｖ２／３Ｇに対してｐ＜０．００１
ｃ対応のあるウィルコクソン検定によってＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒｖ２Ｇに対して：ＣＨＣ導出集団ではｐ＝０．４４３、ＣＨＣ検証集団ではｐ＝０．４３９、非ＣＨＣ検証集団ではｐ＝１
ｄ対応のあるコクラン検定による
複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＭＦＭｓ）の利点
本研究の主目的は、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒファミリーの単標的検査と比較した場合に診断性能における有意な向上を示す複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒを構築することであった。このようにして、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒとＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒとの間の正確性を５つの判断基準：１）ＭＦＭの肝硬変のためのＡＵＲＯＣがＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのＡＵＲＯＣよりも高いか否か、２）ＭＦＭのＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標がＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標よりも高いか否か、３）ＭＦＭの有意な線維症のためのＡＵＲＯＣがＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのＡＵＲＯＣと同じまたは高いか否か、４）ＭＦＭの正確に分類された患者の割合（「分類メトリック」ともいう）がＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒのその割合よりも高いか否か、および５）ＭＦＭの肝硬変のためのＡＵＲＯＣがＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒのＡＵＲＯＣと同じまたは高いか否かの評価により比較する。
本研究の第２の目的は、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒファミリーに属していない他の線維症検査、特にＦｉｂｒｏｔｅｓｔ、Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ、ＺｅｎｇスコアおよびＶＣＴＥと比較した場合に向上した診断性能を示す、主目的のために得られるような複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒを構築することであった。このようにして、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒと前記線維症検査との間の正確性を３つ、場合によっては４つの判断基準：１）ＭＦＭの肝硬変のためのＡＵＲＯＣがＦｉｂｒｏｔｅｓｔ、ＨｅｐａｓｃｏｒｅおよびＺｅｎｇスコアのＡＵＲＯＣよりも高いか否か、およびＶＣＴＥのＡＵＲＯＣと同等であるか否か、２）ＭＦＭのＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標が他の線維症検査のＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標よりも高いか否か、３）ＭＦＭの有意な線維症のためのＡＵＲＯＣが他の線維症検査のＡＵＲＯＣよりも高いか否か、および４）ＭＦＭの正確に分類された患者の割合（「分類メトリック」ともいう）がＦｉｂｒｏｔｅｓｔおよびＶＣＴＥのその割合よりも高いか否かの評価により比較した。
以下の表１７は、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒファミリーの単標的検査との比較ならびにＦｉｂｒｏｔｅｓｔ、Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ、ＺｅｎｇスコアおよびＶＣＴＥとの比較により上記のように評価した場合のＭＦＭＶ２ＧおよびＭＦＭＶ３Ｇの両方の診断性能の要約を示す。
Figure 2019530854
 ＶＣＴＥ：振動制御過渡エラストグラフィ（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎによる）、Ｆ：線維症。太字で示されている結果は有意差を示す。イタリックで示されている結果は、同じ検査と比較されるＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒと比較して、比較した検査に対するＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの統計学的利点を示す。
ａ比較において楽観バイアスを回避するために組み合わせられた集団：主目的のための集団全体（３８０９人の患者）および副次的目的のための集団＃１〜＃６の組み合わせ（Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ：１４６１人の患者およびＶＣＴＥ：１７４６人の患者を除く２７９６人の患者）。
「はい」および「いいえ」は以下の精度により判定基準に達したか否かを示す
ｂ境界線上の有意性
ｃＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの有意でない高い値
ｄＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの有意な低い値
主目的は達成され、ＭＦＭＶ２ＧおよびＭＦＭＶ３Ｇはどちらも対応するＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒと比較した場合に診断性能における有意な向上を示す。従って、５つの判断基準の全てがＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒによって確実に満たされた。特に、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの肝硬変のためのＡＵＲＯＣは、対応するＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒと比較した場合に有意に増加した。なお、肝硬変診断では、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（他の血液検査のような）は標的診断が何であろうと使用される古典的な検査であるため、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの最も関連する比較対象はＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒでありＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒではない。言い換えると、本目的はＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒがＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒの肝硬変のための診断性能をＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒに追加することであった。Ｍｅｔａｖｉｒ線維症ステージの識別を検討すると、Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標によって評価されるＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの性能はＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒと比較して有意に向上した。Ｍｅｔａｖｉｒステージを反映する線維症分類、すなわち正確に分類された患者の割合に関しては、Ｍｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒはＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒよりも有意に高い正確性を有していた。
副次的目的に関しては、判断基準は他の線維症検査と比較した場合にＭＦＭＶ２Ｇによって全てが確実に満たされ、ＭＦＭＶ３Ｇによって部分的にのみ満たされた。なお、肝硬変の非侵襲的診断のための通常の基準はＶＣＴＥである。その結果からＶＣＴＥおよびＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇの肝硬変のためのＡＵＲＯＣが同等であることが分かった。有意な線維症のためのＡＵＲＯＣおよびＯｂｕｃｈｏｗｓｋｉ指標はＭｕｌｔｉ−ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇにおいて有意に増加した。この最後の結果は正確に分類された患者の割合によって確認された。
結論として、複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒを使用することにより、特に肝臓病変の根本的原因が慢性肝炎Ｃである場合に古典的な単一標的血液検査またはＶＣＴＥ（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎとしても知られている）と比較して線維症ステージ分類の正確性が有意に向上した。肝硬変診断では、複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒは通常は肝硬変の非侵襲的診断のための基準としてみなされるＶＣＴＥにさらに一致している。
従って、単一の非侵襲的検査である複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの使用により、有意な線維症または肝硬変のいずれかを正確に診断することが今では可能である。従って、複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒは肝硬変を含む線維症の存在および重症度の正確な診断のための独特な非侵襲的検査を提供する。
重要なことに、本診断方法、すなわち複数標的診断検査の構築は、半定量的（順序）基準、例えば放射線学における重症度スコアに基づくあらゆる非侵襲的診断検査に適用することができる。
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［８］Ｃａｌｅｓ Ｐ，Ｈａｌｆｏｎ Ｐ，Ｂａｔｉｓｓｅ Ｄ，Ｃａｒｒａｔ Ｆ，Ｐｅｒｒｅ Ｐ，Ｐｅｎａｒａｎｄａ Ｇら．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｂｌｏｏｄ ｔｅｓｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ＨＣＶ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｓｔｓ ｉｎ ＨＩＶ／ＨＣＶ ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＨＩＶ／ＨＣＶ同時感染における新しい特異的検査によるＨＣＶのために開発された肝線維症血液検査の比較）Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０１０；５２：２３８−２４４．
［９］Ｃａｌｅｓ Ｐ，Ｏｂｅｒｔｉ Ｆ，Ｍｉｃｈａｌａｋ Ｓ，Ｈｕｂｅｒｔ−Ｆｏｕｃｈａｒｄ Ｉ，Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ ＭＣ，Ｋｏｎａｔｅ Ａら．Ａ ｎｏｖｅｌ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ（肝線維症の程度を評価するための血液マーカーの新規なパネル）．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００５；４２：１３７３−１３８１．
［１０］Ｉｎｔｒａｏｂｓｅｒｖｅｒ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｏｂｓｅｒｖｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｂｉｏｐｓｙ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ（慢性肝炎Ｃを有する患者における肝生検解釈における観察者内および観察者間のばらつき）．Ｔｈｅ Ｆｒｅｎｃｈ ＭＥＴＡＶＩＲ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ（フランスのＭＥＴＡＶＩＲ共同研究グループ）．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９４；２０：１５−２０．
［１１］Ｚａｒｓｋｉ ＪＰ，Ｓｔｕｒｍ Ｎ，Ｇｕｅｃｈｏｔ Ｊ，Ｐａｒｉｓ Ａ，Ｚａｆｒａｎｉ ＥＳ，Ａｓｓｅｌａｈ Ｔら．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎｉｎｅ ｂｌｏｏｄ ｔｅｓｔｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ（慢性肝炎Ｃにおける９つの血液検査と肝線維症のための過渡エラストグラフィとの比較）：Ｔｈｅ ＡＮＲＳ ＨＣＥＰ−２３ ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０１２；５６：５５−６２．
［１２］Ｃａｌｅｓ Ｐ，Ｂｏｕｒｓｉｅｒ Ｊ，Ｂｅｒｔｒａｉｓ Ｓ，Ｏｂｅｒｔｉ Ｆ，Ｇａｌｌｏｉｓ Ｙ，Ｆｏｕｃｈａｒｄ−Ｈｕｂｅｒｔ Ｉら．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ（肝線維症および肝硬変のための血液検査の最適化およびロバスト性）．Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０１０；４３：１３１５−１３２２．
［１３］Ｃａｌｅｓ Ｐ，Ｂｏｕｒｓｉｅｒ Ｊ，Ｏｂｅｒｔｉ Ｆ，Ｈｕｂｅｒｔ Ｉ，Ｇａｌｌｏｉｓ Ｙ，Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ ＭＣら．ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ：ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ（ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ：肝線維症のための血液検査ファミリー）．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ ２００８；３２：４０−５１．
［１４］Ｂｏｕｒｓｉｅｒ Ｊ，Ｂｅｒｔｒａｉｓ Ｓ，Ｏｂｅｒｔｉ Ｆ，Ｇａｌｌｏｉｓ Ｙ，Ｆｏｕｃｈａｒｄ−Ｈｕｂｅｒｔ Ｉ，Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ ＭＣら．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｄｅｇｒｅｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｌｉｖｅｒ ｂｉｏｐｓｙ ａｎｄ ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｔｅｓｔｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ（慢性肝炎Ｃにおける肝生検および非侵襲的検査による線維症の程度の分類の正確性の比較）．ＢＭＣ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０１１；１１：１３２．
［１５］Ｃａｌｅｓ Ｐ，Ｂｏｕｒｓｉｅｒ Ｊ，Ｏｂｅｒｔｉ Ｆ，Ｂａｒｄｏｕ Ｄ，Ｚａｒｓｋｉ ＪＰ，ｄｅ Ｌｅｄｉｎｇｈｅｎ Ｖ．Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｓｔａｇｉｎｇ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｙ Ｖｅｒｓｕｓ Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ Ｂｌｏｏｄ Ｔｅｓｔ（肝硬変診断および肝線維症ステージ分類：肝硬変血液検査に対する過渡弾性率測定法）．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０１５；４９：５１２−５１９．
［１６］Ｃａｓｔｅｒａ Ｌ，Ｖｅｒｇｎｉｏｌ Ｊ，Ｆｏｕｃｈｅｒ Ｊ，Ｌｅ Ｂａｉｌ Ｂ，Ｃｈａｎｔｅｌｏｕｐ Ｅ，Ｈａａｓｅｒ Ｍら．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ，ＡＰＲＩ，ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｂｉｏｐｓｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ（慢性肝炎Ｃにおける線維症の評価のための過渡エラストグラフィ、Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ、ＡＰＲＩおよび肝生検の前向き比較）．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００５；１２８：３４３−３５０．
［１７］Ａｄａｍｓ ＬＡ，Ｂｕｌｓａｒａ Ｍ，Ｒｏｓｓｉ Ｅ，ＤｅＢｏｅｒ Ｂ，Ｓｐｅｅｒｓ Ｄ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｊら．Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ：ａｎ ａｃｃｕｒａｔｅ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ：慢性肝炎Ｃ感染における肝線維症の正確かつ有効な予測判断材料）．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００５；５１：１８６７−１８７３．
［１８］Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＲＫ，Ｌｉｓｓｅｎ Ｅ，Ｃｌｕｍｅｃｋ Ｎ，Ｓｏｌａ Ｒ，Ｃｏｒｒｅａ ＭＣ，Ｍｏｎｔａｎｅｒ Ｊら．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＩＶ／ＨＣＶ ｃｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＨＩＶ／ＨＣＶ同時感染を有する患者における有意な線維症を予測するための単純な非侵襲的指標の開発）．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００６；４３：１３１７−１３２５．
［１９］Ｗａｉ ＣＴ，Ｇｒｅｅｎｓｏｎ ＪＫ，Ｆｏｎｔａｎａ ＲＪ，Ｋａｌｂｆｌｅｉｓｃｈ ＪＤ，Ｍａｒｒｅｒｏ ＪＡ，Ｃｏｎｊｅｅｖａｒａｍ ＨＳら．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｃａｎ ｐｒｅｄｉｃｔ ｂｏｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ（単純な非侵襲的指標は慢性肝炎Ｃを有する患者において有意な線維症および肝硬変の両方を予測するすることができる）．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００３；３８：５１８−５２６．
［２０］Ｌｅｒｏｙ Ｖ，Ｈａｌｆｏｎ Ｐ，Ｂａｃｑ Ｙ，Ｂｏｕｒｓｉｅｒ Ｊ，Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ ＭＣ，Ｂｏｕｒｌｉｅｒｅ Ｍら．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｃｃｕｒａｃｙ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ ｏｆ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｂｌｏｏｄ ｔｅｓｔｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ：ａ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｄａｔａ（慢性肝炎Ｃにおける線維症血液検査の診断の正確性、再現性およびロバスト性：個々のデータによるメタ分析）．Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００８；４１：１３６８−１３７６．
［２１］Ｚｅｎｇ ＭＤ，Ｌｕ ＬＧ，Ｍａｏ ＹＭ，Ｑｉｕ ＤＫ，Ｌｉ ＪＱ，Ｗａｎ ＭＢら． Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ＨＢｅＡｇ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｂｙ ａ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｍｏｄｅｌ（非侵襲的モデルによる慢性肝炎Ｂを有するＨＢｅＡｇ陽性患者における有意な線維症の予測）．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００５；４２：１４３７−１４４５．
［２２］Ｃａｌｅｓ Ｐ，Ｌａｉｎｅ Ｆ，Ｂｏｕｒｓｉｅｒ Ｊ，Ｄｅｕｇｎｉｅｒ Ｙ，Ｍｏａｌ Ｖ，Ｏｂｅｒｔｉ Ｆら．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｒ ｎｏｔ ｔｏ ＮＡＦＬＤ（ＮＡＦＬＤに特異的または非特異的な肝線維症のための血液検査の比較）．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２００９；５０：１６５−１７３．
［２３］Ａｎｇｕｌｏ Ｐ，Ｈｕｉ ＪＭ，Ｍａｒｃｈｅｓｉｎｉ Ｇ，Ｂｕｇｉａｎｅｓｉ Ｅ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｊ，Ｆａｒｒｅｌｌ ＧＣら．Ｔｈｅ ＮＡＦＬＤ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｓｃｏｒｅ：ａ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｔｈａｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＮＡＦＬＤ（ＮＡＦＬＤ線維症スコア：ＮＡＦＬＤを有する患者において肝線維症を特定する非侵襲的システム）．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００７；４５：８４６−８５４．
［２４］Ｃａｓｔｅｒａ Ｌ，Ｆｏｒｎｓ Ｘ，Ａｌｂｅｒｔｉ Ａ．Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ（過渡エラストグラフィを用いる肝線維症の非侵襲的評価）．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２００８；４８：８３５−８４７．
［２５］Ｌａｍｂｅｒｔ Ｊ，Ｈａｌｆｏｎ Ｐ，Ｐｅｎａｒａｎｄａ Ｇ，Ｂｅｄｏｓｓａ Ｐ，Ｃａｃｏｕｂ Ｐ，Ｃａｒｒａｔ Ｆ．Ｈｏｗ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎｄｉｃｅｓ：ｔｈｅ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ＲＯＣ ｃｕｒｖｅ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ（非侵襲的肝線維症指数の診断の正確性を測定する方法：再考されるＲＯＣ曲線下面積）．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００８；５４：１３７２−１３７８．
［２６］Ｔｈｅｉｎ ＨＨ，Ｙｉ Ｑ，Ｄｏｒｅ ＧＪ，Ｋｒａｈｎ ＭＤ．Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ａ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔａ−ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染におけるステージ特異的線維症進行の割合の推定：メタ分析およびメタ回帰）．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００８；４８：４１８−４３１．
［２７］Ｂｏｓｓｕｙｔ ＰＭ，Ｒｅｉｔｓｍａ ＪＢ，Ｂｒｕｎｓ ＤＥ，Ｇａｔｓｏｎｉｓ ＣＡ，Ｇｌａｓｚｉｏｕ ＰＰ，Ｉｒｗｉｇ ＬＭら．Ｔｈｅ ＳＴＡＲＤ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｃｃｕｒａｃｙ：ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ（診断の正確性の研究を報告するためのＳＴＡＲＤ声明：説明および詳細）．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００３；４９：７−１８．
［２８］Ｂｏｕｒｓｉｅｒ Ｊ，ｄｅ Ｌｅｄｉｎｇｈｅｎ Ｖ，Ｐｏｙｎａｒｄ Ｔ，Ｇｕｅｃｈｏｔ Ｊ，Ｃａｒｒａｔ Ｆ，Ｌｅｒｏｙ Ｖら．Ａｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ＳＴＡＲＤ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｃｃｕｒａｃｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｅｓｔｓ：Ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ−ＦｉｂｒｏＳＴＡＲＤ ｓｔａｎｄａｒｄｓ（肝線維症検査に関する診断の正確性の研究を報告するためのＳＴＡＲＤ声明の拡張：Ｌｉｖｅｒ−ＦｉｂｒｏＳＴＡＲＤ基準）．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０１４．
［２９］Ｃａｌｅｓ Ｐ，Ｂｏｕｒｓｉｅｒ Ｊ，Ｄｕｃａｎｃｅｌｌｅ Ａ，Ｏｂｅｒｔｉ Ｆ，Ｈｕｂｅｒｔ Ｉ，Ｈｕｎａｕｌｔ Ｇら．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｓｔａｇｉｎｇ ｂｙ ｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｔｅｓｔ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ（慢性肝炎Ｃにおける弾性率測定法および血液検査による向上した線維症ステージ分類）．Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ ２０１４；３４：９０７−９１７．
［３０］Ｂｏｕｒｓｉｅｒ Ｊ，Ｚａｒｓｋｉ ＪＰ，ｄｅ Ｌｅｄｉｎｇｈｅｎ Ｖ，Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ ＭＣ，Ｓｔｕｒｍ Ｎ，Ｌｅｂａｉｌ Ｂら．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ（過渡エラストグラフィによる肝硬度評価のための信頼性基準の判定）．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１３；５７：１１８２−１１９１．
実施例２：複数標的分類のために構築された複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＭＦＭｃ）
患者および方法
集団
計３９０１人の患者を本研究に含めた。１０１２人の患者（導出集団）からのデータを用いて複数標的診断アルゴリズムを開発し、１３３０人の患者（検証集団＃１、＃２および＃３）において外部検証を行った。この新しい診断システムから得られる線維症分類の予後との関連性も１５５９人の患者からなる前向きコホート（検証集団＃４）において評価した。
導出集団
導出集団は慢性肝炎Ｃ（ＣＨＣ）を有する１０１２人の患者を含んでいた（５）。従って、個々の患者データは、研究設計、患者動員、生物学的マーカー判定および専門の病理学者による肝組織像解釈のために独立した５つのセンターから入手可能であった。
検証集団
診断集団−検証集団＃１はＣＨＣを有する６７６人の患者を含んでいた（６、７）。検証集団＃２は、もし抗ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）および抗ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）抗体ならびに血清中にＨＣＶ ＲＮＡを有していれば１９９７年４月から２００７年８月までの前向き研究に含められたＣＨＣおよびＨＩＶ感染を有する４５０人の患者を含んでいた（８）。慢性肝炎Ｂ（ＣＨＢ）のための検証集団＃３は、以前に公開されたデータベースから抽出し（９）、全員が慢性肝炎（３０．４％のＨＢｅＡｇ陽性）を有する２０４人の患者を含み、ＨＢｓＡｇの不活性キャリアを除外した。
予後集団−２００５年１月から２００９年１２月までアンジェ大学病院の肝臓学部において慢性肝疾患のために受診または入院していた年齢が１８歳以上の全ての対象が、それらの疾患の重症度または病因が何であるかに関わらず（ウイルス肝炎、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、他の原因）、研究コホート（検証集団＃４）への参加を勧められた。次いで、得られた１５５９人の患者を、死亡、肝移植または２０１１年１１月１日まで経過観察した。本研究は施設内倫理委員会によって認可され（ＡＣ−２０１２−１５０７）、全ての患者からインフォームドコンセントを得ていた。
診断方法
組織学的評価
１．４〜１．６ｍｍの直径の針を用いるＭｅｎｇｈｉｎｉの技術を用いて肝生検を行った。生検標本をホルマリン−アルコール−酢酸溶液に固定してパラフィンで包埋し、次いで５μｍ厚の切片に切断し、ヘマトキシリン−エオシン−サフランで染色した。コンセンサスリーディングがアンジェおよびＦｉｂｒｏｓｔａｒ研究（検証集団＃１の一部）において不一致の場合には２人の上級専門家と（１１）、他のセンターにおける上級専門家とによって、Ｍｅｔａｖｉｒ線維症（Ｆ）ステージに従って肝線維症を評価した（１０）。門脈−中隔線維症の領域を中心に検証集団＃１において最近記載されたように（１２）自動化形態計測によって測定した。
ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒの変数
生物学的マーカーは、慢性ウイルス肝炎において異なる病変を診断するために行われる血液検査で以前に使用されたものであった（１３、１４）。以下の生物学的マーカー：血小板、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ヒアルロン酸、尿素、プロトロンビン指数、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇで使用されるα２−マクログロブリン（５、１３）＋γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）（線維症の領域を標的にするＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ３Ｇ（１４）およびＱｕａｎｔｉＭｅｔｅｒＶで使用される（１３））、ビリルビン（ＱｕａｎｔｉＭｅｔｅｒＶで使用される）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）（肝臓の活性を標的にするＩｎｆｌａＭｅｔｅｒで使用される（１５））を含めた。臨床マーカー（ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇで使用されるような年齢および性別）も含めた。従って、ＡＳＴ／ＡＬＴ比の追加により、１２個の変数が利用可能であった。新しい検査との比較のための参照血液検査は、有意な線維症（Ｆ≧２）を標的にするＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇおよび肝硬変を標的にするＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇであり、これらは以前に計算された分類によるものである（図１）（３、４）。
肝臓の弾性率測定法
振動制御過渡弾性率測定法またはＦｉｂｒｏｓｃａｎ（Ｅｃｈｏｓｅｎｓ社、パリ、フランス）を患者データに対して盲検化された経験豊富な（本研究前に５０回を超える検査を行った）観察者によって行った。検査条件は製造業者によって推奨されるものであった（１６）。１０個の有効な測定値が記録された場合にＶＣＴＥ検査を止めた。結果（ｋＰａ）は全ての有効な測定値の中央値および四分位数間範囲として表した。ＶＣＴＥのためにＣＨＣにおいて最近開発された６つのクラスの線維症分類をここでは使用した（図１）（４）。
検査の構築
複数標的分類子システムの構築は、図２に要約されている４回の連続する工程で行った。統計学的詳細は追加の資料に提供されている。
工程１：単一標的検査の構築−これらの検査は、５つのＭｅｔａｖｉｒ Ｆステージによって可能な限り多くの診断標的を用いる従来の二項ロジスティック回帰（ＢＬＲ）手法を用いて構築した。これらの標的は、線維症（Ｆ≧１）、有意な線維症（Ｆ≧２）、深刻な線維症（Ｆ≧３）および肝硬変（Ｆ＝４）であった。このようにして４つの単一標的検査を得て、それぞれをＦＭＦ≧１、ＦＭＦ≧２、ＦＭＦ≧３およびＦＭＦ＝４と呼んだ。
工程２：単一標的検査の選択−有意な線維症は、有意な一元交互作用（ｏｎｅ−ｗａｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）（ｐ＝０．００１）を用いてＦＭＦ≧２検査（ｐ＜０．００１）およびＦＭＦ＝４検査（ｐ＜０．００１）によって独立して予測し、肝硬変はＦＭＦ≧１検査（ｐ＜０．００３）およびＦＭＦ＝４検査（ｐ＝０．０３８）によって独立して診断した。従って、独立した単一標的検査のうち３つを複数標的ステージ分類に関連性があるものとみなした。
工程３：単一標的検査分類−検査スコア（範囲：０〜１）を以前に記載されている分割方法（１７）に従って予測されるＦステージのいくつかのクラスを含む線維症分類に変換した。このようにして、ＦＭＦ≧１、ＦＭＦ≧２およびＦＭＦ＝４検査のための３つの分類を得た。ここでは「クラス」とは、非侵襲的検査による線維症分類（ステージ分類）を指す。
工程４：複数標的検査分類−簡単に言うと、３つの保持された検査分類の最も正確な部分のそれぞれ（図２Ｂ）を漸増的に組み合わせた。これらの３つが組み合わられた部分により６つの線維症クラスを含む分類を得た（図１）。この新しい検査を複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ（ＭＦＭ）と呼んだ。
工程５：この任意の工程は、複数標的検査分類上での従属変数（または診断標的）としてＭｅｔａｖｉｒ基準を用いる多重線形回帰である。得られたスコアは、その回帰を正規化されたＭｅｔａｖｉｒスコアに適用する前またはその回帰正規化をその回帰スコアに適用した後のいずれかに正規化することができる。必要であれば最終的なスコアを、極値（０および１）を結ぶことによって完全に正規化する（範囲０〜１）。
統計
定量的変数は平均±標準偏差として表した。各検査の識別能は、受信者動作特性下面積曲線（ＡＵＲＯＣ）およびＭｅｔａｖｉｒ Ｆに従って良好に分類された患者の割合によって評価される全体的な正確性として表した。分類計算では、検査クラスをそれらの中央値、例えばＦ１／２では１．５と共に使用した。その名の通り、楽観バイアスは検査分類が構築される集団において性能を最大化する。これはＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇおよび導出集団におけるＭＦＭおよび検証集団＃１におけるＶＣＴＥに影響を与えた。データはＳＴＡＲＤ（１８）および肝臓ＦｉｂｒｏＳＴＡＲＤ声明（１９）に従って報告し、診断意図基準で分析した。生存曲線をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ方法によって推定し、ログランク検定を用いて比較した。ＳＰＳＳバージョン１８．０（ＩＢＭ社、アーモンク、ニューヨーク、米国）およびＳＡＳ９．２（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、カリー、ノースカロライナ州、米国）を用いる専門の統計学者（ＳＢ、ＧＨ）の管理下で主な統計分析を行った。
結果
集団の特性
研究した集団の主な特性が以下の表１８に示されている。予後集団では、経過観察の中央値は２．８年（ＩＱＲ：１．７〜３．９）であった。経過観察の間に、２６２人（１６．８％）が死亡し、そのうちの１１５人（７．４％）が肝臓関連であった。
Figure 2019530854
 ＮＡ：該当なし。
ａＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ分類に従う
複数標的検査の特性（導出集団）
検査の正確性
単一標的検査の正確性−以前に公開された検査（ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ）と比較した新しい単一標的検査（ＦＭＦ≧１、ＦＭＦ≧２、ＦＭＦ≧３、ＦＭＦ＝４）の識別能は、以下のように要約することができる。第１に、最も高いＡＵＲＯＣが新しい検査により観察された。第２に、予期したとおり、新しい単一標的検査のそれぞれについて、検査が構築された診断標的において最も高いＡＵＲＯＣが観察された。
線維症分類の正確性−以下の表１９は、導出集団において新しい複数標的検査（ＭＦＭ：９２．７％、ｐ＜０．００１）と比較した、公開されている検査の全体的な線維症分類の正確性（正しい分類率によって評価）を示す（ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ：８７．６％、ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ：８７．５％）。その正確性は全ての検査についてＭｅｔａｖｉｒ Ｆ０においてのみ同程度であった。既に公開されている検査はこのステージにおいて高い正確性を有するので、新しいＭＦＭのためのＭｅｔａｖｉｒ Ｆ１における増加はほんの中程度であった。対照的に、ＭＦＭによりＭｅｔａｖｉｒ Ｆ２および特にＦ３おいて大きな増加が得られ、ＭＦＭはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇと比較して導出集団および検証集団＃１においてそれぞれ１６．３％および２２．８％（ｐ＜０．００１）で正確性を高めた。
ＭＦＭは大部分の線維症クラスにおいて正確性を高め、例えばＦ４クラスではＭＦＭ：９６．０％、ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ：８８．０％、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ：７９．２％であった（以下の表２０に詳細あり）。単一の診断標的のための古典的な診断指標の比較を深刻な線維症についてＭＦＭとＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇとの間で行った（以下の表２１）。全体的な正確性はそれぞれ８３．０％および８０．４％（ｐ＜０．０１０）であった。
Figure 2019530854
 ＭＦＭ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ、ｎ：患者数。太字の数字はステージおよび集団ごとの最も高い正確性を示す。下線が引かれている正確性は以前に公開されたＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ検査と比較してＭＦＭによってもたらされる注目すべき向上を示す。
ａ全ての検査間での対応のあるコクラン検定による
ｂ試料サイズが小さいためにＦステージごとの結果なし

Figure 2019530854
 ＦＭ２Ｇ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＣＭ２Ｇ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＭＦＭ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ、ｎ：患者数、ＤＡ：診断の正確性。太字の数字はクラスおよび集団ごとの最も高い正確性を示す。
ａ試料サイズが小さいために検証集団＃２および＃３における結果なし

Figure 2019530854
 ＰＰＶ：陽性予測値、ＮＰＶ：陰性予測値、ＬＲ：尤度比、ＭＦＭ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ
ａ最大のＹｏｕｄｅｎ指数
ｂすなわちクラスＦ２±１とＦ３±１との間
肝硬変
肝硬変診断−肝硬変は重要な診断標的である。ＭＦＭによる線維症分類を好都合には他の検査、特にＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇと比較した。Ｆ４を含む線維症クラスの肝硬変に対する感度はそれぞれ９３．０％に対して９１．３％であった。Ｆ４クラスの肝硬変の陽性予測値（ＰＰＶ）はそれぞれ８８．０％に対して９６．０％であった。
肝硬変分類−門脈−中隔線維症の面積（中央値（ＩＱＲ））は、Ｍｅｔａｖｉｒステージ分類ではＦ３：２．７％（２．２）、Ｆ４：５．２％（６．５）であり、ＭＦＭクラスではＦ３±１：２．３％（３．９）、Ｆ３／４：３．２％（３．９）、Ｆ４：７．３％（４．３）であった。従って、ＭＦＭは初期肝硬変（Ｆ３／４）と確定的肝硬変（Ｆ４）とを区別することができた。
分類精度および改良点
精度は、Ｍｅｔａｖｉｒ Ｆステージを的確に反映するための線維症検査分類の能力を評価するものである。平均Ｆスコアは検査分類間で１．８４±１．０８から２．１３±０．８４に変動した（ｐ＜０．００１）。これにより分類精度が検査ごとに異なっていたことが分かった。従って、その精度を４つの基準、すなわちＭｅｔａｖｉｒ Ｆステージ分類よる検査分類の一致、差および線形性ならびに検査クラス内でのＭｅｔａｖｉｒ Ｆステージの分散を用いて包括的に評価した。簡単に言うと、ＭＦＭ分類は新しい検査の中で満足な精度基準を有していた（以下の表２２に詳細あり）。
Figure 2019530854
 ＦＭ２Ｇ：ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＣＭ２Ｇ：ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＦＭＦ：単一標的検査、ＭＦＭ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ、ｎ：患者数。非侵襲的検査間の最良の結果が太字で示されている（Ｍｅｔａｖｉｒ Ｆは除外）
ａ血液検査とＭｅｔａｖｉｒとの間のＦスコアのための対応のあるｔ検定
ｂ検査分類とＭｅｔａｖｉｒステージとの間のＦスコアの絶対差（平均±ＳＤ）、すなわち負の差におけるマイナス符号の削除
ｃピアソン相関
ｄ検証集団＃１（６７６人の患者）において得られた結果
但しＭＦＭ分類は、３つのＦステージを含む２つの不正確なクラスを有していた（すなわち大きな分散）。従って、線維症クラスごとに最大２つのＦステージを有する単純化されたＭＦＭ分類を開発した（図１、以下の表２３に詳細あり）。単純化されたＭＦＭ線維症分類は最良の精度基準を有し、特にそれはＭｅｔａｖｉｒステージ分類による平均Ｆスコアにおいて有意差を有しない唯一の検査であった。予期したとおり、単純化されたＭＦＭ線維症分類の全体的な正確性は８０．４％まで低下した（１つのクラス当たり最大３つのＦステージを含む徹底的なＭＦＭ分類における９２．７％（ｐ＜０．００１）に対して）。
複数標的検査の検証
検証集団における分類の正確性
血液検査間の比較−予期したとおり、導出集団と比較してＣＨＣ検証集団＃１では楽観バイアスが存在しないことによりＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ、ＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２ＧおよびＭＦＭの線維症分類において正確性の低下が認められた（−４．０％から−５．０％へ）（表１９）。但し、ＭＦＭの全体的な正確性は、検証集団＃１（ＣＨＣ）、＃２（ＨＩＶ／ＣＨＣ）および＃３（ＣＨＢ）においてＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２ＧまたはＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇの全体的な正確性よりもなお有意に高かった。
ＶＣＴＥとの比較−ＶＣＴＥは集団＃１からの６４７人の患者および集団＃３からの１５２人の患者において利用可能であった。ＭＦＭの正確性はＶＣＴＥの正確性とは有意に異なっていなかった（以下の表２４）。ＶＣＴＥを支持する楽観バイアスにも関わらず、特に肝硬変診断では、他の診断指標はＭＦＭとＶＣＴＥとの間で近かった。例えば集団＃１ではＦ４を含む線維症クラスの肝硬変の感度は、ＭＦＭおよびＶＣＴＥにおいてそれぞれ８６．０％および８１．７％であり、Ｆ４クラスの肝硬変のＰＰＶはそれぞれ８０．０％および７６．７％であった。
線維症クラスの検証
診断集団−ＭＦＭ線維症分類は、他の肝線維症記述子、すなわち組織学的Ｍｅｔａｖｉｒ Ｆ、門脈−中隔線維症の面積、およびＶＣＴＥによって測定される肝硬度との良好な相関により有効であった。さらに重要なことには、これらの肝線維症記述子はＭＦＭ検査の隣接する線維症クラス間で有意に異なっていた。
Figure 2019530854
 ｘは優勢なＭｅｔａｖｉｒ Ｆステージを示す
ａＭＦＭカットオフ（本文の図２Ｂを参照）。ｂ集団全体における全体的な正確性

Figure 2019530854
 ＭＦＭ：複数標的ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ、ＶＣＴＥ：振動制御過渡エラストグラフィ
太字の数字は有意差を示す。
ａ対応のあるＭｃＮｅｍａｒ検定によるＭＦＭに対する比較
ｂ対応のあるＭｃＮｅｍａｒ検定によるＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇに対するＶＣＴＥの比較
予後集団
集団の特性
２００５年１月から２００９年１２月までアンジェ大学病院の肝臓学部において慢性肝疾患のために受診または入院していた年齢が１８歳以上の全ての対象がそれらの疾患の重症度または病因が何であるかに関わらず（ウイルス肝炎、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、他の原因）、研究コホートへの参加を勧められた。次いで、得られた１５５９人の患者を、死亡、肝移植または２０１１年１１月１日まで経過観察した。本研究は施設内倫理委員会によって認可され（ＡＣ−２０１２−１５０７）、全ての患者からインフォームドコンセントを得ていた。
結果
ＭＦＭｃ線維症分類は、肝臓に関連する死亡の予後能力にとって有効であった（ログランク検定によってｐ＜０．００１）。図３は、生存曲線がＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２ＧおよびＭＦＭｃ：Ｆ２±１、Ｆ３±１、Ｆ３／４およびＦ４の４つのクラス間で有意に異なっていたことを示す。Ｆ３／４クラスとＦ４クラスとの生存曲線における差はＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ分類（ｐ＝３．１０−３）における差よりもＭＦＭｃ分類（ｐ＝３．１０−４）においてより顕著であった。最後に、単純化されたＭＦＭｃ分類は肝臓に関連する死亡のための良好な予後値（ログランク検定によってｐ＜０．００１）により有効であった。さらに、Ｆ３／４クラスとＦ４クラスとの識別は、徹底的なＭＦＭｃ分類（ｐ＝３．１０−４）（図３Ｂ）と比較して単純化されたＭＦＭｃ分類（ｐ＝１０−８）（図３Ｃ）においてより良好であった。
ＭＦＭｃ分類は、特に４つの線維症クラス：Ｆ２±１、Ｆ３±１、Ｆ３／４およびＦ４間での良好な予後識別を提供した。Ｆ３／４クラスとＦ４クラスとの予後識別はＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇ（図３）と比較して向上した。最近になってＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒＶ２ＧとＣｉｒｒｈｏＭｅｔｅｒＶ２Ｇとの組み合わせが別のコホートにおける予後診断では相乗的であることが分かっており（２０）、その研究では、本研究と同様に有意な線維症または肝硬変を標的にする検査間で有意な相互作用が存在した。１つのクラス当たり最大２つのＦステージを有する単純化された分類を開発し、これにより予後判定および精度が向上した。
これらの結果は単純化された分類または徹底的な分類のどちらを使用すべきかという問題を提起する。徹底的な分類（１つのクラス当たり最大３つのＦ）は、単純化された分類（１つのクラス当たり最大２つのＦ）と比較してより良好な正確性という明白な利点を有する。但し、後者はより良好な精度および予後判定を提供する。従って、単純化された分類は臨床業務のために十分であるように思われる。徹底的な分類の関心の欠如は、組織学的病期分類による誤分類源（試料サイズおよび観察者の読取り）に起因し得る。これは組織学的病期分類よりも非侵襲的検査によるより良好な予後判定によって強固にされる（２１）。最後に、予後判定はＦ２±１またはさらにＦ２／３クラスによってのみ有意に変化し、従って最小分類は、４つのクラス：Ｆ０／１（有意でない線維症）、Ｆ２／３（有意な線維症）、Ｆ３／４（初期の肝硬変）およびＦ４（確定的な肝硬変）に分けることができる。
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実施例３：ＭＦＭｃにおける複数標的分類の構築
本目的は、３つの保持された検査分類の最も正確な部分を選択して組み合わせることである（図１）。その原理は以下のとおりであった。正確に分類された患者の割合（すなわち正確性）を２つの隣接する保持された単一標的検査間で比較した。保持された線維症クラスの限界を対応する検査スコアの限界によって決定した。この目的は最良のカットオフを見つけて２つの検査を含む全体的な正確性を最大化することであった。なお、スコア（カットオフの判定のため）または分類（正確性の判定のため）のいずれかで表される３つの検査を使用した。第２に、２つの検査分類、すなわちＦＭＦ≧１／ＦＭＦ≧２分類（中間分類）およびＦＭＦ≧１／ＦＭＦ≧２／ＦＭＦ＝４（最終的な分類）を生成した。
実際には、この分析は最初に初期Ｆステージで開始した（図２Ａ）。従って、正確性は、ＦＭＦ≧１スコアのカットオフ未満であるＦＭＦ≧１分類およびこのカットオフを超えるＦＭＦ≧２分類によって正確に分類された患者の合計であった。この計算を低いスコア値から高いスコア値まで繰り返してＦＭＦ≧１スコアの増加値の中で最良のカットオフを見つけて全体的な正確性を最大化した（表２５）。「全体的な正確性」は２つの正確性の合計を意味する。
次いで、同じ計算を繰り返してＦＭＦ≧２スコアの最良のカットオフを決定した（表２、図２Ａ）。このようにして、第１または第２のＦＭＦ検査のいずれかによって決定されたカットオフにより２つが組み合わせられた分類を得た（表２５および表２６）。２つが組み合わせられた分類間での選択は、主に得られた最大の全体的な正確性および次いでＦＭＦ＝４検査を含む次の計算のために第２の検査（ＦＭＦ≧２）と共に利用可能な残りの最大の集団サイズによって決定した。このようにして、本発明者らは０．２７のＦＭＦ≧２スコアによって決定されたカットオフを有する組み合わせられたＦＭＦ≧１／ＦＭＦ≧２分類を得た（表２６）。
次いで、同じ計算を繰り返してＦＭＦ≧１／ＦＭＦ≧２分類をＦＭＦ＝４分類と比較した（表２７および表２８、図２Ｂ）。最良の組み合わせられたＦＭＦ≧１／ＦＭＦ≧２／ＦＭＦ＝４分類は最終的に、このカットオフ未満のＦＭＦ≧１／ＦＭＦ≧２およびこのカットオフを超えるＦＭＦ＝４という分類を用いることによって０．０８５のＦＭＦ４スコアカットオフの組み込みにより決定した（表２８）。この最後の選択はＦ４ステージの最良の識別によって決定した。
含められた３つのスコアと保持されたそれらの３つのそれぞれの部分との関係が図３に示されている。これらの３つが組み合わせられた部分により、線維症クラスごとのより小さい線維症ステージを含む単純化されたバージョンによる６つの線維症クラスを含むＭＦＭｃ分類が得られた（図４）。図５は、二重標的ＦＭＦ≧１／ＦＭＦ≧２検査のいくつかの線維症クラスを単一標的検査の２つの異なる分類によって提供することができたことを示す。言い換えると、最終的な６つのクラス分類は、同じ単一標的分類に属する線維症クラスの単純な並置ではなかった。
Figure 2019530854
 ａＦＭＦ≧１カットオフ未満の正確に分類された患者（％）。
ｂＦＭＦ≧１カットオフを超える正確に分類された患者（％）。
ｃＦＭＦ≧１によるＦＭＦ≧１カットオフ未満の正確に分類された患者（％）の合計＋ＦＭＦ≧１カットオフを超えるＦＭＦ≧２によって正確に分類された患者（％）。
ｄカットオフの選択肢を決定する最大の割合。

Figure 2019530854
 ａＦＭＦ≧２カットオフ未満の正確に分類された患者（％）。
ｂＦＭＦ≧２カットオフを超える正確に分類された患者（％）。
ｃＦＭＦ≧１によるＦＭＦ≧２カットオフ未満の正確に分類された患者（％）＋ＦＭＦ≧２カットオフを超えるＦＭＦ≧２によって正確に分類された患者（％）の合計。
ｄカットオフの選択肢を決定する最大の割合。

Figure 2019530854
 ａＦＭＦ≧２カットオフ未満の正確に分類された患者（％）。
ｂＦＭＦ≧２カットオフを超える正確に分類された患者（％）。
ｃＦＭＦ≧１／ＦＭＦ≧２によるＦＭＦ≧２カットオフ未満の正確に分類された患者（％）＋ＦＭＦ≧２カットオフを超えるＦＭＦ＝４によって正確に分類された患者（％）の合計。
ｄカットオフの選択肢を決定する最大の割合。

Figure 2019530854
 ａＦＭＦ＝４カットオフ未満の正確に分類された患者（％）。
ｂＦＭＦ＝４カットオフを超える正確に分類された患者（％）。
ｃＦＭＦ≧１／ＦＭＦ≧２によるＦＭＦ＝４カットオフ未満の正確に分類された患者（％）＋ＦＭＦ＝４カットオフを超えるＦＭＦ＝４によって正確に分類された患者（％）の合計。
ｄカットオフの選択肢を決定する最大の割合。

Claims (16)

  1. １）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、前記二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
    ２）工程１）で得られた前記少なくとも３つのスコアを多重線形回帰において組み合わせて対象における肝臓病変の存在および重症度を評価するのに有用な新しい複数標的スコアを得る工程と、
    ３）任意に、工程２）で得られた前記複数標的スコアを肝臓病変ステージまたはグレードの分類においてソートし、それにより対象の複数標的スコアに基づいて対象がどの肝臓病変ステージまたはグレードに属するかを判定する工程と
    を含む、対象における肝臓病変の存在および重症度を評価するための非侵襲的方法。
  2. １）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、前記二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
    １ａ）工程１）で得られた前記少なくとも３つのスコアを含む少なくとも別の二項ロジスティック回帰を行い、前記二項ロジスティック回帰の前記診断標的は臨床的に関連する二項標的であり、それにより、前記工程１）の二項ロジスティック回帰によって得られたもののうち前記有意な単一標的スコアを特定し、前記有意な単一標的スコアは前記臨床的に関連する二項診断標的に独立して関連づけられている工程と、
    １ｂ）工程１ａ）において有意であることが分かった前記単一標的二項ロジスティック回帰のそれぞれのために肝臓病変ステージまたはグレードの分類を導出する工程と、
    １ｃ）工程１ｂ）の分類を組み合わせて肝臓病変ステージまたはグレードの複数標的分類を作成する工程と、
    ２）工程１ａ）で特定された前記有意なスコアを多重線形回帰において組み合わせて単一の複数標的スコアを得、それにより対象における肝臓病変の存在および重症度を評価する工程と
    を含む、請求項１に記載の非侵襲的方法。
  3. 前記方法は、対象における肝硬変を含む肝線維症の存在および重症度を評価するためのものである、請求項１または２に記載の非侵襲的方法。
  4. 前記工程１）は、それぞれがＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４ステージに対応する異なるＭｅｔａｖｉｒ線維症ステージを標的にする４回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の非侵襲的方法。
  5. 前記工程１）は、それぞれがＭｅｔａｖｉｒ線維症ステージＦ≧１（Ｆ０に対してＦ≧１）、Ｆ≧２（Ｆ≦１に対してＦ≧２）、Ｆ≧３（Ｆ≦２に対してＦ≧３）、Ｆ４（Ｆ≦３に対してＦ４）、Ｆ０＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ２およびＦ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ４に対してＦ３に対応する異なる線維症標的を有する７回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の非侵襲的方法。
  6. 前記工程１）は、それぞれがＭｅｔａｖｉｒ線維症ステージＦ＝０に対してＦ≧１、Ｆ≦１に対してＦ≧２、Ｆ≦２に対してＦ≧３、Ｆ≦３に対してＦ＝４、Ｆ０＋Ｆ２＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ２、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ４に対してＦ３、Ｆ０＋Ｆ３＋Ｆ４に対してＦ１＋Ｆ２、Ｆ０＋Ｆ１＋Ｆ４に対してＦ２＋Ｆ３およびＦ０＋Ｆ４に対してＦ１＋Ｆ２＋Ｆ３に対応する異なる線維症標的を有する１０回の二項ロジスティック回帰を行う工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の非侵襲的方法。
  7. 前記工程１）の二項ロジスティック回帰は、バイオマーカー、臨床マーカー、定性的マーカー、物理的診断法によって得られるデータ、線維症検査のスコア、イメージング法によって以前に得られた前記対象の肝臓組織の少なくとも１つの画像の記述子およびそれらの数学的組み合わせから選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの変数に対して行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の非侵襲的方法。
  8. 前記工程１）の二項ロジスティック回帰は、イメージング法によって以前に得られた前記対象の肝臓組織の少なくとも１つの画像の少なくとも２つの記述子に対して行い、前記記述子は、エッジの直線性の割合、線維症の周りの領域の平均の割合（すなわち小結節形成の割合）、肝生検標本の全表面のうち星形線維症の面積、架橋の数、架橋の厚さ、門脈−中隔領域の平均の面積、架橋の周長、門脈−中隔領域間の架橋の比、架橋の中の線維症の面積、類洞周囲線維症のフラクタル次元、臓器、組織またはその断片の周長、門脈−中隔線維症のフラクタル次元、線維症全体の中での類洞周囲線維症の比、臓器、組織またはその断片の長さ、曲折記述子（生来の周長、平滑化された周長および両周長間の比）、線維症のフラクタル次元、総密度の四分位数間範囲、アランチウス管の厚さ、生来の肝臓の平均周長、脾臓全体の平均周長、脾臓表面と肝臓表面との比およびそれらの数学的組み合わせを含む群から選択される、請求項７に記載の非侵襲的方法。
  9. 前記工程１）の二項ロジスティック回帰は、物理的診断法によって得られる少なくとも１つのデータに対して行い、前記物理的診断法は、Ｆｉｂｒｏｓｃａｎとしても知られている振動制御過渡エラストグラフィ（ＶＣＴＥ）、音響放射力インパルス（ＡＲＦＩ）、超音波剪断波イメージング（ＳＳＩ）弾性率測定法およびＭＮＲ／ＭＲＩエラストグラフィから選択されるエラストグラフィ法である、請求項７に記載の非侵襲的方法。
  10. 前記工程１）の二項ロジスティック回帰は、物理的診断法によって得られる少なくとも１つのデータに対して行い、前記物理的診断法は、Ｘ線、超音波検査、コンピュータスキャナ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、機能的磁気共鳴画像法、断層撮影法、コンピュータＸ線体軸断層撮影法、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影法および断面デンシトメトリーから選択される放射線撮影法である、請求項７に記載の非侵襲的方法。
  11. 前記工程１）の二項ロジスティック回帰は、ＡＰＲＩ、ＦＩＢ４、Ｆｉｂｒｏｔｅｓｔ、ＥＬＦスコア、ＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ、Ｆｉｂｒｏｓｐｅｃｔ、Ｈｅｐａｓｃｏｒｅ、ＺｅｎｇスコアおよびＮＡＦＬＤ線維症スコアから選択される線維症検査により得られた線維症検査の少なくとも１つのスコアに対して行い、前記線維症検査は、生物学的マーカーおよび／または臨床マーカーから選択されるマーカーの単純な数学的関数または二項ロジスティック回帰における組み合わせを含む、請求項７に記載の非侵襲的方法。
  12. 前記工程１）の二項ロジスティック回帰は、線維症検査のＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒファミリーおよびそれらの振動制御過渡エラストグラフィ（ＶＣＴＥ）（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎとしても知られている）との組み合わせから選択される線維症検査に対応する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の非侵襲的方法。
  13. 前記工程１）の二項ロジスティック回帰は線形判別分析および多変量解析から選択される別の統計分析と置き換えられる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の非侵襲的方法。
  14. 前記対象は、肝機能障害、慢性肝疾患、肝炎ウイルス感染（特にＢ型、Ｃ型もしくはＤ型肝炎ウイルスによって引き起こされる感染）、肝毒性、肝癌、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、自己免疫疾患、代謝性肝疾患および肝臓の続発性合併症を伴う疾患を含む群から選択される肝臓病に罹患している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の非侵襲的方法。
  15. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実施するマイクロプロセッサ。
  16. １）少なくとも１つの変数に対して少なくとも３回の二項ロジスティック回帰を行い、前記二項ロジスティック回帰は同じ変数に対して行うがそれぞれが異なる単一の診断標的を対象とし、それにより少なくとも３つのスコアを得る工程と、
    ２）工程１）で得られた前記少なくとも３つのスコアを多重線形回帰において組み合わせて新しい複数標的スコアを得る工程と、
    ３）任意に、工程２）で得られた前記複数標的スコアを肝臓病変ステージまたはグレードの分類においてソートし、それにより前記対象における肝臓に関連しない死亡および／または肝臓に関連する死亡を含む死亡または肝臓に関連するイベントのリスクを評価する工程と
    を含む、対象における肝臓に関連しない死亡および／または肝臓に関連する死亡を含む死亡または肝臓に関連するイベント、特に合併症のリスクを評価するための非侵襲的方法。
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